邱雪萌， 鄭娟， 薛威， 毋少宇， 祁陳， 韓月月， 燕永亮， 戰(zhàn)崳華

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

氮素是植物重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)的限制因素，工業(yè)氮肥的過度施用造成了土壤板結(jié)、水體富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問題[1-2]。自然界中，某些原核微生物在常溫常壓下通過固氮酶將空氣中的氮素轉(zhuǎn)化為銨，這一過程稱為生物固氮[3]，利用生物固氮減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)工業(yè)氮肥的依賴，最終實(shí)現(xiàn)主要農(nóng)作物自主固氮是生物固氮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，天然固氮體系易受氧氣等環(huán)境因素的影響、固氮菌株宿主范圍較窄，使得生物固氮至今難以大規(guī)模應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1-4]?？茖W(xué)家們對(duì)此提出了3種技術(shù)策略：擴(kuò)大根瘤菌的宿主范圍、構(gòu)建高效聯(lián)合固氮體系以及人工設(shè)計(jì)固氮裝置[5]。

自1972年以接合轉(zhuǎn)移的方法首次成功構(gòu)建人工固氮大腸桿菌以來[6]，隨著生物固氮基因工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，通過將固氮相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到不同的底盤生物中，并經(jīng)過人工改造進(jìn)一步提高固氮裝置中固氮模塊的表達(dá)，在構(gòu)建自主固氮植物領(lǐng)域取得了一系列重要進(jìn)展[7]。耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1是1株進(jìn)化地位特殊的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有極強(qiáng)的輻射抗性[8]。同時(shí)，耐輻射異常球菌因具有獨(dú)特的生長(zhǎng)特性以及表達(dá)新型工程功能蛋白的能力，已經(jīng)作為新的底盤微生物在生物技術(shù)和生物修復(fù)中得以應(yīng)用[9]。類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WLY78是1株革蘭氏陽(yáng)性固氮菌，P. polymyxaWLY78含有1個(gè)由9個(gè)固氮基因（nifB, nifH, nifD, nifK,knife, nifN, nifX, hesA, nifV）組成的最小固氮基因簇，并且該固氮基因簇的9個(gè)基因?yàn)楣厕D(zhuǎn)錄表達(dá)，組成了1個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，將此固氮基因簇轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中能使大腸桿菌成功表達(dá)固氮酶活性[10]。

本研究通過將革蘭氏陽(yáng)性類芽孢桿菌WLY78的固氮模塊導(dǎo)入耐輻射異常球菌R1中獲得重組耐輻射異常球菌R78，對(duì)該菌株在不同水平的表達(dá)特性進(jìn)行探究，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，初步明確固氮基因簇在重組耐輻射異常球菌的表達(dá)特征，以期為進(jìn)一步固氮模塊設(shè)計(jì)和底盤優(yōu)化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)條件 耐輻射異常球菌R1、質(zhì)粒pRADZ3以及施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pHY300PLK-78由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)予。高頻轉(zhuǎn)化宿主菌株DH5α購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，高頻轉(zhuǎn)化宿主菌株JM109購(gòu)自Solarbio公司。大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)，耐輻射異常球菌及其衍生菌株采用TGY培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與耗材 限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自Magen公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Tiangen公司，細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自Analytik Jena公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑購(gòu)自Vazyme公司。試驗(yàn)所涉及的引物合成以及測(cè)序均由生工生物公司完成。

1.1.3 主要儀器 PCR儀（型號(hào)ABI Veriti? Dx）和實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增儀（型號(hào)ABI 7500）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，數(shù)字PCR儀（型號(hào)Naica）購(gòu)自Stilla公司，超微量分光光度計(jì)（型號(hào)NanoPhotometer-NP80）購(gòu)自德國(guó)Implen公司，紫外可見光分光光度計(jì)（型號(hào)U-3010）購(gòu)自日本Hitachi公司，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)5424R）購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，全溫培養(yǎng)器（型號(hào)THZC-1）購(gòu)自北京天林恒泰公司，核酸蛋白提取儀（型號(hào)MP-FastPrep-24）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)GelDoc XR）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組耐輻射異常球菌R78的構(gòu)建方法 通過酶切連接反應(yīng)，用XbaⅠ、BamHⅠ 限制性內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶將質(zhì)粒pHY300PLK-78上完整的固氮基因簇（nifBnifHnifDnifKnifEnifNnifXhesAnifV）克隆到穿梭質(zhì)粒pRADZ3中，獲得重組質(zhì)粒pRADZ3-78。采用熱擊轉(zhuǎn)化的方法將驗(yàn)證后的pRADZ3-78質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，篩選獲得重組大腸桿菌Escherichia coliZ3，通過對(duì)E. coliZ3進(jìn)行固氮酶活性測(cè)定，并采用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法[11]使pRADZ3-78質(zhì)粒轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1中，驗(yàn)證后獲得重組耐輻射異常球菌R78。試驗(yàn)中所用PCR引物如表1所示。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將活化后的D. radioduransR1、D. radioduransR78菌株接種至含有相應(yīng)抗生素的TGY液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃、220 r·min-1過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期，按照初始OD600=0.1轉(zhuǎn)接菌株培養(yǎng)液于新鮮的培養(yǎng)基中，每種菌株設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。將菌液置于30℃、220 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 h取樣并測(cè)定樣品的OD600，連續(xù)測(cè)定36 h。最后根據(jù)所得數(shù)據(jù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.3 固氮酶活性測(cè)定 采用乙炔還原法在厭氧管中測(cè)定固氮酶活性[12]。將待測(cè)菌株進(jìn)行固氮條件的脅迫培養(yǎng)，并收集厭氧管中的氣體用氣相色譜法檢測(cè)并記錄乙烯峰面積。通過繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定并計(jì)算蛋白含量。同時(shí)，使用氣象色譜儀標(biāo)定1 nmol乙烯的量，根據(jù)以下公式計(jì)算固氮酶活性。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)測(cè)定 收集6種不同銨氧條件（0 mmol·L-1+0.0% O2、0 mmol·L-1+0.5%O2、0 mmol·L-1+1.0% O2、0 mmol·L-121.0% O2、100 mmol·L-1NH+4+0.5% O2、100 mmol·L-1+21.0% O2）下培養(yǎng)的D. radioduransR78的菌體，利用細(xì)菌RNA提取試劑盒提取菌體中的總RNA，并利用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒制備cDNA，通過qPCR分析D. radioduransR78中固氮基因在不同銨氧條件下的表達(dá)差異，進(jìn)一步通過熒光染料法基于Naica Geode微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)和Naica Prism3微滴閱讀分析系統(tǒng)以及Crystal Miner數(shù)據(jù)分析進(jìn)行數(shù)字PCR。試驗(yàn)所涉及的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考相應(yīng)試劑盒說明書。

1.2.5 翻譯水平表達(dá)測(cè)定 收集6種不同銨氧條件下培養(yǎng)的D. radioduransR78菌體，使用Western Blot的方法檢測(cè)NifH蛋白表達(dá)情況。將上述菌體使用超聲破碎儀器在20%功率下，工作3 s，間隔3 s進(jìn)行超聲破碎提取菌株的總蛋白，將總蛋白離心后，分別收集蛋白上清液及沉淀，通過12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分離，然后利用半干轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行蛋白的分離與轉(zhuǎn)膜，經(jīng)過2次抗體孵育以及HRP-DAB(horseradish peroxidase-diaminobenzidine)顯色后，利用放射自顯影儀器拍攝PVDF膜。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)定 在高氮、好氧（100 mmol·L-1+21.0% O2）和無氮、厭氧條件（0 mmol·L-1+0.0% O2）下，30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)D.radioduransR78至對(duì)數(shù)初期，離心收集菌體并用液氮速凍。通過Illumina第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組耐輻射異常球菌R78構(gòu)建及驗(yàn)證

前期研究發(fā)現(xiàn)，將含有類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）WLY78固氮基因簇的質(zhì)粒pHY300PLK-78導(dǎo)入大腸桿菌JM109能使大腸桿菌在一定程度上表達(dá)固氮酶活性，為探究P. polymyxaWLY78的固氮基因簇能否在D. radioduransR1中有效表達(dá)，首先將該固氮基因簇通過酶切、連接反應(yīng)克隆到穿梭質(zhì)粒pRADZ3中，通過PCR擴(kuò)增與測(cè)序驗(yàn)證后獲得重組質(zhì)粒pRADZ3-78，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，獲得重組大腸桿菌E. coliZ3（圖1A）。通過乙炔還原法測(cè)定了E. coliZ3在0 mmol·L-1NH+4+和0.0%O2含量條件下的固氮酶活性，并以施氏假單胞菌（P. stutzeri）A1501作為對(duì)照。結(jié)果（圖2）顯示，固氮條件下的E. coliZ3和A1501乙炔還原能力隨時(shí)間的增加而增大，且在增加速率最快的時(shí)間段里（24～48 h）E. coliZ3固氮酶活性約為A1501的11%，表明pRADZ3-78固氮功能完整，可作為轉(zhuǎn)化耐輻射異常球菌R1的功能模塊。進(jìn)一步通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法將pRADZ3-78導(dǎo)入耐輻射異常球菌R1中，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證后獲得重組耐輻射異常球菌R78（圖1B）。

圖1 重組耐輻射異常球菌R78構(gòu)建及驗(yàn)證Fig. 1 Construction and verification of recombinant D. radiodurans R78 strain

圖2 菌株的固氮酶活性Fig. 2 Nitrogenase activities of bacteria

2.2 重組耐輻射異常球菌R78表型測(cè)定

為探究固氮基因簇轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1是否會(huì)影響其正常生長(zhǎng)，測(cè)定了正常培養(yǎng)條件下的野生型D. radioduransR1和重組菌株D. radioduransR78的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果（圖3）表明,固氮基因簇轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1對(duì)其各個(gè)時(shí)期的菌株生長(zhǎng)情況影響較小。同時(shí)，為探究固氮條件（厭氧或微好氧）下D. radioduransR1和D. radioduransR78的生長(zhǎng)情況，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定了2種菌株在不同氧含量下于TGY培養(yǎng)基中的OD600變化情況（初始OD600=0.1），結(jié)果（表2）顯示，氧氣含量的變化對(duì)野生型菌株D. radioduransR1和重組菌株D. radioduransR78的生長(zhǎng)情況都有影響，但是在厭氧和微好氧條件下，野生型菌株R1和重組菌株R78都能微弱生長(zhǎng)，這保證了固氮酶能夠在耐輻射異常球菌R1底盤中不失活，也表明后續(xù)的固氮活性測(cè)定以及固氮基因表達(dá)分析中能夠選擇厭氧和微好氧條件作為培養(yǎng)條件。

圖3 野生型D. radiodurans R1和重組菌株D. radiodurans R78在TGY培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curves of the wild-type strain D. radiodurans R1 and recombinant strain D. radiodurans R78 in TGY medium

表2 不同氧含量下野生型D. radiodurans R1和重組菌株D. radiodurans R78在TGY培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)Table 2 Growth of wild-type D. radiodurans R1 and recombinant strain D. radiodurans R78 in TGY medium under different oxygen contents

為探究固氮基因簇轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌R1能否賦予其固氮活性，采用乙炔還原法測(cè)定重組菌株D. radioduransR78在6種不同銨氧條件下的固氮酶活性，結(jié)果（圖4）顯示，重組菌株D. radioduransR78在6種不同銨氧條件下均未表現(xiàn)出乙炔還原能力，表明該固氮基因簇不能在耐輻射異常球菌R1底盤中表達(dá)固氮酶活性，需要進(jìn)一步分析D. radioduransR78中固氮基因的表達(dá)特性。

圖4 重組耐輻射異常球菌R78和野生型施氏假單胞菌A1501的固氮酶活Fig. 4 Nitrogenase activities of recombinant strain D. radiodurans R78 and wild type P. stutzeri A1501

2.3 固氮相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析

為探究D. radioduransR78中固氮基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，利用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)6種不同銨氧條件下D. radioduransR78的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果（圖5）顯示，不同處理中重組菌株D. radioduransR78中的9個(gè)固氮基因在mRNA水平都有表達(dá)產(chǎn)物，并且表達(dá)水平差異不明顯。為進(jìn)一步探究固氮基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異，通過qPCR比較了不同銨氧條件下nifH基因的表達(dá)量，結(jié)果（圖6）顯示，不同銨氧條件下nifH基因的表達(dá)量都有微小的上調(diào)或者下調(diào)（0.57～1.10），其中無氮厭氧條件（0 mmol·L-1NH+4+0.0% O2）下nifH基因的表達(dá)量相對(duì)上調(diào)最大，此研究結(jié)果與已報(bào)道的將固氮基因簇轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109底盤所得到的結(jié)果一致[10]。同時(shí)，采用數(shù)字PCR分析不同銨氧條件下D. radioduransR78中固氮基因nifH的絕對(duì)表達(dá)量，并與施氏假單胞菌A1501在固氮條件下nifH的絕對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，結(jié)果（表3）顯示，與A1501在固氮條件（無氮微好氧）下相比，D. radioduransR78中nifH基因絕對(duì)表達(dá)量有2個(gè)數(shù)量級(jí)的降低，表明D. radioduransR78中固氮基因盡管可以在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，但是表達(dá)水平較低，這可能是D. radioduransR78不能檢測(cè)到固氮酶活性的原因。

圖5 不同銨氧條件下耐輻射異常球菌R78中固氮相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)Fig. 5 Transcription level expression of nif genes in D. radiodurans R78 under different NH4+ and O2 conditions

圖6 耐輻射異常球菌R78中nifH基因在不同銨氧條件下的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expression of nifH of the D. radiodurans R78 in different NH+4 and O2 conditions

表3 數(shù)字PCR研究銨和氧對(duì)不同菌株固氮酶編碼基因nifH轉(zhuǎn)錄的影響Table 3 Effects of NH+4 and O2 on nifH gene transcription in different strains by dPCR

進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析固氮條件（無氮厭氧，0 mmol·L-1NH+4+0.0% O2）和非固氮條件下（高氮好氧100 mmol·L-1NH+4+21.0% O2）D. radioduransR78中基因表達(dá)量變化情況，結(jié)果顯示，相比于高氮好氧條件，無氮厭氧條件下顯著上調(diào)表達(dá)（P-adjust＜0.05且log2FC ≥1）的差異基因193個(gè)，顯著下調(diào)表達(dá)（P-adjust ＜ 0.05 且 log2FC≤-1）的差異基因有195個(gè)，其中，參與能量傳遞、氮代謝以及鐵硫轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因的表達(dá)變化可能是影響重組菌株中固氮酶表達(dá)的限制因子（圖7）。

圖7 重組耐輻射異常球菌R78碳代謝途徑中的差異表達(dá)基因Fig. 7 Differentially expressed genes in carbohydrate metabolism of recombinant strain D. radiodurans R78

2.4 固氮基因的翻譯水平表達(dá)

為驗(yàn)證重組耐輻射異常球菌R78中的固氮基因在蛋白水平上的表達(dá)情況，采用Western Blot的方法檢測(cè)了6種不同銨氧條件下D. radioduransR78中NifH蛋白的表達(dá)，并以無氮厭氧（0 mmol·L-1NH+4+0.0% O2）條件下30 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h的野生型D. radioduransR1為陰性對(duì)照，以無氮微好氧（0 mmol·L-1NH+4+1.0% O2）條件下30 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 h的野生型A1501為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果如圖8所示，在不同銨氧條件下，重組耐輻射異常球菌R78中NifH蛋白的表達(dá)量特別低，甚至沒有表達(dá)。結(jié)合數(shù)字PCR結(jié)果，推測(cè)由于NifH極低水平的表達(dá)導(dǎo)致D. radioduransR78沒有固氮酶活性。

3 討論

生物固氮作為生態(tài)系統(tǒng)中有效氮的重要合成途徑，能夠提供大量可被利用的綠色氮源[13]。然而，天然固氮體系存在易受環(huán)境影響、具有較強(qiáng)的寄主特異性等限制，難以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，以不同微生物為底盤構(gòu)建人工高效聯(lián)合固氮體系，最終實(shí)現(xiàn)真核生物自主固氮成為了生物固氮領(lǐng)域的研究前沿，也是世界性的農(nóng)業(yè)科技難題[14]。固氮酶是一種對(duì)氧敏感的金屬酶，在固氮微生物的基因組中，固氮相關(guān)的nif基因以1個(gè)或多個(gè)基因簇存在，這些nif基因在固氮酶的生物合成中發(fā)揮重要作用[15-17]，此外，全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的固氮微生物都含有nifH、 nifD、 nifK、 nifE、 nifN以及nifB基因，這與在體外組裝固氮酶組分FeMo-co所需的最小nif基因數(shù)量一致[18]，這也為人工設(shè)計(jì)固氮裝置提供了理論基礎(chǔ)。

研究表明，將類芽孢桿菌WLY78的固氮基因簇轉(zhuǎn)移到與其同屬的大腸桿菌JM109中能夠使大腸桿菌成功表達(dá)固氮酶活性，并且重組大腸桿菌固氮基因的轉(zhuǎn)錄不受銨和氧調(diào)控[10]。而耐輻射異常球菌R1作為進(jìn)化地位特殊的新底盤微生物，與類芽孢桿菌WLY78同為含有σ70因子的革蘭氏陽(yáng)性菌株，因此，將類芽孢桿菌WLY78中的固氮基因簇轉(zhuǎn)移到耐輻射異常球菌R1中，不僅有利于固氮基因啟動(dòng)子的選擇，也為探究將固氮基因簇轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)緣微生物底盤甚至進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至真核微生物中提供了試驗(yàn)依據(jù)。

本研究將類芽孢桿菌 WLY78中的固氮基因簇轉(zhuǎn)移到耐輻射異常球菌 R1中，獲得重組耐輻射異常球菌R78，并利用PCR和Western Blot等方法，發(fā)現(xiàn)外源固氮基因簇能夠在耐輻射異常球菌R78中正常轉(zhuǎn)錄，但不能完成固氮酶鐵蛋白的翻譯，從而不具有固氮酶活性。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)定及分析發(fā)現(xiàn)，相比于高氮好氧條件，無氮厭氧條件下重組耐輻射異常球菌R78中三羧酸循環(huán)途徑、磷酸戊糖途徑、氮代謝和鐵硫轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因下調(diào)顯著，其中編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的aceE和aceF基因均下調(diào)（分別為0.290和0.397倍），丙酮酸脫氫酶能夠催化丙酮酸生成乙酰-CoA，而乙酰-CoA能夠在NifV蛋白的催化下與α-酮戊二酸縮合形成R-高檸檬酸，R-高檸檬酸參與FeMo-co的合成過程，推測(cè)三羧酸循環(huán)途徑相關(guān)基因表達(dá)量較低造成重組耐輻射異常球菌R78中能量代謝效率降低，導(dǎo)致固氮酶合成受到影響不能發(fā)揮功能。研究結(jié)果為進(jìn)一步的固氮模塊設(shè)計(jì)和底盤優(yōu)化，并最終構(gòu)建人工高效固氮裝置提供理論指導(dǎo)。