趙 凱，張韻梅，王偉濤，李光興

（云南鑒識(shí)司法鑒定中心，云南 芒市 678400）

自1987 年首次用于刑事案件以來(lái)，對(duì)生物證據(jù)DNA 的分析徹底改變了法醫(yī)調(diào)查技術(shù)。在這三十年中，DNA 分析方法的辨別能力、速度和靈敏度以及分型越來(lái)越具有挑戰(zhàn)性的樣品的能力取得了重大進(jìn)展。通過(guò)建立罪犯和犯罪現(xiàn)場(chǎng)概況以及群體等位基因頻率數(shù)據(jù)庫(kù)，可以從犯罪現(xiàn)場(chǎng)樣本中識(shí)別嫌疑人，并制定評(píng)估DNA 證據(jù)的統(tǒng)計(jì)框架。短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）作為目前人類(lèi)身份個(gè)體識(shí)別最高效的DNA 分子標(biāo)記，廣泛地應(yīng)用于法庭科學(xué)技術(shù)中，因STR 等位基因座在不同群體中存在比較明顯頻率分布差異，對(duì)不同民族人群中進(jìn)行頻率調(diào)查，建立基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，有很重要的意義。

基諾族古稱(chēng)“攸樂(lè)”，在1979 年被確認(rèn)為我國(guó)第56 個(gè)民族[1]，是云南省特有的少數(shù)民族，主要聚居于云南省西雙版納傣族自治州景洪市基諾山基諾族民族鄉(xiāng)，根據(jù)2010 年全國(guó)第六次人口普查，基諾族總?cè)丝跒?.3 萬(wàn)余人?；Z族日常生活中使用基諾語(yǔ)，屬漢藏語(yǔ)系藏緬語(yǔ)族彝語(yǔ)支，基諾族沒(méi)有文字，有與其他彝語(yǔ)支民族相似的創(chuàng)世神話及葫蘆圖騰信仰。在漢文獻(xiàn)中，直到清朝初期才有關(guān)于“攸樂(lè)”人的零星記載。

此調(diào)查為云南省基諾族人群的法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定以及群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

根據(jù)知情同意原則，收集云南省西雙版納傣族自治州景洪市基諾山基諾族民族鄉(xiāng)331 例基諾族無(wú)關(guān)個(gè)體的頰粘膜拭子樣本。

1.2 DNA 提取、擴(kuò)增及檢測(cè)

使用chelex-100 螯合樹(shù)脂（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）熱裂解法提取拭子樣本DNA，使用AGCU 17+1 試劑盒（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），擴(kuò)增體系配制操同產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，總反應(yīng)體系 10 μL，在9700 型PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上進(jìn)行直接復(fù)合擴(kuò)增，95 ℃2 min，94 ℃ 15 s、61 ℃ 40 s、65 ℃ 50 s、30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。取 1 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物與 0.5 μL 內(nèi)標(biāo) LIZ500 和 9.5 μL 去離子甲酰胺混合，3130 基因分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上進(jìn)行全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，用 GeneMapper?ID-X 軟件進(jìn)行等位基因分型。選擇F312（蘇州閱微基因技術(shù)有限公司）為陽(yáng)性質(zhì)控品，純化水為陰性質(zhì)控品。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 Powerstates 軟件[2]對(duì)STR 分型數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算獲得17 個(gè) STR 基因座的等位基因頻率和法醫(yī)學(xué)常用參數(shù)。使用Arlequin 3.5 軟件[3]進(jìn)行基因座間連鎖不平衡檢驗(yàn)（哈溫平衡檢驗(yàn)）。應(yīng)用dispan 軟件計(jì)算基諾族與其他10 個(gè)群體[4-13]，利用MEGA 軟件[14]基于DA distances構(gòu)建鄰接法進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 等位基因頻率分布及群體遺傳學(xué)參數(shù)

本研究在331 名基諾族無(wú)關(guān)個(gè)體共觀察到186 個(gè)等位基因和615 種基因型，等位基因頻率分布在0.001 5～0.561 9（表1）。經(jīng)過(guò)Bonferroni 矯正，基因型分布均符合哈溫平衡（P＞ 0.002 9）。基諾族人群Ho 值分布在0.613 29～0.876 13，Penta E 和FGA 為高多態(tài)性基因座（PIC ＞ 0.85），DP 值在0.770 5～0.968 9，累積個(gè)體識(shí)別率（CDP）達(dá)到0.999 999 999 999 999 999 999 9，PE 值 在0.307 1～0.747 0，三聯(lián)體累積非父排除率（CPE）達(dá)到0.999 999 932，見(jiàn)表2。

表2 基諾族人群17 個(gè) STR 基因座法醫(yī)學(xué)參數(shù)（n=331）Tab.2 Forensic parameters of 17 STR loci in the Jino people（n=331）

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基諾族人群與白族、傣族、納西族等10 個(gè)人群常染色體STR 基因座鄰接法（Neighbor-Joining Algorithm）進(jìn)化樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1，遺傳距離參數(shù)見(jiàn)表3，以云南南北不同地勢(shì)、海拔為界分為兩組，基諾族與聚居在南邊的哈尼族和傣族聚類(lèi)。

圖1 基于DA distances 構(gòu)建鄰接法進(jìn)化樹(shù)。Fig.1 Neighbor-Joining tree based on DA distances.

表3 基諾族人群與白族、傣族、納西族等10 個(gè)人群 Standard genetic distances（左下）和Standard error（右上）Tab.3 Standard genetic distances（bottom left）and Standard error（top right）of Jino people and 10 other groups

3 討論

在法醫(yī)DNA 分析中，隨機(jī)匹配概率（RMP）是普通人群中隨機(jī)的、無(wú)關(guān)的人表現(xiàn)出與嫌疑人匹配的DNA 圖譜的概率，DNA 圖譜越罕見(jiàn)，已知和質(zhì)疑的證據(jù)來(lái)自同一個(gè)人的幾率就越大。基于毛細(xì)管電泳技術(shù)開(kāi)發(fā)的STR 基因座檢測(cè)試劑盒通常以CODIS 位點(diǎn)為核心，增加性別、Y-STR 或SNP 位點(diǎn)的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。CODIS 位點(diǎn)覆蓋了人基因組不同染色體的STR 基因座[15]，且包含有序列復(fù)雜度較高的D8S1179、FGA、D21S11 基因座，在法醫(yī)物證學(xué)的實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)在不同的地區(qū)、人群中STR 基因座的識(shí)別效能存在比較大的差異，如TPOX 和TH01 基因座，在我國(guó)人群的識(shí)別效能都不算高，因此，對(duì)于不同群體進(jìn)行基礎(chǔ)的人群頻率調(diào)查，有利于評(píng)估試劑盒的實(shí)用性。以本研究結(jié)果為例，按 DP≥ 0.9、H ≥ 0.7、PIC ≥0.7 的 STR 基因座屬高度多態(tài)性基因座的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量，基諾族17 個(gè)常染色體STR 基因座中，TPOX、TH01 基因座多態(tài)性和識(shí)別能力最低，D3S1358、D13S317、D16S539、CSF1PO、D5S818均有參數(shù)顯示多態(tài)性不佳。

所有基因座的基因型分布均符合哈溫平衡，說(shuō)明采樣符合隨機(jī)性要求，同時(shí)各基因座間相互獨(dú)立。根據(jù)乘積原則，AGCU 17+1 試劑盒在基諾族人群中具有較好的個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的系統(tǒng)效能（CDP ＞ 0.999 999 999、CPE ＞ 0.999 999），考慮到部分基因座多態(tài)性不佳的情況，可以適當(dāng)增加試劑盒檢測(cè)的基因座個(gè)數(shù)，從而提高試劑盒的識(shí)別能力。CODIS 核心STR 數(shù)據(jù)庫(kù)于2015 年進(jìn)行了拓展，核心CODIS 基因座變?yōu)?9 個(gè)[15]，增加了7 個(gè)基因座（D2S1338、D19S433、D1S1656、D12S391、D2S441、D10S1248 以及 DYS391），剔除了 TPOX 基因座。根據(jù)基諾族17 個(gè)常染色體STR 基因座人群頻率調(diào)查結(jié)果，TPOX、TH01 基因座多態(tài)性差，雖然17 個(gè)基因座聯(lián)合使用具有較高的識(shí)別能力，建議增多等位基因座檢測(cè)或選擇不含TPOX 和TH01 基因座試劑盒進(jìn)行該人群法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親權(quán)鑒定，尤其是特殊親權(quán)鑒定，如祖孫鑒定、同胞鑒定等情況[16]。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，應(yīng)該以本國(guó)人群的STR 基因座數(shù)據(jù)，篩選合適的高識(shí)別度的基因座，形成核心基因座+高特異性基因座聯(lián)檢試劑盒。

本研究所調(diào)查的基諾族群體屬于云南人口較少的少數(shù)民族，主要聚居于西雙版納基諾鄉(xiāng)。從遺傳距離來(lái)看，基諾族與同屬于彝語(yǔ)支的哈尼族匯聚在一起，雖然基諾族與傣族在聚居地重疊，但是在遺傳距離數(shù)據(jù)看，用語(yǔ)系進(jìn)行結(jié)構(gòu)分類(lèi)更具有接近度，提示基諾族由北方遷徙而來(lái)的觀點(diǎn)有一點(diǎn)的合理性。