張鎮(zhèn)梁　王美娜　李健　李素珍　段曉娟　喬琦

摘 要：? 管葉槽舌蘭（Holcoglossum kimballianum）是一種珍稀瀕危蘭科植物，其野生種群亟需保護(hù)。內(nèi)生菌對(duì)蘭科植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，為評(píng)估管葉槽舌蘭內(nèi)生菌的多樣性、分析采樣方式對(duì)其內(nèi)生菌的影響，該文采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)遷地保育狀態(tài)下新鮮與硅膠干燥的管葉槽舌蘭根內(nèi)生菌進(jìn)行研究。結(jié)果表明：（1）新鮮及干燥管葉槽舌蘭根內(nèi)生菌物種組成明顯不同，管葉槽舌蘭內(nèi)生真菌注釋到6門(mén)46科51屬，內(nèi)生細(xì)菌注釋到15門(mén)105科178屬；干燥后管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌注釋到6門(mén)88科116屬，內(nèi)生細(xì)菌注釋到21門(mén)154科336屬。（2）遷地保育狀態(tài)的管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生菌具有豐富的多樣性，并且內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度和多樣性遠(yuǎn)比內(nèi)生真菌群落高；經(jīng)硅膠干燥后，內(nèi)生真菌α多樣性指數(shù)升高、β多樣性指數(shù)降低，而內(nèi)生細(xì)菌的α多樣性指數(shù)降低、β多樣性指數(shù)則升高。（3）差異顯著性真菌黃蓋小脆柄菇（Psathyrella candolleana）和刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum）的C. tofieldiae只存在于新鮮根樣中，新鮮管葉槽舌蘭差異顯著性細(xì)菌是馬賽菌屬（Massilia），干燥根樣中差異顯著性細(xì)菌類群包括拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）及慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）。（4）共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析顯示，經(jīng)干燥后管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生菌群落中占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)物種和互作模式都發(fā)生了改變。綜上認(rèn)為，不同采樣處理會(huì)影響管葉槽舌蘭根內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)，在研究蘭科植物根樣內(nèi)生菌時(shí)宜使用新鮮的根樣。該研究結(jié)果為管葉槽舌蘭野生種群保護(hù)及人工栽培提供了內(nèi)生菌數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為蘭科植物內(nèi)生微生物采樣方法提供了參考。

關(guān)鍵詞： 管葉槽舌蘭， 內(nèi)生真菌， 內(nèi)生細(xì)菌， 新鮮， 硅膠干燥， 多樣性

中圖分類號(hào)：? Q93-33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）06-0991-15

Diversity study of endophytic communities? in fresh and? silica gel-dried root samples of Holcoglossum kimballianum （Orchidaceae）

ZHANG Zhenliang1，2， WANG Meina2， LI Jian2， LI Suzhen2， DUAN Xiaojuan2， QIAO Qi1*

（ 1. Agricultural College/Peony College， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， Henan， China; 2. Orchid

Conservation & Research Center of Shenzhen and the National Orchid Conservation Center of China， Shenzhen Key Laboratory

for Orchid Conservation and Utilization， Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration

for Orchid Conservation and Utilization， Shenzhen 518114， Guangdong， China ）

Abstract：? Holcoglossum kimballianum is a rare and endangered orchid， and its wild populations are in urgent need of conservation. Endophytic fungi and bacteria are important to the growth and development of orchids. In order to assess the diversity of H. kimballianum endophytes and the impact of sampling methods on the endophytes， high-throughput sequencing technology was used to study the diversity of endophytes in fresh and silica gel-dried roots of H. kimballianum in ex-situ conservation. The results were as follows： （1） The species compositions of endophytic fungi and endophytic bacteria were distinctly different in fresh and silica gel-dried roots of H. kimballianum. There were total of 6 phyla 46 families 51 genera of endophytic fungi and 15 phyla 105 families 178 genera of endophytic bacteria annotated in the roots of the H. kimballianum. After silica gel-dried， the endophytic fungi of the H. kimballianum had total of 6 phyla， 88 families， 116 genera， and the endophytic bacteria had total of 21 phyla， 154 families， 336 genera. （2） Endophytes in the roots of H. kimballianum in ex-situ conservation were of richness and diversity of? endophytic bacterial community was much higher than that of endophytic fungal community. After silica gel-dried， the α diversity indices of endophytic fungi increased and the β diversity indices decreased， while the α diversity indices of endophytic bacteria decreased and the β diversity indices increased. （3） Significantly different fungi Psathyrella candolleana and Colletotrichum tofieldiae only existed in the endophytic fungal communities of fresh roots. The significantly different bacteria in roots of fresh Hocoglossum kimballianum was Marseilla， and the significantly different bacteria in the silica gel-dried roots included Beijerinckiaceae， Xanthobacteraceae and Bradyrhizobium. （4） Co-occurrence network analysis revealed that the dominant species and interaction patterns in the endophytic communities of the roots of Hocoglossum kimballianum were changed after silica gel-dried. In summary， different sampling treatments can affect the community structure of the endophytes in the roots of H. kimballianum， and it is advisable to use fresh root samples when studying the endophytes of orchids. The results provide an endophytic data basis for wild populations conservation and artificial cultivation of H. kimballianum， and also provide a reference for sampling methods of endophytic microorganisms in orchids.

Key words： Holcoglossum kimballianum， endophytic fungi， endophytic bacteria， fresh， silica gel-dried， diversity

生態(tài)系統(tǒng)中，植物與大量微生物相互作用，這些微生物在地下和地上植物器官的內(nèi)部和外表面都有定殖（Compant et al.， 2019；Escudero et al.， 2019），這些與植物相關(guān)的微生物群落統(tǒng)稱為植物微生物群（Marchesi et al.， 2015）。細(xì)菌和真菌是植物微生物群的主要組成部分，它們對(duì)植物微生態(tài)系統(tǒng)的平衡起到重要作用。植物中的內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段，生活于健康植物中的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的菌類。內(nèi)生真菌對(duì)蘭科植物非常重要，蘭科菌根真菌屬于內(nèi)生真菌，它們是蘭科植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段不可或缺的關(guān)鍵因素，能直接參與蘭科植物根系甚至整個(gè)植株的生理代謝活動(dòng)，從而保障蘭科植物的生長(zhǎng)、個(gè)體間競(jìng)爭(zhēng)以及對(duì)病原體的防御（蓋雪鴿等，2014；Li et al.， 2021）。高越等（2019）從手參（Gymnadenia conopsea）根系中分離出角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium），將該菌株與手參種子進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它能明顯促進(jìn)手參種子原球莖的形成且最終分化成幼苗。楊文科（2020）通過(guò)遷地共生萌發(fā)從白旗兜蘭（Paphiopedilum spicerianum）原球莖中分離出膠膜菌屬（Tulasnella），它能有效促進(jìn)其種子萌發(fā)直到幼苗階段。這都表明內(nèi)生真菌在蘭科植物的生長(zhǎng)發(fā)育中具有極大的促進(jìn)作用。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已報(bào)道的常見(jiàn)蘭科植物菌根真菌有69屬，分別隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、子囊菌門(mén)（Ascomycota）及毛霉門(mén)（Mucoromycota）的50科（王美娜等，2021）。

此外，蘭科植物的內(nèi)生菌中還存在大量有益的內(nèi)生細(xì)菌，這些有益的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)蘭科植物的生長(zhǎng)發(fā)育也發(fā)揮著積極的促進(jìn)作用，Tsavkelove等（2007）研究表明內(nèi)生細(xì)菌能促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)、光合形態(tài)建成、緩解非生物脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育等。目前，關(guān)于蘭科植物根部細(xì)菌結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)知還非常有限（Kaur et al.， 2021 ）。從蘭科植物中分離出的細(xì)菌通常屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes），不同的內(nèi)生細(xì)菌類群對(duì)蘭科植物具有不同程度的促進(jìn)作用，F(xiàn)aria等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）能促進(jìn)Cattleya loddigesii 幼苗的生長(zhǎng)。從蘭屬（Cymbidium sp.）根中分離出的根瘤菌屬（Rhizobium）能溶解磷酸鈣。此外，Tarkka等（2008）研究表明，蘭科植物菌根中存在菌根輔助細(xì)菌（mycorrhiza helper bacteria），能與菌根真菌特異性結(jié)合，刺激菌根真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，促進(jìn)菌根真菌在宿主植物中定殖和生長(zhǎng)，加強(qiáng)菌根化，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)及增強(qiáng)抗逆性（陳耀麗等，2019；Wang et al.， 2021）。因此，加強(qiáng)蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌的研究，在蘭科植物的相關(guān)微生物研究中顯得非常重要。

管葉槽舌蘭（Holcoglossum kimballianum）隸屬于蘭亞科（subfamily Orchidoideae）萬(wàn)代蘭族（tribe Vandeae）槽舌蘭屬（Holcoglossum），分布在中國(guó)的云南以及緬甸、泰國(guó)，常附生在山地林中的樹(shù)干上，海拔一般在1 000 m以上，具有較高的觀賞價(jià)值，瀕危等級(jí)為EN（瀕危），其野生種群亟需保護(hù)。目前，對(duì)管葉槽舌蘭的研究主要集中在系統(tǒng)發(fā)育、生物地理學(xué)和細(xì)胞學(xué)等方面，對(duì)其根部?jī)?nèi)生菌的研究鮮有報(bào)道。另外，Harrison等（2016）針對(duì)植物內(nèi)生微生物的研究在采樣時(shí)為方便野外作業(yè)經(jīng)常采用硅膠干燥的方法，這有可能會(huì)引起根內(nèi)微生物群落的極大變化。因此，本研究采用ITS和16S高通量測(cè)序技術(shù)的方法，對(duì)管葉槽舌蘭新鮮及硅膠干燥根樣中的內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行研究，擬探討：（1）管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生菌類群的多樣性；（2）管葉槽舌蘭新鮮根樣與干燥根樣中內(nèi)生菌群落的差異；（3）管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生細(xì)菌和真菌的比較。本研究為管葉槽舌蘭的種植及種質(zhì)資源保護(hù)提供了內(nèi)生真菌和細(xì)菌方面的數(shù)據(jù)，同時(shí)為研究蘭科植物根內(nèi)微生物提供采樣處理的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預(yù)處理

在深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心，采集遷地保護(hù)狀態(tài)下的管葉槽舌蘭生長(zhǎng)健康的根，在不影響管葉槽舌蘭正常生長(zhǎng)的情況下，每個(gè)樣品取3～5條長(zhǎng)2～5 cm的根段，盡量由3株以上的管葉槽舌蘭根樣組成，采集的同一組根樣分別做新鮮及干燥根樣的預(yù)處理。新鮮根樣預(yù)處理在根段取材后即刻進(jìn)行，步驟如下：用流水沖洗根表面后，用5%次氯酸鈉和75%酒精依次消毒2 min，加入無(wú)菌水，洗凈棄廢液，將預(yù)處理后得到的最后一次無(wú)菌水進(jìn)行DNA提取和風(fēng)險(xiǎn)建庫(kù)測(cè)試，未得到任何結(jié)果表明樣品得到了很好的預(yù)處理。將新鮮根樣置于-80 ℃冰箱以備提取微生物組DNA。將干燥根樣在預(yù)處理后放入硅膠中干燥72 h，備用。每個(gè)處理重復(fù)8次。

1.2 根內(nèi)微生物組DNA提取、PCR擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建及HiSeq測(cè)序

使用QIAGEN PowerLyzer試劑盒對(duì)根內(nèi)微生物組DNA進(jìn)行提取。內(nèi)生真菌選擇帶Barcode的特異引物（ITS5-1737F： GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG和ITS2-2043R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC），內(nèi)生細(xì)菌選擇帶Barcode的特異引物（fM1：CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT和rC5：TAATCCTGTTTGCTCCCCAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Bellemain et al.， 2010；Yu et al.， 2013）。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；進(jìn)入30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)［98 ℃ 10 s，50 ℃（真菌）、55 ℃（細(xì)菌）30 s，72 ℃ 30 s］；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)體系（30 μL）：2 × Phusion Master Mix（New England Biolabs）15 μL，Primer（2 μmol·L-1）3 μL，gDNA 10 ng，補(bǔ)充H2O至30 μL。使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物膠回收純化后使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，利用Illumina HiSeq 2500 PE 250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（北京諾禾致源生物科技有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)截去Barcode和引物序列后，使用FLASH（Version 1.2.7）進(jìn)行拼接，得到Raw Tags后使用fastp軟件對(duì)Raw Tags進(jìn)行過(guò)濾得到高質(zhì)量的Clean Tags。參照Qiime（V1.9.1）的Tags質(zhì)量控制流程和去除嵌合體處理后得到有效數(shù)據(jù)Effective Tags。利用Uparse軟件（V 7.0.1001）以97%的一致性對(duì)所有樣品的全部Effective Tags進(jìn)行聚類得到OTUs，對(duì)出現(xiàn)頻數(shù)最高的OTUs代表序列采用Qiime軟件（V 1.9.1）中的Blast和Mothur方法與真菌數(shù)據(jù)庫(kù)Unite和細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)Silva進(jìn)行物種注釋分析，統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理后，基于Qiime軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)及β多樣性指數(shù)，并進(jìn)行t-test差異顯著性檢驗(yàn)。利用R軟件的VennDiagram包和Vegan包進(jìn)行維恩圖及無(wú)度量多維標(biāo)定法（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）分析。為進(jìn)一步挖掘分組樣本間的差異顯著性真菌和細(xì)菌類群，選用Metastat、LEfSe統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。對(duì)所有樣品的相關(guān)性指數(shù)（斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)SCC）進(jìn)行計(jì)算后，用cutoff＝0.6對(duì)相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值進(jìn)行過(guò)濾，結(jié)合物種豐度構(gòu)建共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)（Network）圖。

2 結(jié)果與分析

基于Illumina HiSeq測(cè)序技術(shù)，從16個(gè)管葉槽舌蘭根部ITS共獲得2 834 046條有效Tags，有效Tags范圍為164 665～187 236。從管葉槽舌蘭根部16S共獲得2 375 402條有效Tags，有效Tags范圍為122 886～161 516。

2.1 內(nèi)生菌群落物種組成和采樣處理對(duì)其影響

注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新鮮管葉槽舌蘭注釋到的根內(nèi)生真菌有6門(mén)46科51屬，其中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度為52.20%，擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度為20.22%，球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、毛霉門(mén)相對(duì)豐度在1%左右；而經(jīng)硅膠干燥后的管葉槽舌蘭注釋到的根內(nèi)生真菌有6門(mén)88科116屬，其中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度為57.84%，擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度為3.68%，球囊菌門(mén)、被孢霉門(mén)、毛霉門(mén)、羅茲菌門(mén)的相對(duì)豐度在1%以下。在2個(gè)分組中，子囊菌門(mén)都占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。相比較而言，干燥后管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生真菌類群數(shù)量變多；新鮮管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生真菌群落中子囊菌門(mén)、球囊菌門(mén)占比低于硅膠干燥根樣中的內(nèi)生真菌群落，而蘭科菌根真菌最多的擔(dān)子菌門(mén)明顯高于硅膠干燥根樣中的內(nèi)生真菌群落（圖1：a）。經(jīng)硅膠干燥后，管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌在科水平（圖1：b）的相對(duì)豐度發(fā)生了改變，曲霉科（Aspergillaceae）在干燥后豐度明顯降低，而枝孢霉科（Cladosporiaceae）在干燥后豐度明顯升高，小叢殼科（Glomerellaceae）和膠膜菌科（Tulasnellaceae）的相對(duì)豐度在經(jīng)硅膠干燥后的根樣品中的豐度幾乎為零。在屬水平上（表1，圖1：c），管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌的相對(duì)豐度發(fā)生了改變，青霉屬（Penicillium）、Aporospora、瘤菌根菌屬（Epulorhiza）經(jīng)干燥后的豐度降低，而枝孢屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）和Mycoacia在干燥后豐度明顯升高，小脆柄菇屬（Psathyrella）和刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum）的相對(duì)豐度經(jīng)硅膠干燥后的豐度為零。從排名前15的硅膠干燥處理前后管葉槽舌蘭根部?jī)?nèi)生真菌屬水平絕對(duì)豐度值變化可以看出，青霉屬、瘤菌根菌屬、Keissleriella及亞隔孢殼屬（Didymella）在干燥后豐度值降低，其余屬如Aporospora、枝孢屬、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）、紅菇屬（Russula）和鏈格孢屬（Alternaria）等在干燥后豐度值增加，而小脆柄菇屬和刺盤(pán)孢屬在經(jīng)硅膠干燥后的根部樣品的豐度值為零。這與管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌在屬水平的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)總體相似。

根據(jù)OTUs聚類結(jié)果（本文將未注釋到的OTU包含在內(nèi)一起計(jì)算，下同），繪制OTUs韋恩圖（圖1：g），結(jié)果顯示新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌特有的OTUs有56個(gè)，主要是子囊菌門(mén)（16個(gè)OTUs）和擔(dān)子菌門(mén)（12個(gè)OTUs）；而經(jīng)硅膠干燥后根樣中內(nèi)生真菌有123個(gè)特有OTUs，主要隸屬于子囊菌門(mén)（47個(gè)OTUs），擔(dān)子菌門(mén)僅有10個(gè)OTUs；2個(gè)分組共有的OTUs僅有61個(gè)，其中有21個(gè)OTUs屬于子囊菌門(mén)，8個(gè)OTUs屬于擔(dān)子菌門(mén)。這表明干燥后的管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落在喪失掉新鮮根樣中的一些真菌類群的同時(shí)，也產(chǎn)生了相當(dāng)數(shù)量的新的真菌類群，這些新產(chǎn)生的真菌主要隸屬于子囊菌門(mén)。

在內(nèi)生細(xì)菌方面，新鮮管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌注釋到15門(mén)105科178屬，其中變形菌門(mén)相對(duì)豐度為18.21%，藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）相對(duì)豐度為1.78%，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度為1.41%，放線菌門(mén)（Actinobacteria）相對(duì)豐度為1.14%，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、螺旋體門(mén)（Spirochaetes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）的相對(duì)豐度低于1%；而經(jīng)硅膠干燥后的管葉槽舌蘭注釋到的根內(nèi)生細(xì)菌有21門(mén)154科336屬，其中變形菌門(mén)相對(duì)豐度為48.71%，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)豐度為8.31%，放線菌門(mén)相對(duì)豐度為5.67%，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）相對(duì)豐度為3.41%，藍(lán)藻門(mén)相對(duì)豐度為2.58%，螺旋體門(mén)、酸桿菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度低于1%（圖1：d）。在2個(gè)分組中變形菌門(mén)豐度均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。相比較而言，干燥后管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生細(xì)菌類群數(shù)量同樣變多，經(jīng)硅膠干燥后，占主要優(yōu)勢(shì)的變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度均有明顯提高（圖1：d）。管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)硅膠干燥后在科水平（圖1：e）的相對(duì)豐度發(fā)生了改變，鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）等占比均明顯升高，而伯克氏菌科（Burkholderiaceae）在干燥后明顯降低。在屬水平上（表1，圖1：f），管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌的相對(duì)豐度發(fā)生了改變，鞘氨醇菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、副球菌屬（Paracoccus）和泛菌屬（Pantoea）在干燥后豐度明顯升高，而馬賽菌屬（Massilia）在干燥后明顯降低。從排名前15的硅膠干燥處理前后管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌屬水平絕對(duì)豐度值變化表中可以看出馬賽菌屬和Rubrobacter在干燥后豐度值降低，其余屬如鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬和分支桿菌屬（Mycobacterium）等經(jīng)干燥后豐度值都明顯增加，這與管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)相似。

根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，繪制OTUs韋恩圖（圖1：h），結(jié)果顯示新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌特有的OTUs有751個(gè)，主要是藍(lán)藻門(mén)（33個(gè)OTUs）；而經(jīng)硅膠干燥后根樣中內(nèi)生細(xì)菌有579個(gè)特有OTUs，主要隸屬于厚壁菌門(mén)（100個(gè)OTUs）；2個(gè)分組共有的OTUs有532個(gè)，其中有127個(gè)OTUs屬于變形菌門(mén)，50個(gè)OTUs屬于藍(lán)藻門(mén)，36個(gè)OTUs屬于厚壁菌門(mén)，13個(gè)OTUs屬于擬桿菌門(mén)，1個(gè)OTUs屬于酸桿菌門(mén)，1個(gè)OTUs屬于螺旋體門(mén)。通過(guò)結(jié)果分析表明，相對(duì)于真菌來(lái)說(shuō)，管葉槽舌蘭擁有更為豐富的內(nèi)生細(xì)菌類群，同內(nèi)生真菌一樣，經(jīng)硅膠干燥后，其內(nèi)生細(xì)菌群落在喪失掉新鮮根樣中的一些細(xì)菌類群的同時(shí)產(chǎn)生了相當(dāng)數(shù)量的新的細(xì)菌類群，喪失的細(xì)菌主要隸屬于藍(lán)藻門(mén)，而新產(chǎn)生了大量的厚壁菌門(mén)。

2.2 內(nèi)生菌群落多樣性差異分析

為對(duì)比新鮮與干燥管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生菌群落的豐富度和多樣性，對(duì)2組樣品內(nèi)生菌群落的α多樣性進(jìn)行比較分析，包括Chao 1、Shannon、Simpson等指數(shù)，Chao 1是計(jì)算群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，常用來(lái)指示群落物種豐富度，Shannon和Simpson是綜合考慮樣本中物種的豐富度與均勻度指數(shù)，用來(lái)表示群落多樣性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落的Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為39.797、3.070、0.723；硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生真菌群落的Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為62.348、3.715、0.785。新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落的Chao 1指數(shù)明顯低于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生真菌群落，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)略低于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生真菌群落，水平相當(dāng)。t-test檢驗(yàn)表明，干燥前后3個(gè)α多樣性指數(shù)均無(wú)顯著性差異。這表明硅膠干燥前后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生真菌群落多樣性水平相當(dāng)，但干燥后物種數(shù)量明顯變多。新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌群落的Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為524.492、7.103、0.976；硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生細(xì)菌群落的Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為321.154、6.543、0.973。經(jīng)硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生細(xì)菌群落Chao 1指數(shù)遠(yuǎn)低于新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌群落。新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌群落Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)高于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生細(xì)菌群落。t-test檢驗(yàn)表明，干燥前后3個(gè)α多樣性指數(shù)除了Chao 1指數(shù)（Pt-test=0.008）外其他均無(wú)顯著性差異。這表明硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生細(xì)菌群落物種數(shù)量和多樣性明顯減少。這一結(jié)果與管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生真菌群落的正好相反。

為研究新鮮與干燥管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生菌群落的差異程度，對(duì)2組樣品內(nèi)生菌群落的β多樣性進(jìn)行比較分析。基于Weighted Unifrac的β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌的β多樣性高于硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落的；而內(nèi)生細(xì)菌基于Weighted Unifrac的β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌群落的β多樣性要高于新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌的，t-test檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干燥前后β多樣性指數(shù)無(wú)顯著性差異。為進(jìn)一步衡量硅膠干燥前后管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌與內(nèi)生細(xì)菌群落間的差異，進(jìn)行NMDS分析?；赪eighted Unifrac的NMDS分析發(fā)現(xiàn)，新鮮及干燥管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌與細(xì)菌群落具有明顯分區(qū)。分析表明新鮮及干燥管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌與細(xì)菌群落的β多樣性指數(shù)無(wú)顯著性差異，而在物種組成上卻具有明顯不同。

2.3 差異顯著性內(nèi)生菌類群分析

為研究硅膠干燥前后管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌與細(xì)菌群落間是否具有顯著性差異的物種，利用Metastat和LEfSe分析篩選具有顯著性差異的物種。MetaStat分析表明，硅膠干燥前后，管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落的差異顯著性真菌有擔(dān)子菌門(mén)小脆柄菇屬的黃蓋小脆柄菇（Psathyrella candolleana）及子囊菌門(mén)刺盤(pán)孢屬的Colletotrichum tofieldiae，這2個(gè)顯著性差異物種只存在于新鮮管葉槽舌蘭根樣的內(nèi)生真菌群落中（圖4：a、b，表1）；LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，新鮮及干燥管葉槽舌蘭根樣均具有各自的差異顯著性內(nèi)生細(xì)菌類群。新鮮管葉槽舌蘭根樣的差異顯著性內(nèi)生細(xì)菌類群為馬賽菌屬，而干燥管葉槽舌蘭根樣的差異顯著性內(nèi)生細(xì)菌類群較多，在科和屬水平上有拜葉林克氏菌科、黃色桿菌科及慢生根瘤菌屬（圖4：c、d）。

2.4 共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)（Co-occurrence Network）分析

對(duì)新鮮管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生真菌群落和硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生真菌群落進(jìn)行共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的物種主要分布在子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)及Mortierellomycota。其中，占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)屬主要有瘤菌根菌屬、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、假尾孢菌屬（Pseudocercospora）、Vishniacozyma及Aporospora等（圖5：a）。硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的物種分布在子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、Mortierellomycot和毛霉門(mén)。其中，占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)屬主要有Vishniacozyma、Stephanonectria、彎頸霉屬（Tolypocladium）、小克銀漢霉屬（Cunninghamella）、Archaeorhizomyces及假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）等（圖5：b）。在內(nèi)生細(xì)菌方面，新鮮管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌群落共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的物種主要分布在梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、擬桿菌門(mén)、異常球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）、酸桿菌門(mén)和變形菌門(mén)。其中，占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)屬主要有：芽孢桿菌屬、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、Psychroglaciecola、Parabacteroides、異常球菌屬（Deinococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等（圖5：c）。硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生細(xì)菌群落共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中的物種則分布在厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、裝甲菌門(mén)（Armatimonadetes）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）、擬桿菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、螺旋體門(mén)、纖維桿菌門(mén)（Fibrobacteres）、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、酸桿菌門(mén)和棲熱菌門(mén)。其中，占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)屬主要有熱解糖梭菌屬（Thermoanaerobacterium）、Mucilaginibacter、微球菌屬（Micrococcus）、異常球菌屬、Fimbriiglobus、Sphaerochaeta（圖5：d）。

綜上結(jié)果分析表明，同新鮮管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生菌群落相比，硅膠干燥后管葉槽舌蘭根樣的內(nèi)生菌群落中占互作主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)物種、密切作用的菌類群、豐度及互作模式都發(fā)生了改變。同時(shí)，與內(nèi)生真菌群落相比，無(wú)論是干燥前還是干燥后管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)中密切互作的類群及節(jié)點(diǎn)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于內(nèi)生真菌群落，表明管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌群落具有比真菌更為活躍的相互作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 管葉槽舌蘭的菌根真菌與菌根細(xì)菌

管葉槽舌蘭根內(nèi)生真菌主要隸屬于子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、球囊菌門(mén)、毛霉門(mén)和Mortierellomycota。這一結(jié)果與前人研究的蘭科植物根內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果相同（蔣玉玲等，2018；艾葉等，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮管葉槽舌蘭根樣內(nèi)占有較高豐度的曲霉科、小叢殼科和膠膜菌科，這3個(gè)真菌科被報(bào)道是蘭科植物的菌根真菌科（Zelmer et al.， 1996；Yuan et al.， 2010），其中膠膜菌科是最常見(jiàn)的蘭科植物菌根真菌科，與許多蘭科植物形成廣泛的菌根關(guān)系（Shao et al.， 2020；Wang et al.， 2022）。在屬水平上，管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬有青霉屬、小脆柄菇屬、刺盤(pán)孢屬、Aporospora和瘤菌根菌屬，這些真菌類群均被報(bào)道是蘭科植物的菌根真菌（王美娜等，2021）。李明等（2006）采用根組織切片法調(diào)查碧玉蘭（Cymbidium lowianum）的菌根真菌，初步鑒定包括青霉屬、鏈霉屬等。Yamato等（2005）對(duì)虎舌蘭（Epipogium roseum）根內(nèi)菌根真菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)屬為小脆柄菇屬和鬼傘屬（Coprinus）。Chen等（2012）用分離培養(yǎng)和分子系統(tǒng)學(xué)方法對(duì)金釵石斛（Dendrobium nobile）和束花石斛（D. chrysanthum）根部?jī)?nèi)生真菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)刺盤(pán)孢屬是兩種石斛屬的優(yōu)勢(shì)屬。在金釵石斛、硬葉兜蘭（Paphiopedilum wardii）和杏黃兜蘭（P. armeniacum）的根中都分離到瘤菌根菌屬，并將其回接到3種蘭科植物的組培苗中，發(fā)現(xiàn)瘤菌根菌屬能夠促進(jìn)無(wú)菌苗的生長(zhǎng)，并且提高金釵石斛無(wú)菌苗的總生物堿和多糖的含量（陳曉梅等，2005；朱鑫敏等，2012）。Tan等（2012）從9種野生槽舌蘭屬植物的根內(nèi)生真菌中分離出46株可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，隸屬于16屬，包括鏈格孢屬、枝孢屬、瘤菌根菌屬、鐮刀菌屬、刺盤(pán)孢屬、亞隔孢殼屬、Stephanonectria、Phomopsis、擬隱孢殼Cryptosporiopsis、Leptosphaeria、Pyrenochaeta、Clonostachys、Cosmospora、柱孢屬Cylindrocarpon、Myrmecridium和Paraconiothyrium，其中9個(gè)屬在本研究的管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生真菌中被注釋到，表明本研究的管葉槽舌蘭與同屬植物中的內(nèi)生真菌群落具有一定的相似性，瘤菌根菌屬和鐮刀菌屬是9種野生槽舌蘭屬植物主要的內(nèi)生真菌。由此推測(cè)，這些真菌類群是對(duì)管葉槽舌蘭有益的菌根真菌。

管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌主要隸屬于變形菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、螺旋體門(mén)、酸桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)。其中，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)和放線菌門(mén)等是最為常見(jiàn)的蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌門(mén)，變形菌門(mén)有利于生長(zhǎng)素的合成（Tsavkelova et al.， 2007a）。Tsavkelova等（2003）在蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）、杓唇石斛（Dendrobium moschatum）和短序脆蘭（Acampe papillosa）中都分離出的兼顧固氮性和光合作用的藍(lán)藻門(mén)，厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌屬能防止葉斑病，促進(jìn)種子的萌發(fā)和植株生長(zhǎng)，減少幼苗壞死（程萍等，2008; White et al.， 2014）。在蝴蝶蘭（Girija et al.， 2018）和鐵皮石斛（Yu et al.， 2013）中均有報(bào)道螺旋體門(mén)和綠彎菌門(mén)，但其豐度較低。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮管葉槽舌蘭根樣內(nèi)豐度較高的伯克氏菌科在干燥后的根樣中豐度明顯下降。Galdiano等（2011）從Cattleya walkeriana中分離出的腸桿菌科和伯克氏菌科等細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，它們能促進(jìn)生長(zhǎng)并提高植株的存活率。在屬水平上，管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬主要有馬賽菌屬、鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬，馬賽菌屬不僅能合成各種次級(jí)代謝產(chǎn)物和酶，還有溶磷、降解菲和耐受重金屬等功能（Zheng et al.， 2017；楊恩東等，2019）。鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬是許多蘭科植物的優(yōu)勢(shì)菌，Tsavkelova等（2007）將杓唇石斛根部分離的鞘氨醇菌屬接種于杓唇石斛種子發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇菌屬極大提高了種子萌發(fā)率；鞘氨醇菌屬還能固定氮，并增加幼苗的生長(zhǎng)和生物量（Yang et al.， 2014）。假單胞菌屬被報(bào)道是Pterostylis vittata根系的優(yōu)勢(shì)屬，可以產(chǎn)生激素來(lái)促進(jìn)植物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（Wilkinson et al.， 1989；黃騰飛，2012），并有助于真菌在植株根部的定殖，促進(jìn)蘭花菌根的形成（張萍和宋希強(qiáng)，2012）。童文君等（2014）對(duì)美花石斛（Dendrobium loddigesii）內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)，腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬。

綜上所述，結(jié)合前人研究及本文結(jié)果推測(cè)，青霉屬、小脆柄菇屬、刺盤(pán)孢屬和瘤菌根菌屬等內(nèi)生真菌是管葉槽舌蘭的菌根真菌；而馬賽菌屬、鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬等可能是管葉槽舌蘭的“菌根細(xì)菌”。這些優(yōu)勢(shì)菌群可能在管葉槽舌蘭的種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，在今后的研究中，可重點(diǎn)關(guān)注這些內(nèi)生菌類群分離培養(yǎng)，及其與管葉槽舌蘭的互利共生機(jī)理研究。

3.2 管葉槽舌蘭根內(nèi)生菌類群與多樣性水平

管葉槽舌蘭的根樣內(nèi)生真菌中共得到117個(gè)OTUs，Jacquemyn等（2016）采用454測(cè)序平臺(tái)對(duì)火燒蘭屬（Epipactis）3個(gè)物種根內(nèi)真菌進(jìn)行研究共得到105個(gè)OTUs，3個(gè)物種OTUs范圍為42～58，OTUs數(shù)量低于本研究管葉槽舌蘭根內(nèi)真菌OTUs的數(shù)量。Park等（2018）基于454測(cè)序平臺(tái)對(duì)蝦脊蘭屬（Calanthe）6個(gè)物種的根內(nèi)真菌進(jìn)行研究，在每個(gè)樣本中得到的OTUs數(shù)量范圍為22～57，遠(yuǎn)低于本研究OTUs數(shù)量的水平。本研究中，管葉槽舌蘭根內(nèi)真菌群落的α多樣性指數(shù)Chao 1為39.797，Shannon指數(shù)為3.070，Simpson指數(shù)為0.723。Zeng等（2021）用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)白芨（Bletilla striata）、黃花白芨（B. ochracea）和小白芨（B. formosana）3種白芨屬植物的根內(nèi)真菌研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌群落的α多樣性指數(shù)Chao 1分別為94、73、39；Shannon指數(shù)為2.35、1.76、1.89；Simpson指數(shù)為0.26、0.32、0.30。本研究中，管葉槽舌蘭根內(nèi)真菌群落的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于3種白芨屬蘭科植物根內(nèi)真菌群落的多樣性水平，但它們的Chao l指數(shù)要比本研究中管葉槽舌蘭根內(nèi)真菌群落的高。Tan等（2012）基于分離培養(yǎng)和ABI 3730測(cè)序平臺(tái)對(duì)9種野生槽舌蘭屬植物的根內(nèi)生真菌研究發(fā)現(xiàn)，9種野生槽舌蘭屬植物的內(nèi)生真菌Shannon多樣性指數(shù)最高的是在短距槽舌蘭（Holcoglossum flavescens）中（為1.913），野生管葉槽舌蘭Shannon多樣性指數(shù)是0.993 8，最低的是舌唇槽舌蘭（H. lingulatum）（為0.950 3），本研究中的管葉槽舌蘭根內(nèi)真菌群落的Shannon指數(shù)均高于9種野生槽舌蘭屬植物根內(nèi)真菌群落的多樣性水平。通過(guò)分析表明，遷地保育狀態(tài)的管葉槽舌蘭有著與野生管葉槽舌蘭和其他野生蘭科植物相當(dāng)?shù)膬?nèi)生真菌數(shù)量或多樣性水平。

管葉槽舌蘭的根樣中內(nèi)生細(xì)菌共得到1 283個(gè)OTUs、Chao 1指數(shù)為524.492、Shannon指數(shù)為7.103、Simpson指數(shù)為0.976，吳慶珊等（2018）從3個(gè)樣地金釵石斛（Dendrobium nobile）的根莖葉中共分離出1 082株內(nèi)生細(xì)菌，可分為41個(gè)OTUs，共有OTUs有14個(gè)；陳澤斌等（2016）基于16S高通量測(cè)序從白芨中獲得48個(gè)OTU，數(shù)量遠(yuǎn)低于本研究管葉槽舌蘭根內(nèi)細(xì)菌OTUs的數(shù)量。Ou等（2017）采用基于16S rRNA和nifH基因的元基因組焦磷酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)中國(guó)5個(gè)地區(qū)的鐵皮石斛相關(guān)菌群和重氮化菌群進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其OTUs范圍在597～3 023之間，Shannon指數(shù)范圍為4.35～6.49。相比較而言，本研究所得到的管葉槽舌蘭根內(nèi)細(xì)菌OTUs的數(shù)量處于中間水平，Shannon指數(shù)高于鐵皮石斛的Shannon指數(shù)。謝泰祥等（2020）采用高通量測(cè)序技術(shù)分析福州鼓山野生建蘭（Cymbidium ensifolium）根樣內(nèi)生細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，建蘭根內(nèi)細(xì)菌群落的α多樣性Chao 1指數(shù)為700.99、Shannon指數(shù)為6.10、Simpson指數(shù)為0.95，本研究中的管葉槽舌蘭根內(nèi)細(xì)菌群落的Chao l指數(shù)與野生建蘭Chao l指數(shù)相當(dāng)，Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)則是高于建蘭的根內(nèi)細(xì)菌群落。這表明遷地保育狀態(tài)的管葉槽舌蘭有著與其他野生蘭科植物相媲美的內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性水平。

3.3 新鮮樣品與干燥樣品對(duì)研究?jī)?nèi)生菌群落的影響

在處理微生物組樣品時(shí)，如何減少?gòu)臉悠凡杉筋A(yù)處理再到儲(chǔ)存的過(guò)程中原始微生物群落的變化至關(guān)重要（Kim et al.， 2017）。本研究對(duì)比了管葉槽舌蘭新鮮與干燥根樣中內(nèi)生菌群落的變化。從新鮮管葉槽舌蘭注釋到根內(nèi)生真菌有6門(mén)46科51屬共117個(gè)OTUs，注釋到根內(nèi)生細(xì)菌15門(mén)105科178屬共1 283個(gè)OTUs；而經(jīng)硅膠干燥后的管葉槽舌蘭注釋到的根內(nèi)生真菌有6門(mén)88科116屬184個(gè)OTUs，注釋到根內(nèi)生細(xì)菌21門(mén)154科336屬共1 111個(gè)OTUs，新鮮樣品與干燥樣品根部?jī)?nèi)生菌群落物種構(gòu)成相差非常大。對(duì)管葉槽舌蘭新鮮根樣與干燥根樣中內(nèi)生菌群落進(jìn)行α多樣性與β多樣性、共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)等分析發(fā)現(xiàn)，與新鮮根樣相比干燥后的管葉槽舌蘭根內(nèi)生菌群落的OTUs數(shù)量、物種類群及豐度、α多樣性、β多樣性及互作模式均發(fā)生了改變。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在新鮮根樣中的菌根真菌類群如小叢殼科和膠膜菌科，它們?cè)诟稍锔鶚又械南鄬?duì)豐度幾乎為零。在屬水平上，青霉屬、瘤菌根菌屬、Keissleriella及亞隔孢殼屬在干燥后豐度值降低，而枝孢屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、假裸囊菌屬、紅菇屬和鏈格孢屬等在干燥后豐度值增加。差異顯著性物種分析也發(fā)現(xiàn)在兩種采樣處理中具有顯著差異的擔(dān)子菌門(mén)小脆柄菇屬的黃蓋小脆柄菇和子囊菌門(mén)刺盤(pán)孢屬的Colletotrichum tofieldiae僅存在于新鮮管葉槽舌蘭根樣中的內(nèi)生真菌群落。由此推測(cè)，瘤菌根菌屬、鐮刀菌屬、小脆柄菇屬和刺盤(pán)孢屬是管葉槽舌蘭的益生真菌。管葉槽舌蘭菌根真菌在干燥的根樣中豐度下降或消失的原因可能是管葉槽舌蘭的菌根真菌對(duì)宿主有一定的依賴性，健康生長(zhǎng)的管葉槽舌蘭可為其菌根真菌提供養(yǎng)分以供其生長(zhǎng)，而當(dāng)宿主死亡后，這些菌根真菌失去營(yíng)養(yǎng)來(lái)源而逐漸死亡。

在內(nèi)生細(xì)菌方面，馬賽菌屬和Rubrobacter在干燥后豐度值降低，而鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬和分支桿菌屬等經(jīng)干燥后豐度值都明顯增加。這些細(xì)菌可能在干燥環(huán)境中獲得適宜的培養(yǎng)條件從而豐度升高。干燥管葉槽舌蘭根樣的差異顯著性內(nèi)生細(xì)菌類群較為豐富，有拜葉林克氏菌科、黃色桿菌科及慢生根瘤菌屬。新鮮管葉槽舌蘭細(xì)菌群落中差異顯著性細(xì)菌類群是馬賽菌屬。由此推測(cè)，馬賽菌屬、鞘氨醇菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、分支桿菌屬及慢生根瘤菌屬是管葉槽舌蘭的益生細(xì)菌。干燥可能會(huì)引起細(xì)菌脫水，進(jìn)而使細(xì)菌活力下降（Berninger et al.， 2018；Majidzadeh et al.， 2022）。Moreira等（2021）對(duì)乳酸菌（LAB）培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)干燥處理，發(fā)現(xiàn)干燥會(huì)增加乳酸菌細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致培養(yǎng)活力的喪失和細(xì)胞保護(hù)能力的改變。

綜上結(jié)果表明，硅膠干燥的采樣處理會(huì)顯著改變內(nèi)生菌群落OTUs數(shù)量、物種類群及豐度、α多樣性、β多樣性和互作模式，且會(huì)導(dǎo)致根內(nèi)某些關(guān)鍵真菌及細(xì)菌類群尤其是菌根真菌和菌根細(xì)菌的丟失和變化，影響數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性。因此，針對(duì)蘭科植物根樣內(nèi)生菌的研究應(yīng)使用新鮮的根樣。

3.4 管葉槽舌蘭根內(nèi)生細(xì)菌和真菌的比較

本研究的管葉槽舌蘭根樣中內(nèi)生真菌群落的OTUs有117個(gè)，Chao 1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為39.797、0.723和3.070。而內(nèi)生細(xì)菌群落有1 283個(gè)OTUs，Chao l指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為524.492、0.976、7.103。管葉槽舌蘭根樣內(nèi)生細(xì)菌群落的豐富度和多樣性要遠(yuǎn)比內(nèi)生真菌群落的高，內(nèi)生細(xì)菌可能有著遠(yuǎn)比已有認(rèn)知對(duì)管葉槽舌蘭更為重要的作用。蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌與真菌的協(xié)作對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)具有重要意義（張芳芳等，2016），王小明等（2016）把鐵皮石斛中分離得到的真菌和細(xì)菌進(jìn)行組合，對(duì)鐵皮石斛幼苗進(jìn)行真菌+細(xì)菌聯(lián)合接種，與未接種和單獨(dú)接種處理相比，真菌+細(xì)菌組合對(duì)鐵皮石斛幼苗生長(zhǎng)的影響存在顯著差異。張萍（2012）采用平板對(duì)峙法對(duì)鐵皮石斛6株促生內(nèi)生細(xì)菌與8株促生內(nèi)生真菌進(jìn)行促生組合的研究結(jié)果顯示，某些細(xì)菌與真菌組合后處理苗的各個(gè)指標(biāo)均有所提高，與單一接菌的處理苗均形成顯著性差異，特定的真菌或細(xì)菌組合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)或累加效應(yīng)。推測(cè)管葉槽舌蘭根部真菌和細(xì)菌的相互作用可能共同影響管葉槽舌蘭的生長(zhǎng)發(fā)育，其相互作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

管葉槽舌蘭作為一種珍稀瀕危的蘭科植物，根系內(nèi)生菌在管葉槽舌蘭種子萌發(fā)、幼苗形成、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步采用菌根技術(shù)實(shí)現(xiàn)管葉槽舌蘭種質(zhì)保育提供理論基礎(chǔ)，對(duì)管葉槽舌蘭的保護(hù)與生產(chǎn)栽培具有重要意義，同時(shí)，也為蘭科植物內(nèi)生微生物的采樣方法提供參考。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）

收稿日期：? 2022-11-10

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金（32001245）； 深圳市可持續(xù)發(fā)展專項(xiàng)（KCXFZ20211020164200001）; 深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20210324123013037）。

第一作者： 張鎮(zhèn)梁（1997-），碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)，（E-mail）2399308611@qq.com。

*通信作者：? 喬琦，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)生物學(xué)，（E-mail）nxyqiao@163.com。