楊丹 王剛 楊麗君 段壬澤 陳顯兵

（1.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院病理科，湖北恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北恩施 445000）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷。其病死率高，是導(dǎo)致新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一［1］。每年約有100萬新生兒死于出生窒息，無數(shù)新生兒因出生窒息造成嚴(yán)重的腦損傷且留下長(zhǎng)期后遺癥，給家庭與社會(huì)造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)［2］。川芎嗪是活血行氣藥川芎的主要提取物之一，其具有抗炎、抗氧化、抗凝血、細(xì)胞保護(hù)及改善心功能等作用［3］。段晨陽(yáng)［4］的研究顯示，大腦缺氧缺血會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷，而維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞正常活動(dòng)及機(jī)體健康至關(guān)重要。線粒體自噬是細(xì)胞內(nèi)線粒體質(zhì)量控制的重要機(jī)制，在生理水平下，線粒體自噬能夠清除受損細(xì)胞器，保護(hù)神經(jīng)元；一旦超出細(xì)胞可調(diào)控的生理水平，線粒體自噬就將啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的凋亡程序，引導(dǎo)細(xì)胞死亡［5］。本實(shí)驗(yàn)通過建立HIE新生鼠模型，研究川芎嗪對(duì)缺氧缺血誘導(dǎo)的線粒體自噬的影響，并探討川芎嗪治療HIE的可能分子機(jī)制，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

40 只SPF 級(jí)7 日齡Sprague-Dawley 新生大鼠，雌雄不限，體重11～14 g，新生大鼠和母鼠由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。川芎嗪注射液（批號(hào)72102041）購(gòu)于湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院，蘇木精- 伊紅（hematoxylin-eosin， HE） 染色液（C211003）購(gòu)于珠海貝索生物有限公司，免疫組化試劑盒（1902199710）購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，一步法TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（E-CK-A320）購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物公司，尼氏染色液（C0117）、PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1， PINK1） 抗體（AF7755）購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，Parkin抗體（WL02512）購(gòu)于沈陽(yáng)萬類生物科技有限公司，自噬特異性基因（Beclin1）抗體（3495S）、泛素結(jié)合蛋白（P62）抗體（88588S）購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3β （microtubule-associated protein 1 light chain 3β，LC3B）抗體（ab51520）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（ab6721）、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（ab6789）購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2 新生大鼠HIE模型制備

根據(jù)文獻(xiàn)［6］采用的造模方法，將7 日齡新生大鼠用乙醚麻醉后，從頸部正中切開皮膚，鈍性剝離肌肉筋膜，分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈并使用5號(hào)手術(shù)縫合線將左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，逐層縫合皮膚。手術(shù)結(jié)束后放回母鼠旁恢復(fù)1 h，然后將術(shù)后新生大鼠置于8% O2+92% N2密閉箱中缺氧2 h（氧流量2 L/min），缺氧結(jié)束后放回母鼠籠中常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

將40 只新生大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=8）、造模組（n=32）。造模組因各種原因死亡8 只，將存活的24 只隨機(jī)分為模型組（n=12）、川芎嗪組（n=12），川芎嗪組在缺氧缺血完成后30 min 給予腹腔注射川芎嗪注射液20 mg/kg，每日1 次，共治療7 d。同時(shí)，假手術(shù)組只暴露血管，不做其他處理）；模型組腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。觀察各組新生大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、行為活動(dòng)及對(duì)刺激的反應(yīng)情況。

1.4 標(biāo)本取材

藥物干預(yù)7 d 后，每組隨機(jī)抽取4 只新生大鼠進(jìn)行腦組織固定。具體步驟如下：乙醚麻醉后，斷頭取腦，小心剝離出腦組織，沿大腦視交叉處做4～5 mm 冠狀切片，將其置于4%多聚甲醛中固定48 h，后進(jìn)行脫水、石蠟包埋。采用HE 染色、尼氏染色觀察腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法觀察PINK1、Parkin 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，采用TUNEL 染色觀察神經(jīng)元凋亡情況。剩余各組新生鼠乙醚麻醉后，斷頭取腦，剝?nèi)∽髠?cè)海馬組織及皮質(zhì)組織，放入事先標(biāo)記好的EP 管中，放入-80℃冰箱備用。

1.5 HE、尼氏染色

將石蠟塊冷凍10 min 后進(jìn)行切片，厚度為4 μm，常規(guī)烤片后二甲苯脫蠟，梯度酒精至水、蒸餾水洗滌。后將切片放入蘇木素染液中染色10 min，水洗1 min，分化15 s、水洗1 min，后置于伊紅染色2 min，水洗1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

同上行4 μm 切片，烤片后二甲苯脫蠟、梯度酒精至水、蒸餾水洗滌。將尼氏染液水浴加熱至37℃，再將切片放入尼氏染液中30 min，蒸餾水洗滌，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

同上述方法將蠟塊行4 μm 切片，脫蠟至水，使用EDTA修復(fù)液高壓修復(fù)，自然冷卻后按照免疫組化試劑盒說明書依次滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液、非特異性染色阻斷劑，PINK1（1∶100）、Parkin（1∶100）一抗孵育1 h，清洗后依次滴加生物素標(biāo)記羊抗小鼠/兔聚合物、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，DAB顯色，經(jīng)復(fù)染、分化、返藍(lán)后，中性樹膠封片，掃描采集并分析圖片，采用Image J計(jì)算陽(yáng)性染色面積與總面積之比。

1.7 TUNEL染色

將4 μm 切片常規(guī)脫蠟后按照試劑盒說明書步驟依次滴加蛋白酶K 工作液、1×DNase Ⅰ Buffer、DNase Ⅰ工作液、TdT Equilibration Buffer，孵育后滴加陽(yáng)性標(biāo)記工作液，DAPI 染色后滴加抗熒光猝滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元凋亡情況，采用Image J計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western blot

按照1 mg腦組織加入9 μL裂解液、0.09 μL蛋白酶抑制劑的比例進(jìn)行組織勻漿、超聲，勻漿液低溫高速離心（4℃，12 000 r/min，15 min）后取上清液，用BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)組織蛋白濃度。制備12% SDS-PAGE 凝膠，每孔上樣3 μL，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、TBST 洗膜，加入相應(yīng)的PINK1（1∶1 000）、Parkin（1∶500）、LC3B（1∶1 500）、P62（1∶1 000）、Beclin1（1∶1 000）一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加山羊抗兔（1∶6 000）、山羊抗小鼠（1∶6 000）二抗。37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行曝光處理，采用Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新生大鼠一般生長(zhǎng)情況

生后7 d假手術(shù)組新生大鼠出現(xiàn)細(xì)小的絨毛附著在全身皮膚上，兩耳豎立；生后10～11 d鼠毛大致長(zhǎng)齊；生后13～14 d雙眼睜開，活動(dòng)自如，反應(yīng)敏捷。缺氧缺血造模后新生大鼠出現(xiàn)呼吸窘迫，四處翻滾，可見口周、眼周、四肢發(fā)紺、身體顫動(dòng)、翻身困難、夾尾左旋，行為障礙在3～4 h 消失，生后13～14 d右眼睜開，左眼閉合；與模型組比較，川芎嗪組部分新生大鼠在生后13～14 d雙眼睜開，部分右眼睜開，活動(dòng)自如。3組新生大鼠一般生長(zhǎng)情況無明顯差異。

在總體趨勢(shì)上，各組新生大鼠體重都以不同的速度增長(zhǎng)，且從造模后第2天起，模型組與川芎嗪組新生大鼠體重均低于假手術(shù)組，但3組新生大鼠體重術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組新生大鼠在術(shù)后7 d的體重變化情況（n=8）

2.2 各組新生大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的改變

HE 染色及尼氏染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組新生大鼠海馬與皮質(zhì)中神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量豐富，排列整齊，核居正中且圓，核仁清晰，尼氏小體數(shù)量豐富。模型組新生大鼠神經(jīng)元細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞間隙增大，數(shù)量減少，排列疏松紊亂，胞質(zhì)空泡化，細(xì)胞核固縮，尼氏小體數(shù)量減少。川芎嗪組神經(jīng)元細(xì)胞增多，排列整齊，核仁清晰，尼氏小體數(shù)量增多。見圖2。

圖2 川芎嗪對(duì)HIE新生大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響 假手術(shù)組腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量豐富，排列整齊、緊密；模型組腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，排列疏松，細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)空泡化，尼氏小體減少；川芎嗪組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增多，排列整齊，核仁清晰，尼氏小體數(shù)量增多。

2.3 川芎嗪對(duì)HIE 新生大鼠腦組織海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)中PINK1、Parkin表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組新生大鼠腦組織海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞減少，胞質(zhì)內(nèi)均可見PINK1、Parkin陽(yáng)性表達(dá)增多（P＜0.05）；與模型組比較，川芎嗪組新生大鼠海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增加，PINK1、Parkin 陽(yáng)性表達(dá)減少（P＜0.05）。見表1和圖3。

表1 各組新生大鼠腦組織海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)中PINK1、Parkin陽(yáng)性表達(dá)比較 （± s，IOD/Area，n=3）

表1 各組新生大鼠腦組織海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)中PINK1、Parkin陽(yáng)性表達(dá)比較 （± s，IOD/Area，n=3）

注：a示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b示與模型組比較，P＜0.05。［PINK1］PTEN誘導(dǎo)假定激酶1。

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2.4 川芎嗪對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)元凋亡率升高；與模型組比較，川芎嗪組神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05）。見圖4～5。

圖4 川芎嗪對(duì)HIE新生大鼠神經(jīng)元凋亡的影響（TUNEL染色，×40，n=3） 綠色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核。假手術(shù)組中存在少量凋亡細(xì)胞，模型組與川芎嗪組中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，但川芎嗪組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于模型組。

圖5 各組新生大鼠神經(jīng)元凋亡率比較 a示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b示與模型組比較，P＜0.05。

2.5 川芎嗪對(duì)HIE 新生大鼠腦組織中PINK1/Parkin通路蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）； P62 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。與模型組比較，川芎嗪組PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；P62蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見表2和圖6。

表2 各組新生大鼠海馬組織中PINK1/Parkin通路蛋白及自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （± s，n=5）

表2 各組新生大鼠海馬組織中PINK1/Parkin通路蛋白及自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （± s，n=5）

注：a示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b示與模型組比較，P＜0.05。［PINK1］PTEN誘導(dǎo)假定激酶1；［P62］泛素結(jié)合蛋白；［Beclin1］自噬特異性基因；［LC3］微管相關(guān)蛋白1輕鏈3。

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圖6 各組新生大鼠海馬組織中PINK1/Parkin 通路蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：川芎嗪組。

3 討論

HIE是缺氧缺血性腦損傷導(dǎo)致的急性腦功能紊亂，每1 000 名活產(chǎn)嬰兒中，約有1.5 例發(fā)生HIE［7］。目前主要治療方式是亞低溫治療。人體體溫每降低1℃，大腦代謝將會(huì)降低約5%。在中度至重度HIE 的足月兒中，在缺氧缺血事件后6 h 內(nèi)開始治療，全身降溫（33.5±0.5）℃，持續(xù)48～72 h，可顯著提高存活率并減少殘疾，但在超過了6 h 后進(jìn)行亞低溫治療則效果較差［8-10］。目前在資源有限的環(huán)境中，并且進(jìn)一步受到起始治療窗狹窄的限制，亞低溫治療仍是一種昂貴且難以實(shí)現(xiàn)的治療方式。因此，鑒于亞低溫治療的局限性，尋找一種適用性更強(qiáng)的療法是全球共同面對(duì)的問題。

在新生兒發(fā)生缺氧缺血事件時(shí)，大腦神經(jīng)元即可出現(xiàn)原發(fā)性細(xì)胞損傷。導(dǎo)致新生兒神經(jīng)細(xì)胞損傷的具體機(jī)制并不十分明確，但線粒體功能障礙是導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵因素，神經(jīng)元高度活躍的代謝決定了它對(duì)線粒體的穩(wěn)定的絕對(duì)依賴［11］。在缺血損傷后，特別是在二次衰竭受損的神經(jīng)元中，重建線粒體動(dòng)力學(xué)，通過線粒體自噬去除受損線粒體，從而補(bǔ)充新的線粒體，是功能恢復(fù)、臨床癥狀緩解的關(guān)鍵一步［12］。一旦缺氧缺血事件發(fā)生后，線粒體功能受損，為了維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，線粒體發(fā)出一種“吃我”的信號(hào)來降解受損細(xì)胞器，這一過程稱線粒體自噬。線粒體自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制［13］。在神經(jīng)細(xì)胞中，損傷的線粒體若沒有及時(shí)被清除，將會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 的釋放，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡；但自噬被過度激活就會(huì)導(dǎo)致重要細(xì)胞器甚至細(xì)胞核被吞噬降解，引起細(xì)胞自噬性死亡。故自噬程度對(duì)細(xì)胞是否存活起著至關(guān)重要的作用。在嚴(yán)重缺氧缺血環(huán)境下，過度激活的線粒體自噬導(dǎo)致了神經(jīng)元的死亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組新生大鼠一般生長(zhǎng)情況無明顯差異，但模型組新生大鼠線粒體自噬被激活，神經(jīng)元凋亡增加。黃陽(yáng)等［14］的研究顯示，過度激活的線粒體自噬可損傷缺氧缺血小鼠腦組織，通過敲除PINK1基因抑制線粒體自噬后，可對(duì)10 日齡缺氧缺血性腦損傷小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用。

PINK1是一種絲氨酸激酶，Parkin是一種E3泛素連接酶，PINK1 在Parkin 上游發(fā)揮作用。PINK1可以靶向受損線粒體，從而啟動(dòng)線粒體自噬功能［15］。在正常情況下，PINK1 從線粒體外膜移位至線粒體內(nèi)膜上，并且快速被線粒體內(nèi)膜蛋白酶PARL 切割、降解。當(dāng)線粒體受到損傷時(shí)，PINK1由外膜移至內(nèi)膜的通道受阻，然后在線粒體外膜上形成二聚體從而避免被切割，進(jìn)而完成超激活［16］。超激活后的PINK1 在線粒體外膜上募集并激活大量的E3 泛素連接酶Parkin，將待降解的貨物打上泛素化標(biāo)簽。本研究結(jié)果顯示，模型組新生大鼠腦組織海馬及皮質(zhì)區(qū)中PINK1、Parkin 的陽(yáng)性表達(dá)增加，神經(jīng)元數(shù)量減少，并出現(xiàn)核固縮、尼氏小體減少、細(xì)胞凋亡增加等病理改變，提示在腦組織發(fā)生缺氧缺血后，激活了PINK1/Parkin通路導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)病理?yè)p傷，而川芎嗪組抑制了該通路的激活，減輕腦組織病理?yè)p傷。提示川芎嗪可通過抑制PINK1/Parkin通路的激活減輕腦組織損傷。

LC3對(duì)隔離膜的生長(zhǎng)和自噬貨物的識(shí)別至關(guān)重要，為了發(fā)揮其作用，新合成的LC3經(jīng)過半胱氨酸蛋白酶ATG4 在羧基末端甘氨酸120 位點(diǎn)裂解形成LC3-Ⅰ，通過泛素樣系統(tǒng)使LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺（PE）偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，后者錨定在自噬小體膜上［17］。Beclin1 也是自噬的核心蛋白之一，Beclin1 的表達(dá)可影響缺血誘導(dǎo)的自噬激活，它調(diào)控自噬體的合成和自噬體的成熟。眾所周知，P62是自噬的效應(yīng)因子，也是自噬底物，P62蛋白通過其LC3 相互作用區(qū)域（LIR 結(jié)構(gòu)域）與LC3 相互作用附著在自噬體上，從而通過其泛素結(jié)構(gòu)域（UBA結(jié)構(gòu)域）將附著在其上的泛素化物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w并降解［18］。以上三者都是自噬順利完成不可或缺的組成部分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組中Beclin1、LC3 表達(dá)增加，P62 表達(dá)下降，表明自噬處于增強(qiáng)狀態(tài)，造成了神經(jīng)元的凋亡增加；給予川芎嗪干預(yù)后，Beclin1、LC3 表達(dá)下降，P62 表達(dá)增加，過度激活的自噬被抑制，神經(jīng)元凋亡減少，腦組織病理?yè)p傷減輕。從而推斷川芎嗪對(duì)腦神經(jīng)具有保護(hù)作用，且川芎嗪可通過抑制自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。上述推斷與Guan等［19］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，川芎嗪可改善HIE新生大鼠腦組織病理?yè)p傷，抑制神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與川芎嗪抑制PINK1/Parkin 通路從而抑制線粒體自噬相關(guān)。