石永芳，馮靜月，梁梅，肖珍，秦臻（貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

血管老化是指隨著年齡增長而出現(xiàn)血管結(jié)構(gòu)及功能的退行性變化，它所引起的心腦血管疾病是我國老年人群死亡的主要原因之一[1-3]。隨著我國社會老齡化程度的加深，針對血管老化的干預(yù)已迫在眉睫。近年研究[4-6]表明，血管老化與氧化應(yīng)激、端粒及端粒酶功能低下、內(nèi)皮祖細(xì)胞減少、細(xì)胞衰老等多種因素有關(guān)。本課題組前期研究[7-9]表明，中藥黃精可有效降低衰老大鼠的氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)其內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，提高細(xì)胞端粒酶活性，這與抑制細(xì)胞衰老的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——DNA 損傷檢測點ATM 與Rad3 相關(guān)蛋白激酶（ATR）/細(xì)胞周期檢測點激酶1（Chk1）通路的活化密切相關(guān)。由于黃精對血管老化的多種相關(guān)因素均有調(diào)節(jié)作用，故推測其可能具有干預(yù)血管老化的作用。因此，本研究擬觀察黃精對自然衰老模型大鼠老化血管管壁結(jié)構(gòu)及功能的影響，并基于ATR/Chk1 信號通路探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 2 月齡雄性SD 大鼠10 只，SPF 級，體質(zhì)量（247±13）g；18 月齡雄性SD 大鼠40 只，SPF 級，體質(zhì)量（583±17）g。上述動物均購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014，動物質(zhì)量合格證號：430726210100278028。本實驗經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，批文號：1800014。

1.2 藥物及試劑 黃精，購自貴州威寧天露生物科技開發(fā)有限公司，批號：01137009，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院龍慶德教授鑒定為正品。黃精水煎液制備：按每克生藥加飲用水6 mL，浸泡30 min 后煮沸，文火慢煎40 min，趁熱過濾；二煎按每克生藥加水4 mL 煮沸后，煎法同前，合并2 次濾液；60 ℃下水浴濃縮至生藥量為0.5 g·mL-1，置于4 ℃冰箱保存。多聚甲醛，北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：1014A21； 蘇 木 精- 伊 紅（HE）染 液（批 號：CR2103154）、Masson 染液（批號：CR2103039），均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：A015-3-1；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒（批號：BC1195）、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（批號：BC0025）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號：P1200-2）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）、高效RIPA 組織/細(xì)胞裂解液試劑盒（批號：R0010），均購自北京索萊寶科技有限公司；ATR 抗體（批號：13934）、Chk1 抗體（批號：2360）、p53 抗體（批號：32532）、β-actin（批號：4970）、辣根過氧化物標(biāo)記羊抗兔二抗（批號：7074），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；p21 抗體，英國Abcam 公司，批號：109199；GAPDH 抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10494-1-AP；ECL 發(fā)光液，德國Millipore 公司，批號：WBKLS0100；封閉液（批號：P0023B）、一抗稀釋液（批號： P0023A）、 二抗稀釋液（批號：P0023D），均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 AB104-N 型精密分析天平、160323A型酶標(biāo)儀，成都錦世昌祥科技公司；MY-20 型手持式電動勻漿機，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；5810R型臺式冷凍離心機，德國艾本德股份公司；TS100 型倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；Mini-PROTEAN 電泳 系 統(tǒng)、Molecular Imager?Chemi DocTMXR System凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；SLK-O3000-S 型LED 數(shù)顯圓周搖床，美國賽洛捷克公司。

1.4 分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將10 只2 月齡大鼠作為青年組，將40 只18 月齡的自然衰老大鼠按體質(zhì)量隨機分為老年組及黃精低、中、高劑量組（1、2、4 g·kg-1），每組10 只。黃精灌胃劑量按人與動物藥物劑量標(biāo)準(zhǔn)換算，確定大鼠灌胃中劑量為2 g·kg-1，以中劑量的0.5、2 倍作為低、高劑量[7]。灌胃體積為10 mL·kg-1，每天給藥1 次，持續(xù)給藥12 周；青年組和老年組給予等量蒸餾水灌胃。末次灌胃后禁食12 h，頸椎脫臼處死大鼠，迅速打開腹腔；取出主動脈，生理鹽水洗凈，濾紙吸干；取主動脈弓部分血管浸于4%多聚甲醛溶液中固定，其余主動脈置于-80 ℃冰箱備用。

1.5 主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察 用4%多聚甲醛溶液固定主動脈30 min 后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制成5 μm 厚切片，行常規(guī)HE 染色和Masson 染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠主動脈組織病理形態(tài)學(xué)變化，并利用Image-Pro Plus 顯微圖像處理系統(tǒng)測量血管壁中膜平滑肌細(xì)胞（SMC）和膠原纖維（CF）的絕對面積，計算不同著色面積與測試區(qū)域整體面積之比，得出SMC 和CF 在中膜的相對含量（%）。

1.6 微量法檢測主動脈中T-AOC、GSH-Px 活性及MDA 含量 稱取約0.1 g 主動脈組織，加入1 mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿，4 ℃下以8 000×g離心10 min 后取上清，BCA 法測定蛋白含量。然后按試劑盒說明書步驟操作，采用微量法分別檢測T-AOC、GSH-Px活性和MDA 含量。

1.7 Western Blot 法檢測主動脈中ATR、Chk1、p53及p21 蛋白表達(dá)水平 取各組大鼠主動脈組織約20 mg，加入含有PMSF 的RIPA 裂解液，勻漿后在4 ℃下以12 000 r·min-1（離心半徑6 cm）離心15 min，取上清，采用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液及RIPA 裂解液調(diào)整蛋白濃度，上樣量為40 μg 蛋白；經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜后，用封閉液封閉2 h；加入一抗ATR（1∶1 000）、Chk1（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p21（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）后，于4 ℃下孵育過夜；加入二抗（1∶3 000）后在室溫下孵育2 h；采用超敏ECL 顯色液顯影并掃描。以GAPDH 或β-actin 為內(nèi)參，采用ImageJ 軟件分析條帶灰度值，并對目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃精對衰老大鼠主動脈結(jié)構(gòu)的影響 結(jié)果見圖1。與青年組比較，老年組大鼠的主動脈內(nèi)膜出現(xiàn)損傷且不光滑，可見泡沫細(xì)胞浸潤，中膜細(xì)胞排列紊亂，彈力膜扭曲、斷裂、結(jié)構(gòu)不完整且明顯增厚。與老年組比較，黃精各劑量組大鼠的主動脈內(nèi)膜較為連續(xù)平整，損傷程度較輕，彈力膜結(jié)構(gòu)較完整，扭曲、斷裂現(xiàn)象較少出現(xiàn)，中膜增厚不明顯。結(jié)果表明，黃精能改善衰老大鼠主動脈的結(jié)構(gòu)病理變化，起到延緩血管老化的作用。

圖1 黃精對衰老大鼠主動脈結(jié)構(gòu)的影響（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Polygonati Rhizoma on aortic structure of aging rats（HE staining，×200）

2.2 黃精對衰老大鼠主動脈SMC、CF 的影響 結(jié)果見圖2、表1。與青年組比較，老年組大鼠主動脈膠原染色區(qū)域明顯增多，SMC、CF 相對含量顯著升高（P＜0.01）；與老年組比較，黃精各劑量組大鼠主動脈膠原染色區(qū)域減少，SMC、CF 相對含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，黃精可降低衰老大鼠主動脈的SMC 及CF 相對含量。

表1 黃精對衰老大鼠主動脈中平滑肌細(xì)胞（SMC）和膠原纖維（CF）的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells（SMC）and collagenous fibers（CF）in aorta of aging rats（±s，n=3）

表1 黃精對衰老大鼠主動脈中平滑肌細(xì)胞（SMC）和膠原纖維（CF）的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells（SMC）and collagenous fibers（CF）in aorta of aging rats（±s，n=3）

注：與青年組比較，**P＜0.01；與老年組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

CF 相對含量/%22.35±1.14 32.09±1.16**28.30±0.83##27.56±1.85##25.61±0.93##組別青年組老年組黃精低劑量組黃精中劑量組黃精高劑量組劑量/（g·kg-1）--124 SMC 相對含量/%25.22±0.75 33.67±0.72**31.68±0.67#30.91±1.68##28.91±0.84##

圖2 黃精對衰老大鼠主動脈中平滑肌細(xì)胞和膠原纖維的影響（Masson 染色，×200）Figure 2 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells and coll agenous fibers in aorta of aging rats（Masson staining，×200）

2.3 黃精對衰老大鼠主動脈中T-AOC、GSH-Px活性及MDA 含量的影響 結(jié)果見圖3。與青年組比較，老年組大鼠主動脈中T-AOC、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.01）， MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與老年組比較，黃精中、高劑量組大鼠主動脈中的T-AOC、GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.01），MDA 含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，黃精可能通過提高T-AOC、GSH-Px 活性，降低MDA 含量來緩解衰老大鼠主動脈的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖3 黃精對衰老大鼠主動脈中T-AOC、GSH-Px 活性及MDA 含量的影響（±s，n=3）Figure 3 Effects of Polygonati Rhizoma on T-AOC and GSH-PX activity and MDA content in aorta of aging rats（±s，n=3）

2.4 黃精對衰老大鼠主動脈中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖4。與青年組比較，老年組大鼠主動脈中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與老年組比較，黃精中、高劑量組大鼠主動脈中ATR、Chk1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），黃精高劑量組大鼠主動脈中p53 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），黃精低、中、高劑量組大鼠主動脈中p21 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，黃精可能通過調(diào)節(jié)ATR/Chk1 信號通路來延緩衰老大鼠的血管老化。

圖4 黃精對衰老大鼠主動脈中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 4 Effects of Polygonati Rhizoma on the protein expressions of ATR，Chk1，p53 and p21 in aorta of aging rats（±s，n=3）

3 討論

血管老化引起的動脈供血功能降低會引發(fā)多器官的逐步衰退，提示血管老化可能是生物機體衰老的關(guān)鍵啟動因素[10]，若能有效干預(yù)血管老化，對降低心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。中藥黃精具有抗衰老作用，《名醫(yī)別錄》記載了黃精能“補中益氣，除風(fēng)濕、安五臟，久服輕身延年不饑”。近年來關(guān)于黃精抗衰老的藥理學(xué)研究主要集中在提高免疫功能[11]、保護(hù)心臟[12]、改善腎功能及認(rèn)知功能障礙等方面[13-15]，關(guān)于黃精對血管老化干預(yù)方面的研究少有報道。因此，本研究分別從組織病理、氧化應(yīng)激等多方面檢測了主動脈中可直接或間接反映血管老化的指標(biāo)，探討了黃精干預(yù)自然衰老大鼠血管老化的可能機制。

隨著年齡的增加，血管在形態(tài)和功能上會出現(xiàn)衰老變化，可見內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞（SMC）形態(tài)學(xué)異常，膠原增加，彈力纖維減少、斷裂等[16]。其中，SMC 增殖導(dǎo)致的血管壁增厚是血管老化的特征之一，主要體現(xiàn)在內(nèi)膜和中膜層厚度的變化[17-18]。本研究觀察了自然衰老大鼠主動脈的病理形態(tài)學(xué)變化，HE 染色結(jié)果表明，老年組大鼠的主動脈出現(xiàn)內(nèi)膜和中膜明顯增厚，SMC 排列紊亂，彈力膜疏松、厚薄不均且斷裂；經(jīng)黃精干預(yù)后，大鼠主動脈內(nèi)膜和中膜增厚不明顯，SMC 排列整齊、規(guī)則，彈力膜疏松、厚薄不均、斷裂現(xiàn)象較少出現(xiàn)。Masson 染色結(jié)果顯示，老年組大鼠主動脈SMC 和膠原纖維（CF）相對含量明顯增多，經(jīng)黃精干預(yù)后SMC 和CF 相對含量明顯減少。本實驗結(jié)果從血管形態(tài)學(xué)方面證實了黃精能夠改善衰老大鼠的血管老化。

氧化應(yīng)激在血管老化過程中起著關(guān)鍵作用，T-AOC、GSH-Px、MDA 是氧化應(yīng)激反應(yīng)酶或產(chǎn)物的變化指標(biāo)，可在一定水平上反映血管老化的程度[4，19]?？寡趸窽-AOC 和GSH-Px 是機體清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的重要物質(zhì)，是反映機體或者器官（組織）抗氧化能力的重要參數(shù)，也能反映機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的變化[20]。T-AOC 代表體內(nèi)酶性和非酶性抗氧化物的能力，可綜合反映機體內(nèi)的抗氧化酶活力和抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)；GSH-Px 可有效清除自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，減輕細(xì)胞受損程度。MDA 是氧自由基引發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其含量高低可間接反映細(xì)胞的損傷程度。本研究表明，老年組大鼠主動脈氧化應(yīng)激水平明顯增高，經(jīng)黃精干預(yù)后，大鼠主動脈的T-AOC、GSH-Px 活性明顯升高，MDA 含量明顯降低。表明黃精能提高衰老大鼠主動脈的總抗氧化能力，并抑制氧自由基對衰老大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化損傷程度，降低血管氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而延緩血管老化的發(fā)生。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管組織DNA 損傷的主要原因之一[21]。為了避免將損傷的基因組傳遞給子細(xì)胞，正常機體內(nèi)具有一套高度保守的DNA 損傷修復(fù)機制。DNA 損傷會激活細(xì)胞周期DNA 損傷檢測點，使細(xì)胞周期停滯，從而給予DNA 充足的時間進(jìn)行修復(fù)，或在損傷不可修復(fù)的情況下使細(xì)胞死亡。從G1 期結(jié)束到S 期、G2 期，對細(xì)胞周期的控制主要由ATR/Chk1通路介導(dǎo)[22]。DNA 損傷發(fā)生后，ATR 聚集于損傷部位并被激活，其下游的Chk1 隨之激活，而Chk1 能激活p53 及其下游基因p21，使細(xì)胞周期停滯，以利于DNA 損傷的修復(fù)。然而，當(dāng)ATR 被過度激活或發(fā)生突變時，細(xì)胞周期檢測點功能失調(diào)，進(jìn)而影響到基因組的穩(wěn)定性，使細(xì)胞周期過度阻滯，引起細(xì)胞增殖出現(xiàn)不可逆的停滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老[23]。本研究結(jié)果顯示，老年組大鼠主動脈ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達(dá)顯著升高；經(jīng)黃精干預(yù)后，大鼠主動脈ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達(dá)均明顯降低。結(jié)果表明，血管老化涉及到血管組織DNA 損傷檢測點ATR/Chk1 通路的過度激活，而黃精可能通過抑制ATR/Chk1 通路的活化來延緩血管老化。

綜上所述，黃精可延緩自然衰老大鼠的血管老化，可能與其增強血管抗氧化應(yīng)激能力，抑制ATR/Chk1 通路的活化，從而減輕DNA 損傷應(yīng)答有關(guān)。