江連洲 ，王一暢 ，馬依彤 ，劉 軍 ，楊宗瑞 ，郭增旺 ※

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱 150030；2. 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司,德州 253000；3. 克東禹王大豆蛋白食品有限公司,齊齊哈爾 161000）

0 引言

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種由脫脂大豆粕為原料生產(chǎn)的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)90%以上的食品原料[1]，因其具有優(yōu)良的功能性質(zhì)和生理活性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[2]。目前，中國大豆分離蛋白年生產(chǎn)能力已達(dá)70 萬t，總產(chǎn)值突破百億，居世界第一。當(dāng)儲(chǔ)存和運(yùn)輸時(shí)間過長時(shí)，大豆分離蛋白的氧化改變了理化性質(zhì)，導(dǎo)致其加工特性劣變，并最終影響其在食品加工品質(zhì)中的應(yīng)用[3]。脂質(zhì)過氧化會(huì)產(chǎn)生各種活性氧成分物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS），它們已被證實(shí)是導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化的重要因素[4]。一些研究表明，氧化修飾可引起蛋白質(zhì)多肽骨架和氨基酸殘基側(cè)鏈的一系列變化，促進(jìn)二硫鍵的形成并加強(qiáng)蛋白質(zhì)的聚集，暴露后分子內(nèi)的基團(tuán)重組形成低聚物，在疏水性和靜電吸引作用下進(jìn)一步形成大分子聚集體，導(dǎo)致其溶解性和結(jié)構(gòu)柔性降低，進(jìn)而使功能性質(zhì)劣化[5]。且氧化程度越高，蛋白質(zhì)變性越劇烈，其功能特性的變化越明顯。因此，調(diào)控蛋白質(zhì)分子的聚集程度是改善蛋白質(zhì)氧化聚集體功能活性下降的重要解決方式。

目前，許多研究工作都集中在使用物理方法通過加熱、機(jī)械作用等改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和聚集程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)聚集體的調(diào)控。文獻(xiàn)[6]表明，高壓均質(zhì)使蛋白質(zhì)解聚從而提高了蠶豆蛋白質(zhì)的溶解度。文獻(xiàn)[7]表明，超聲處理通過調(diào)控蛋白質(zhì)聚集度的不同導(dǎo)致其不同的理化和功能特性。但是，由于其巨大功率消耗和較低的生產(chǎn)能力，高壓均質(zhì)化和超聲波工藝很難在食品工業(yè)中廣泛使用[8]。微波作為一種物理加工技術(shù)，由于其綠色、高效、簡(jiǎn)單的操作方式，更適合在食品工業(yè)中應(yīng)用[9]。微波改性的機(jī)制主要是因?yàn)榕紭O和離子振動(dòng)生熱，食品物料的帶電性和極性基團(tuán)在微波場(chǎng)下的響應(yīng)不同，會(huì)產(chǎn)生振動(dòng)，旋轉(zhuǎn)，最終表現(xiàn)為微波的靶向加熱，進(jìn)而改變物料的理化和功能性質(zhì)。現(xiàn)有研究表明微波處理能提高蛋白的乳化性、起泡性和交聯(lián)特性等功能特性，同時(shí)微波加熱的特殊效應(yīng)還能夠改變蛋白的構(gòu)象。一方面是因?yàn)槲⒉ń蛔冸妶?chǎng)下蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的帶電基團(tuán)發(fā)生波動(dòng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的電場(chǎng)和靜電相互作用重新分布[9]。另一方面蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)在微波場(chǎng)下的特殊響應(yīng)也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生影響。文獻(xiàn)[10]發(fā)現(xiàn)微波處理有助于形成緊湊的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)剛性和柔性區(qū)域的位置被改變。文獻(xiàn)[11]表明微波誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)極化和非極性基團(tuán)的暴露，蛋白質(zhì)柔性區(qū)域增加，從而使起泡性得到改善。文獻(xiàn)[12]研究表明大米蛋白受到微波處理后其內(nèi)部的游離巰基減少，生成了新的二硫鍵，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)度，進(jìn)而改變大米的加工特性。這些研究均表明微波處理工藝能通過改變蛋白的聚集結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象來改變其功能特性。但是目前，關(guān)于微波對(duì)氧化聚集體的結(jié)構(gòu)和功能活性作用間的關(guān)系，尤其是微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體的影響鮮有報(bào)道。

偶氮二異丁脒鹽酸鹽(2,2′-azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH)是一種具有良好可控性、穩(wěn)定性、重復(fù)性和適用性的自由基引發(fā)劑，因其不含腈基，分解產(chǎn)物無毒，同時(shí)比其他引發(fā)劑分解平穩(wěn)，安全性高。改變AAPH 的濃度可以調(diào)節(jié)導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化的過氧自由基的生成，以模擬蛋白質(zhì)在長期儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的環(huán)境，并獲得類似于實(shí)際儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)难趸鞍踪|(zhì)模型。因此，本研究以大豆蛋白為研究對(duì)象，采用AAPH 構(gòu)建過氧自由基－大豆蛋白氧化體系，模擬工廠儲(chǔ)藏過程中實(shí)際產(chǎn)生的蛋白氧化聚集體，將蛋白氧化聚集體分別進(jìn)行不同時(shí)間的微波改性處理，探究微波處理對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)特性和功能特性的影響，進(jìn)而研究微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體結(jié)構(gòu)的改變與功能特性變化的關(guān)系，以期從分子水平解析微波調(diào)控大豆蛋白氧化聚集體解聚作用機(jī)理，從而為提升大豆蛋白氧化聚集體的功能性質(zhì)以及大豆蛋白產(chǎn)品的開發(fā)和儲(chǔ)藏提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（SPIs 純度94.2%），山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽 (AAPH) 美國Sigma 公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；非轉(zhuǎn)基因一級(jí)大豆油，長春市遼都糧油有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M1-L213B 型微波爐，美的集團(tuán)有限公司；pilot10-15EP 型真空干燥機(jī)，博醫(yī)康公司；Zetasizer Nano ZSP型納米粒度電位儀，馬爾文帕納科技有限公司；Nicolet is50 型傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；F-4 500 型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI 公司。

1.3 樣品制備

參考 CHENG 等[13]的方法，以10 mg/mL 的質(zhì)量濃度把大豆分離蛋白溶解于磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 值7.2）中。避光條件下加入0.5 mmol/L 的AAPH 后恒溫37 ℃水浴處理6 h，然后使用14 000 kDa 透析袋4 ℃透析處理72 h，期間每隔4 h 更換一次去離子水，得到氧化大豆蛋白溶液，經(jīng)過冷凍干燥后制得大豆蛋白氧化聚集體樣品，命名為OSPI。將制得的大豆蛋白氧化聚集體分別在功率為350 W 的條件下進(jìn)行微波處理0、10、20、30、40、50、60、70 s 微波處理后制得7 種不同的微波處理大豆蛋白氧化聚集體樣品，按照微波處理時(shí)間的不同分別命名為WOSPI-10、WOSPI-20、WOSPI-30、WOSPI-40、WOSPI-50、WOSPI-60、WOSPI-70。

1.4 粒徑分布測(cè)定

將樣品用去離子水稀釋為質(zhì)量濃度0.05 g/mL 的蛋白溶液，加入測(cè)量池中，采用納米粒度及Zeta 電位分析儀，設(shè)定參數(shù)為：蛋白質(zhì)折射率等于1.460、分散劑折射率等于1.330，在(25±2) ℃下測(cè)定其粒徑分布特征和蛋白質(zhì)分散指數(shù)。

1.5 濁度測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法,并略加改動(dòng)。將各組樣品采用磷酸鹽緩沖溶液配制成所需的蛋白濃度后，磁力攪拌60 min，采用熒光光度計(jì)測(cè)定600 nm 波長下的吸光度值A(chǔ)，濁度T由式T=1.032×計(jì)算獲得，式中T為濁度，A為吸光度值，V為稀釋倍數(shù)，I為光程（0.001 m）。

1.6 硫磺素T（Th T）熒光檢驗(yàn)分析

將樣品用去離子水配制為10 mg/mL 質(zhì)量濃度樣品溶液。將4 mg 的Th T 溶于250 mL 的pH 值7.2，0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（含3 mmol/L 的NaCl），充分溶解后過0.22 μm 濾膜除去不溶物質(zhì)，制得Th T 溶液。將50 μL的樣品溶液和5 mL 的Th T 溶液充分混勻后以Th T 溶液為對(duì)照，于440 nm 激發(fā)波長，482 nm 發(fā)射波長測(cè)定其熒光強(qiáng)度，狹縫寬度均為5 nm[15-16]。

1.7 傅里葉紅外掃描光譜分析

稱取2 mg 樣品與200 mg 溴化鉀研磨混勻壓片測(cè)定傅里葉紅外掃描光譜，測(cè)定溫度為25 ℃，設(shè)定參數(shù)如下：掃描波數(shù)為4 000～400 cm-1，波數(shù)精度為0.5 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32 次。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Peak Fit 軟件對(duì)酰胺Ⅰ帶1 750～1 550 cm-1波段進(jìn)行分析[17]。

1.8 內(nèi)源性熒光光譜分析

使用RF-7 000 PC 熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品的熒光光譜，將樣品以1 mg/mL 的濃度溶于去離子水中得到樣品溶液，在激發(fā)波長290 nm、發(fā)射波長在300～400 nm、夾縫寬均為5.0 nm 的條件下測(cè)定樣品的內(nèi)源性熒光光譜[18]。

1.9 溶解度測(cè)定

將樣品以1 mg/mL 的濃度溶于去離子水中，再于4 ℃下2 000 r/min 離心15 min 取上清液。以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，使用Lowry 法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量[19]。溶解度的計(jì)算公式為：

式中Ps為樣品蛋白質(zhì)的溶解度，%；C上為上清液中的蛋白質(zhì)含量，mg/mL；C為樣品中的蛋白質(zhì)含量，取1 mg/mL。

1.10 持水性測(cè)定

參考MCCONNELL 等[20]的方法并略作修改。取300 mg樣品溶于30 mL 去離子水中。再于4 ℃下1 500 r/min 離心15 min 取沉淀，測(cè)量其質(zhì)量。持水性的計(jì)算公式為：

式中WHC為樣品的持水性，%；W沉淀為沉淀的質(zhì)量；W為樣品的質(zhì)量，取300 mg。

1.11 持油性測(cè)定

參考LIN 等[21]的方法并略作修改。取100 mg 樣品溶于20 mL 大豆油中，于25 ℃漩渦振蕩15 min 使其充分混勻，再于4 ℃下1 500 r/min 離心15 min 取沉淀，測(cè)量其質(zhì)量。持油性的計(jì)算公式為：

式中OHC為樣品的持油性，%；W沉淀為沉淀的質(zhì)量；W為樣品的質(zhì)量，取100 mg。

1.12 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

參考ZHANG 等[22]的方法并略作修改。將樣品以1 mg/mL的濃度溶于去離子水中，置于4 ℃冰箱中水化12 h 得到樣品溶液。取20 mL 樣品溶液置于100 mL 量筒內(nèi)，使用IKA T18 ULTRA-TURRAX 型高速均質(zhì)機(jī)以12 000 r/min的速度在室溫下均質(zhì)2 min，記錄均質(zhì)結(jié)束后0 min 及10 min時(shí)的泡沫高度（以量筒刻度為準(zhǔn)）。起泡性及泡沫穩(wěn)定性的計(jì)算公式為：

式中FC為樣品的起泡性，%；V0為樣品溶液均質(zhì)結(jié)束后0 min 時(shí)的泡沫高度，mL；V為樣品溶液的體積，mL；FS為樣品的泡沫穩(wěn)定性，%；V30為樣品溶液均質(zhì)結(jié)束后30 min 時(shí)的泡沫高度，mL。

1.13 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

參考KINSELLA 等[23]的方法并略作修改。將樣品以1 mg/mL 的濃度溶于去離子水中，置于4 ℃冰箱中水化12 h 得到樣品溶液。取21 mL 的蛋白溶液與7 mL 的大豆油混合，使用IKA T18 ULTRA-TURRAX 型高速均質(zhì)機(jī)以12 000 r/min 的速度在室溫下均質(zhì)2 min 制得乳液。在乳液制備完成后的0 min 和10 min 時(shí)分別測(cè)定其吸光值。乳化活性和乳化穩(wěn)定性的計(jì)算公式為：

式中EAI為樣品的乳化活性，m2/g；A0為乳液在0 min 時(shí)的吸光度；C蛋白為樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量，取0.001 g/mL；ESI為樣品的乳化穩(wěn)定性，min：A10為乳液在10 min 時(shí)的吸光度；ΔT為兩次取樣的時(shí)間間隔，取10 min。

1.14 激光共聚焦顯微鏡分析

參考殷靜霖等[24]的方法并略作修改。先用異丙醇為溶劑制備1 mg/mL 的耐爾紅染料以及10 mg/mL 的耐爾藍(lán)染料，分別過0.22 μm 濾膜以去除不溶性物質(zhì)。再取1.13 中制得的乳液100 μL 與700 μL 的去離子水混勻后，加入35 μL 的耐爾紅染料、40 μL 的耐爾藍(lán)染料?；靹蚝笥诒芄猸h(huán)境靜置30 min 使其充分染色。使用染色的乳液制備激光共聚焦顯微鏡樣片，在550 nm 下激發(fā)耐爾紅，490 nm 下激發(fā)耐爾藍(lán)，于20×的物鏡觀察并拍攝。

1.15 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 顯著性分析，P＜0.05 為顯著性差異，采用Origin 9 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體粒徑分布的影響

由蛋白質(zhì)的粒徑分布能直觀地從宏觀角度反映物理場(chǎng)作用下蛋白質(zhì)分子中發(fā)生的聚集與解聚現(xiàn)象[25]。微波處理對(duì)氧化大豆分離蛋白平均粒徑的影響見圖1。由圖1可知，與SPI 的粒徑分布相比，經(jīng)過AAPH 氧化處理后的OSPI 粒徑分布變?yōu)槿宸植?，原有粒徑峰均右移并在更大粒徑處形成一個(gè)新的峰。這是因?yàn)榇蠖狗蛛x蛋白的蛋白質(zhì)骨架及側(cè)鏈基團(tuán)受自由基攻擊而附加上側(cè)鏈基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生了交聯(lián)聚集[26]。在微波處理后，WOSPI-10 的粒徑分布變?yōu)殡p峰分布，當(dāng)微波處理時(shí)間達(dá)到40 s 后WOSPI-40、WOSPI-50、WOSPI-60 的粒徑分布呈現(xiàn)出小粒徑峰降低，大粒徑峰右移的趨勢(shì)，在微波處理時(shí)間達(dá)到70 s 時(shí)，WOSPI-70 的雙峰均出現(xiàn)右移。這是因?yàn)槎虝r(shí)間的微波處理能通過電場(chǎng)等非熱效應(yīng)促進(jìn)大豆分離蛋白分子運(yùn)動(dòng)，增加了分子間碰撞發(fā)生概率，使得大豆分離蛋白分子間的非共價(jià)鍵斷裂，原有的大粒徑的氧化聚集體分子解聚為小粒徑的氧化聚集體。而隨著微波處理時(shí)間的逐漸增加，大豆分離蛋白氧化聚集體碰撞加劇，系統(tǒng)內(nèi)熱效應(yīng)增強(qiáng)，誘導(dǎo)已經(jīng)解聚的氧化聚集體分子出現(xiàn)變性，形成了新的化學(xué)鍵，增強(qiáng)了分子間相互作用力，繼而導(dǎo)致聚集體的出現(xiàn)，WOSPI 粒徑增加[27]。

圖1 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體粒徑分布的影響Fig.1 Effects of microwave treatment time on particle size distribution of OSPI (oxidized soybean protein aggregates)

2.2 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體濁度的影響

蛋白質(zhì)溶液的濁度取決于溶質(zhì)即蛋白質(zhì)自身的粒徑大小，兩者呈正相關(guān)，因此常用濁度來表征蛋白質(zhì)的聚集和解離程度[28]。由圖2 可知，與SPI 的濁度相比，經(jīng)過AAPH 氧化處理后的OSPI 的濁度顯著增加（P＜0.05）。這表明氧化處理可能引起蛋白溶液中的大分子氧化聚集體含量升高和粒徑增加。隨著微波處理時(shí)間的增加，WOSPI 的濁度整體上先降低后增加，并在微波處理30 s時(shí)達(dá)到極小值。這是因?yàn)樵诙虝r(shí)的微波處理中，OSPI 主要受電磁場(chǎng)等非熱效應(yīng)的影響，破壞了維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵，大豆分離蛋白分子間的聚合作用被削弱，導(dǎo)致WOSPI 的濁度在前期呈下降趨勢(shì)[29]。然而長時(shí)間的微波處理下，已經(jīng)解離出來的小分子氧化聚集體與原有的大分子氧化聚集體的結(jié)構(gòu)被熱效應(yīng)破壞[30]，暴露了蛋白質(zhì)內(nèi)部基團(tuán)，增加了蛋白質(zhì)分子間的聚合機(jī)會(huì)，形成了大粒徑的大豆蛋白聚集體，最終造成WOSPI 的濁度上升。

圖2 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體濁度的影響Fig.2 Effects of microwave treatment time on turbidity of OSPI

2.3 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體硫黃素T 熒光強(qiáng)度的影響

硫黃素T(Thioflavin T，Th T)能特異性地平行插入纖維狀蛋白聚集體內(nèi)部的分子間反平行β-折疊并與其結(jié)合，其熒光強(qiáng)度可以用來表征蛋白質(zhì)聚集程度的變化。由圖3 可知，與SPI 相比，OSPI 的Th T 熒光強(qiáng)度顯著升高，說明氧化處理顯著增加了大豆分離蛋白中分子間反平行β-折疊結(jié)構(gòu)的含量。這可能是因?yàn)檠趸幚頃?huì)使得蛋白質(zhì)分子通過二硫鍵等共價(jià)鍵的形成，誘導(dǎo)共價(jià)交聯(lián)，繼而通過分子間反平行β-折疊結(jié)構(gòu)形成大分子的氧化聚集體。而經(jīng)過微波處理后，WOSPI 的Th T 熒光強(qiáng)度隨微波處理的時(shí)間整體呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì)。這是因?yàn)槲⒉ㄌ幚硪l(fā)的電場(chǎng)作用等非熱效應(yīng)對(duì)大豆分離蛋白氧化聚集體內(nèi)部的氫鍵產(chǎn)生了作用，部分氫鍵斷開，進(jìn)而使得分子間反平行β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少[31]。當(dāng)微波時(shí)間超過20 s 以后，大豆分離蛋白氧化聚集體發(fā)生變性，蛋白表面的疏水性基團(tuán)等被修飾，在分子間形成了二硫鍵、疏水鍵等，誘導(dǎo)小分子聚集體交聯(lián)締合形成大分子的熱聚集體。而當(dāng)微波處理時(shí)間達(dá)到70 s 時(shí)，Th T 熒光強(qiáng)度的下降可能是因?yàn)槔w維狀聚集體的形成已經(jīng)進(jìn)入穩(wěn)定期，生成速度減緩[32]；同時(shí)熱效應(yīng)過強(qiáng)，誘導(dǎo)進(jìn)一步聚集團(tuán)聚，包埋了部分分子間反平行β-折疊結(jié)構(gòu)，使得Th T 無法與其結(jié)合，兩者共同導(dǎo)致了熒光強(qiáng)度的下降。

圖3 微波處理時(shí)間對(duì)氧化大豆分離蛋白硫黃素T 熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of microwave treatment time on fluorescence intensity of Th T of OSPI

2.4 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

由表1 可知，與SPI 相比，OSPI 的二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化（P＜0.05），蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的減少和無序結(jié)構(gòu)的增加表明氧化處理能破壞蛋白原有結(jié)構(gòu)，通過分子間反平行β-折疊形成氧化聚集體[33]。隨著微波處理時(shí)間的增加，WOSPI 的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而無規(guī)則卷曲和分子間反平行β-折疊結(jié)構(gòu)含量則相反。這是因?yàn)槎虝r(shí)微波處理導(dǎo)致了大豆分離蛋白分子內(nèi)部的偶極分子與極性側(cè)鏈間發(fā)生高頻振蕩，誘導(dǎo)部分氫鍵斷裂，增強(qiáng)了大豆分離蛋白的柔性，誘導(dǎo)了聚集體大分子的破碎。之后處理時(shí)間增加，存在的電場(chǎng)等非熱效應(yīng)的存在使得分子間碰撞機(jī)率大，更容易發(fā)生相互作用連接在一起，加速了自組裝的過程，因而OSPI 內(nèi)的無序結(jié)構(gòu)再次增多。AKKERMANS 等[34]研究也表明，分子間的碰撞幾率增加會(huì)顯著促進(jìn)蛋白聚集體的自組裝。但是當(dāng)微波處理時(shí)間達(dá)到70 s 時(shí)，WOSPI-70 的分子間反平行β-折疊結(jié)構(gòu)開始下降。這可能是因?yàn)榉肿娱g反平行β-折疊結(jié)構(gòu)主要存在于聚集體核心中，而在微波處理帶來的熱效應(yīng)作用下，聚集體形成進(jìn)入穩(wěn)定期，不再產(chǎn)生新的聚集體核心，反而轉(zhuǎn)為聚集體之間的進(jìn)一步聚集[35]。

表1 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of microwave treatment time on secondary structure of OSPI

2.5 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

由圖4 可知，與SPI 相比，OSPI 內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著降低，這說明OSPI 中出現(xiàn)氧化聚集現(xiàn)象[36]。經(jīng)過微波處理后，WOSPI 的內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸降低，最大吸收波長（λmax）先增加后減少，并在30 s 時(shí)達(dá)到極大值。這表明色氨酸殘基發(fā)生了熒光猝滅反應(yīng)，且附近的微環(huán)境極性先增加后降低。這可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚韺?dǎo)致的電場(chǎng)效應(yīng)使得大豆分離蛋白分子間布朗運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，分子間碰撞增加，繼而處于激發(fā)態(tài)的大豆分離蛋白氧化聚集體分子間發(fā)生動(dòng)態(tài)的熒光猝滅效應(yīng)，導(dǎo)致熒光分子出現(xiàn)光度下降的現(xiàn)象；同時(shí)還會(huì)斷開大豆分離蛋白氧化聚集體內(nèi)部的疏水鍵等非共價(jià)鍵，使得內(nèi)部的色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中，進(jìn)而導(dǎo)致λmax出現(xiàn)增加。處理時(shí)間過長時(shí)，大豆分離蛋白氧化聚集體重新交聯(lián)形成大分子的熱聚集體，色氨酸殘基被埋入熱聚集體的內(nèi)部，繼而導(dǎo)致λmax降低。

圖4 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of microwave treatment time on endogenous fluorescence intensity of OSPI

2.6 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體溶解度的影響

溶解度由蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)的性質(zhì)決定，與其起泡性、乳化性等功能性質(zhì)密切相關(guān)[37]。由圖5 可知，與SPI 相比，OSPI 溶解度顯著降低（P＜0.05）。這是因?yàn)樵谧杂苫谘趸^程中攻擊了大豆分離蛋白的主鏈和側(cè)鏈基團(tuán)，形成了不溶性的氧化聚集體。隨著微波處理時(shí)間的增加，WOSPI 的溶解度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。這是由于適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚砜梢酝ㄟ^其非熱效應(yīng)使得蛋白分子極化，在水中高頻振蕩，非共價(jià)作用等被削弱導(dǎo)致結(jié)構(gòu)更松散，從而使水分子容易進(jìn)入蛋白內(nèi)部與其發(fā)生水合，繼而導(dǎo)致溶解度增加。而微波處理時(shí)間進(jìn)一步延長導(dǎo)致熱效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，大量暴露在大豆分離蛋白表面的疏水基團(tuán)相互作用引發(fā)蛋白質(zhì)發(fā)生締合，導(dǎo)致溶解度下降[38]。WANG 等[39]研究也表明，微波處理可以通過電場(chǎng)作用有效提升蛋白質(zhì)的溶解度，但熱效應(yīng)增強(qiáng)則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集形成不溶性組分，進(jìn)而導(dǎo)致溶解度下降。

圖5 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體溶解度的影響Fig.5 Effects of microwave treatment time on solubility of OSPI

2.7 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體持水性的影響

持水性主要受蛋白質(zhì)的構(gòu)象等物理結(jié)構(gòu)變化的影響[40]。由圖6 a 可知，與SPI 相比，經(jīng)AAPH 氧化處理后的OSPI 持水性顯著下降（P＜0.05）。這是因?yàn)檠趸瘯?huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，形成不溶性的氧化聚集體，使得大豆分離蛋白分子剛性增強(qiáng)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致持水性下降。微波處理導(dǎo)致的振蕩效應(yīng)使得大豆分離蛋白分子內(nèi)氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵斷裂，打開了團(tuán)聚的聚集體結(jié)構(gòu)，使得分子舒展，柔性結(jié)構(gòu)舒張，可以有效地吸附水分子。同時(shí)大豆分離蛋白中的β-折疊結(jié)構(gòu)有所增加，水分子更容易嵌入蛋白質(zhì)空隙中，增強(qiáng)了大豆分離蛋白的持水性。之后微波處理時(shí)間延長，熱效應(yīng)誘導(dǎo)小分子聚集體產(chǎn)生熱聚集，繼而形成大分子的不溶性熱聚集體，阻礙了與水分子的接觸，導(dǎo)致了持水性出現(xiàn)下降。鄧芝串等[41]研究表明，微波處理產(chǎn)生的熱效應(yīng)逐漸增加，大豆蛋白隨之出現(xiàn)先展開后聚集的構(gòu)象變化，持水性也出現(xiàn)了類似變化。

圖6 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體持水性及持油性的影響Fig.6 Effects of microwave treatment time on water and oil holding capacity of OSPI

2.8 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體持油性的影響

持油性是指一定重量的干基蛋白樣品對(duì)油脂的保持能力，其作用基礎(chǔ)來自蛋白質(zhì)自身的疏水基團(tuán)[42]。由圖6b可知，與SPI 相比，經(jīng)過AAPH 氧化處理后的OSPI 的持油性顯著下降（P＜0.05）。這是因?yàn)榇蠖狗蛛x蛋白被氧化形成了氧化聚集體，疏水親油性基團(tuán)被包埋，阻礙OSPI與油脂分子結(jié)合。LI 等[43]研究也表明氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的降低而降低持油性。隨著微波處理時(shí)間的增加，WOSPI 的持油性呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，并在30 s 處達(dá)到極大值。這是因?yàn)槎虝r(shí)微波處理中占據(jù)主導(dǎo)地位是非熱效應(yīng)，促進(jìn)大豆分離蛋白氧化聚集體碰撞導(dǎo)致部分解聚，分子內(nèi)氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵斷裂，蛋白結(jié)構(gòu)舒張，使得原本包埋在內(nèi)部的疏水親油性基團(tuán)暴露到蛋白表面，進(jìn)而與更多的油脂吸附結(jié)合。但是隨著微波處理時(shí)間的進(jìn)一步增加，表面的疏水性基團(tuán)通過疏水相互作用發(fā)生交聯(lián)，同時(shí)游離巰基也互相結(jié)合形成了二硫鍵，進(jìn)而形成了大分子的聚集體，疏水基團(tuán)重新包埋分子內(nèi)部，導(dǎo)致不能與油脂充分結(jié)合，降低持油性。

2.9 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

由表2 可知，與SPI 相比，OSPI 起泡性顯著下降，穩(wěn)定性顯著增加（P＜0.05）。這是因?yàn)檠趸^程中的自由基攻擊大豆分離蛋白分子，導(dǎo)致蛋白變性，降低了蛋白柔性，形成了大分子蛋白氧化聚集體，不易在氣-水界面展開導(dǎo)致OSPI 起泡性降低[44-45]。經(jīng)過微波處理后，OSPI 的起泡性隨著微波處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，泡沫穩(wěn)定性整體來看也有相同趨勢(shì)，兩者分別于微波處理30 s 和20 s 處達(dá)到極大值。這是因?yàn)樵谖⒉ǖ淖饔孟?，大豆分離蛋白出現(xiàn)極化現(xiàn)象，內(nèi)部的非共價(jià)鍵被破壞，導(dǎo)致蛋白舒張展開柔性增強(qiáng)，促進(jìn)了氣-水界面的形成；舒張后的蛋白質(zhì)在界面膜上形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也更加穩(wěn)定，所以增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。當(dāng)處理時(shí)間過長時(shí)，熱聚集體的形成導(dǎo)致氣-水界面膜難以形成并維持，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性出現(xiàn)下降。楊文敏等[46]研究表明，在適當(dāng)微波處理巴旦木蛋白后，蛋白結(jié)構(gòu)伸展，更容易和水分子結(jié)合，提高了蛋白的溶解度，促進(jìn)了蛋白向氣-水界面擴(kuò)散，繼而增強(qiáng)了蛋白的起泡性，這與溶解度的變化相一致。

表2 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of microwave treatment time on foaming capacity and foaming stability of OSPI

2.10 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

由表3 可知，OSPI 的乳化活性和乳化穩(wěn)定性比SPI顯著降低（P＜0.05）。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)氧化后降低了分子柔性，使得蛋白質(zhì)與油-水界面難以結(jié)合，無法形成穩(wěn)定的界面膜。隨著微波處理時(shí)間的增加，WOSPI 的乳化活性及穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，分別在微波處理30、20 s 處達(dá)到極大值。研究表明，微波所產(chǎn)生剪切力和振蕩效應(yīng)等導(dǎo)致氧化大豆蛋白聚集體的解聚和去折疊，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸由有序變?yōu)闊o序，分子柔性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的兩親性提高。因此，水-油界面的表面張力降低，從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的乳化特性。結(jié)合前面結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較短時(shí)間內(nèi)微波處理的非熱效應(yīng)使得大豆分離蛋白出現(xiàn)極化現(xiàn)象，破壞了蛋白內(nèi)部的非共價(jià)鍵，一些不穩(wěn)定的氧化結(jié)構(gòu)被打開，使得蛋白的剛性減弱，柔性增強(qiáng)；同時(shí)非共價(jià)鍵斷裂還導(dǎo)致了疏水性增高，促進(jìn)油-水界面的形成，并誘導(dǎo)大豆分離蛋白更容易結(jié)合到油-水界面處吸附油脂并形成膜結(jié)構(gòu)，提升其乳化能力。當(dāng)微波處理時(shí)間繼續(xù)延長，微波處理產(chǎn)生的熱效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，暴露到蛋白質(zhì)表面非極性基團(tuán)增加，在非熱效應(yīng)促進(jìn)的分子碰撞中互相以疏水作用結(jié)合形成了更加致密的不溶性熱聚集體，阻礙了油-水界面的形成，降低了大豆分離蛋白在界面處的展開能力，進(jìn)而導(dǎo)致乳化能力下降。

表3 微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響Table 3 Effects of microwave treatment on emulsifying activity and emulsion stability of OSPI

2.11 微波對(duì)大豆蛋白氧化聚集體乳液微觀形態(tài)的影響

使用尼羅藍(lán)和尼羅紅作為熒光染料分布對(duì)乳液中的蛋白質(zhì)和油脂進(jìn)行染色。由圖7 可知，未經(jīng)微波處理的SPI制成的乳液液滴呈球形，整體分布較為均勻，而OSPI 制備的乳液粒徑顯著增加，出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象。這是因?yàn)檠趸瘜?dǎo)致大豆分離蛋白出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象并形成了一定量的不溶性聚集體，影響了界面膜的形成和穩(wěn)定性，降低了OSPI的乳化能力和乳液均一性。隨處理時(shí)間增加，WOSPI 制備的乳液液滴更小更均一，與粒徑結(jié)果相一致；當(dāng)微波處理時(shí)間超過30 s 后，乳液液滴出現(xiàn)了粒徑增大的絮凝現(xiàn)象，乳液液滴逐漸失去圓形形態(tài)，變?yōu)椴灰?guī)則的大顆粒。這說明適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚砜梢酝ㄟ^振蕩等作用使得大分子的氧化聚集體破碎解聚成小分子聚集體，提升其乳化能力，幫助小分子蛋白聚集體吸附到油-水界面上并形成相對(duì)穩(wěn)定的界面膜，進(jìn)而提升了乳液的均一性。但是當(dāng)微波處理時(shí)間超過30 s 后，WOSPI 乳液出現(xiàn)粒徑增大且逐漸聚集的趨勢(shì)。這說明乳化性正在降低，不能覆蓋原有的油-水界面，可能因?yàn)殚L時(shí)間微波處理帶來的熱效應(yīng)導(dǎo)致了大豆分離蛋白間以二硫鍵、疏水鍵等形成聚集，繼而消耗并包埋了疏水基團(tuán)，導(dǎo)致乳化能力降低，影響乳液穩(wěn)定性和形成不規(guī)則的大分子乳液液滴。TENG 等[47]的研究表明，長時(shí)間微波處理帶來的強(qiáng)熱效應(yīng)使得大豆蛋白形成了大分子聚集體，進(jìn)而導(dǎo)致制備的乳液間也發(fā)生了一定的絮凝，形成了大小不一的乳液液滴。

圖7 微波處理對(duì)大豆蛋白氧化聚集體乳液激光共聚焦顯微鏡圖的影響Fig.7 Effects of microwave treatment on the picture of OSPI emulsion by CLSM

3 結(jié)論

本研究以大豆蛋白為原料，采用偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH）制備大豆蛋白氧化聚集體，然后探討不同時(shí)間的微波處理技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。結(jié)果表明：氧化處理破壞大豆蛋白的結(jié)構(gòu)，暴露其疏水性基團(tuán)，并通過疏水相互作用形成二硫鍵，引起粒徑和濁度增大，形成大分子氧化聚集體，進(jìn)而導(dǎo)致功能活性下降；短時(shí)間（＜30 s）的微波處理可以促進(jìn)大豆蛋白氧化聚集體發(fā)生解聚，引起粒徑和濁度減小，增強(qiáng)了分子柔性，無序結(jié)構(gòu)減少，同時(shí)誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)舒張展開，包埋在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)和帶電基團(tuán)暴露，結(jié)合位點(diǎn)增多，進(jìn)而導(dǎo)致持水性，持油性提高，增強(qiáng)了蛋白的界面性質(zhì)，導(dǎo)致起泡性和乳化活性的提高；而長時(shí)間（＞30 s）的微波處理帶來的熱效應(yīng)增加，會(huì)導(dǎo)致解聚的氧化聚集體通過共價(jià)和非共價(jià)相互作用形成二硫鍵，包埋了表面的疏水性基團(tuán)和帶電基團(tuán)并形成了致密的大分子熱聚集體，阻礙了水分子和油脂分子與大豆蛋白氧化聚集體的結(jié)合，導(dǎo)致其持水性、持油性下降，這也對(duì)大豆蛋白氧化聚集體的乳化性質(zhì)、泡沫性質(zhì)產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響，可為今后的研究中繼續(xù)探討微波作用中熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)分別對(duì)于大豆蛋白的影響提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果闡明了不同微波處理時(shí)間對(duì)大豆蛋白氧化聚集體功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響，為大豆蛋白氧化聚集體功能性質(zhì)的改善及微波在氧化聚集體行為調(diào)控的應(yīng)用方面提供參考。