劉 衍 梁，張 愛 均，王 含 雪，葉 冬 雪，4，5，6，孟 兆 青，田 景 振，，陶 凱，張 良 棕，容 蓉，4，劉 孝云，4，5，6，楊勇，4，5，6（.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 濟(jì)南 25003；3. 山東肺康中醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，山東 濟(jì)南 25000；4. 中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250355；5. 中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250355；6. 山東省中醫(yī)藥抗病毒工程研究中心，山東 濟(jì)南 250355）

自2019 年12 月以來，由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒感染（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情在全球范圍內(nèi)蔓延，抗擊新冠仍是一場(chǎng)持久戰(zhàn)，且目前大部分抗SARS-CoV-2的藥物仍處于研發(fā)階段。3C 樣蛋白酶（3C-like protease， 3CLpro）和 木 瓜 樣 蛋 白 酶（papain-like protease，PLP）在SARS-CoV-2 的復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用[1-2]，是抗SARS-CoV-2 藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。

中醫(yī)藥全程參與我國此次COVID-19 的防治工作，并取得顯著效果，在此次疫情中彰顯了中醫(yī)藥的特色與優(yōu)勢(shì)，中藥的療效和作用機(jī)制值得深入研究。金貝口服液是在國家名老中醫(yī)陶凱先生的臨床經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上研制而成，在2003 年的SARS 流行期間已應(yīng)用于臨床患者的救治。該制劑由黃芪、黨參、北沙參等十二味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、祛瘀化痰等作用。目前已有臨床數(shù)據(jù)[3]證明，在COVID-19 常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，加服金貝口服液，較僅使用常規(guī)治療可縮短患者核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間，縮短乏力、咳嗽癥狀消失時(shí)間，縮短COVID-19 患者治療天數(shù)。這表明了金貝口服液治療COVID-19 的有效性，但其具體作用機(jī)制仍不明。

本研究擬將開展金貝口服液體外抗SARS-CoV-2的活性評(píng)價(jià)，以及對(duì)3CLpro 和PLP 酶活的抑制作用研究，結(jié)合分子對(duì)接預(yù)測(cè)發(fā)揮抑制3CLpro 和PLP 的潛在有效成分，以助于闡明金貝口服液治療COVID-19的作用機(jī)制，為其在臨床科學(xué)合理地干預(yù)COVID-19提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株及病毒株 Vero 細(xì)胞和SARS-CoV-2，均由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所保存。本研究中體外抗SARS-CoV-2 實(shí)驗(yàn)部分由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所完成。

1.2 藥物及主要試劑 金貝口服液，山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：2002001；3CLpro 熒光底物Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans、PLP 熒 光 底物Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC，南京肽業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)分別為：njp22208、njp22182；胎牛血清，上海逍鵬生物科技有限公司，批號(hào)：2244289；DMEM 高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶，美國Gibco 公司，批號(hào)分別為：C11995500CP、2445464；磷酸鹽緩沖液（PBS），北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G4202；CCK-8 試劑盒，美國MedChemExpress公司，批號(hào)：HY-K0301；綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、丹酚酸B、漢黃芩苷、漢黃芩素，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110753-201716、111810-201707、 110715-201821、 111562-201716、112002-201702、111514-201605；新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C、原兒茶醛，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：17062003、17061401、17121201、18070401、17060708；甘 草酸，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：102574；乙腈、甲醇，美國Fisher 公司，批號(hào)分別為：A9984、205308；其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器 AKTA prime Plus 蛋白純化儀，美國Cytiva 公司；SynergyNeo2 多功能酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；HFsafe-1200LC 生物安全柜，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；XS105 十萬分之一天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Agilent 1290 超高效液相色譜儀，美國Agilent 公司。

2 方法

根據(jù)金貝口服液在不同濃度下的細(xì)胞存活率，并采用GraphPad Prism 8.0 軟件計(jì)算金貝口服液的半數(shù)毒性濃度CC50。

2.2 金貝口服液體外抗SARS-CoV-2 實(shí)驗(yàn) 在96 孔板上接種Vero 細(xì)胞（1×104個(gè)/孔），置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液。每孔加入100 μL 濃度為10 μL·mL-1的金貝口服液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（無病毒與藥物）和陰性對(duì)照組（無藥物）；作用1 h 后每孔再加入100 TCID50 SARS-CoV-2，繼續(xù)作用1 h；棄去96 孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液。每孔加入100 μL 含金貝口服液（濃度為10 μL·mL-1）的2% DMEM，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 d，光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），藥物孔及對(duì)照孔均為3 個(gè)復(fù)孔。

用蝕斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證金貝口服液抗SARS-CoV-2 的效果。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：在24 孔板上接種Vero 細(xì)胞（2×105個(gè)/孔），置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。當(dāng)細(xì)胞融合度約90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液。不同濃度的金貝口服液（10、5、3.3、2.5 μL·mL-1）與SARS-CoV-2 一起加入細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（無藥物只感染SARS-CoV-2）。將板在37 °C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，每20 min 搖晃培養(yǎng)板1 次。隨后加入2% DMEM 配制的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖。于37 °C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，用4%甲醛固定細(xì)胞并用0.2%結(jié)晶紫染色。最后用去離子水沖洗培養(yǎng)板，記錄各組的蝕斑數(shù)量。根據(jù)不同藥物濃度下蝕斑減少的數(shù)量計(jì)算藥物的抑制率。

2.3 金貝口服液對(duì)3CLpro 活性的抑制實(shí)驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)前期建立的基于3CLpro 活性的高通量藥物篩選體系，測(cè)定不同濃度的金貝口服液對(duì)3CLpro 活性的抑制效果。用DMSO 將金貝口服液從10 μL·mL-1開始進(jìn)行2 倍稀釋，共6 個(gè)梯度（10，5，2.5，1.25，0.63，0.31 μL·mL-1），計(jì)算其在不同濃度下的抑制率，并采用GraphPad Prism 8.0 軟件計(jì)算金貝口服液對(duì)3CLpro 的半數(shù)有效抑制濃度IC50。

2.4 金貝口服液對(duì)PLP 活性的抑制實(shí)驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)前期建立的基于PLP 活性的高通量藥物篩選體系，測(cè)定金貝口服液對(duì)PLP 活性的抑制效果。將其從50 μL·mL-1開始進(jìn)行2 倍稀釋，共6 個(gè)梯度（50，25，12.5，6.25，3.13，1.56 μL·mL-1），計(jì)算其在不同濃度下的抑制率，并采用GraphPad Prism 8.0 軟件計(jì)算金貝口服液對(duì)PLP 的半數(shù)有效抑制濃度IC50。

2.5 金貝口服液成分鑒定

2.5.1 色譜條件設(shè)置 色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）；柱溫：25 ℃；流速：0.2 mL·min-1；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸水溶液，洗脫條件：0～2.7 min，4% 乙腈；2.7～6.6 min，4%～7% 乙腈；6.6～20.6 min，7%～14% 乙腈；20.6～30.7 min，14%～20% 乙腈；30.7～43.9 min，20%～30% 乙腈；43.9～54.3 min，30%～50% 乙腈；54.3～64 min，50%～70%乙腈。

2.5.2 對(duì)照品溶液、供試品溶液、單味藥材對(duì)照溶液及缺味陰性對(duì)照溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋至1 mL，制成混合對(duì)照品溶液。其中，新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、黃芩苷、丹酚酸B、漢黃芩苷、甘草酸和漢黃芩素的濃度分別為45.16、10.42、63.51、22.20、29.35、17.58、28.60、82.79、23.95、37.92、34.97、10.50 μg·mL-1。

分別精密量取10 個(gè)批次的金貝口服液（批號(hào)：1708001、1708002、1708003、1906001、1906002、1906003、2001001、2001002、2001003 和2002001）各20 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50% 色譜甲醇60 mL，稱定質(zhì)量，超聲（300 W，40 kHz）處理30 min，放至室溫，補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

按照金貝口服液生產(chǎn)工藝規(guī)程分別制備黃芪、北沙參、丹參等12 種單味藥材制劑樣品，并按照供試品溶液的制備方法，分別制成單味藥材對(duì)照溶液。

按照金貝口服液生產(chǎn)工藝規(guī)程分別制備黃芪、北沙參、丹參、金銀花、黃芩、川貝母、清半夏、甘草、川芎、當(dāng)歸、川芎-當(dāng)歸、黨參、甘草、連翹等13 種缺味制劑樣品，并按照供試品溶液的制備方法，分別制成缺味陰性對(duì)照溶液。

2.5.3 方法學(xué)考察（完整性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性） 取金貝口服液（批號(hào)：2002001）供試品溶液，按照“2.5.1”中色譜條件進(jìn)樣，64 min 后，將流動(dòng)相（乙腈-0.2% 磷酸水溶液）比例從70%∶30% 逐漸升至95%∶5%，并持續(xù)運(yùn)行120 min，得到完整性數(shù)據(jù)。同一供試品溶液分別在0、4、8、12、24 h 測(cè)定，以22 號(hào)峰為參照峰（S 峰），計(jì)算各個(gè)化合物含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）值，得到樣品穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在24 h 內(nèi)對(duì)同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，以22 號(hào)峰為S 峰，分別計(jì)算各個(gè)化合物的RSD 值，得到精密度數(shù)據(jù)；平行制備6 份樣品溶液并分別測(cè)定，以22 號(hào)峰為S 峰，計(jì)算各個(gè)化合物含量的RSD 值，得到重復(fù)性數(shù)據(jù)。

2.5.4 金貝口服液成分的定性分析 取10 批金貝口服液供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。將10 批金貝口服液的指紋圖譜以AIA 格式導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 年版）》軟件，以金貝口服液（批號(hào)：2002001）指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.3 min，以此確定10 批金貝口服液的共有峰。

分別精密吸取金貝口服液供試品溶液（批號(hào)：2002001）、混合對(duì)照品溶液、空白溶液（甲醇），按照“2.5.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣，通過色譜峰保留時(shí)間和紫外光譜信息對(duì)比確認(rèn)特征峰。

2.5.5 金貝口服液成分歸屬分析 為確定各個(gè)共有峰的歸屬，分別取金銀花、丹參、連翹等單味藥材對(duì)照溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。通過保留時(shí)間和紫外光譜信息對(duì)比，對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬分析。

為進(jìn)一步驗(yàn)證共有峰歸屬結(jié)果，分別取金銀花、丹參、連翹等缺味陰性對(duì)照溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.6 金貝口服液成分的分子對(duì)接 對(duì)金貝口服液中鑒定出的12 個(gè)成分進(jìn)行分子對(duì)接。從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載12 個(gè)化學(xué)成分的二維結(jié)構(gòu)，并以“SDF”格式保存。使用Chem 3D 將“SDF”格式轉(zhuǎn)換為mol2 結(jié)構(gòu)作為小分子配體。從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中分別檢索出靶點(diǎn)SARS-CoV-2 3CLpro（PDB ID：6LZE）和PLP（PDB ID：7CJM）的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板，并以“PDB”格式保存為蛋白質(zhì)受體。使用PyMOL 軟件（2.3.6 版）去除水分子，并從核心目標(biāo)蛋白中分離出原始配體。處理后的蛋白質(zhì)目標(biāo)被導(dǎo)入AutoDock 軟件（4.2.0 版）進(jìn)行氫化、計(jì)算總電荷和設(shè)置原子類型。配體和蛋白質(zhì)受體以PDBQT 格式記錄。用AutoDock-Vina 軟件（1.1.2 版）進(jìn)行分子對(duì)接，以評(píng)估受體-配體復(fù)合物的親和力，并給出綜合評(píng)分。

3 結(jié)果

3.1 金貝口服液體外抗SARS-CoV-2 效果 為了在體外研究金貝口服液抗SARS-CoV-2 的效果，首先測(cè)定不同濃度的金貝口服液對(duì)Vero 細(xì)胞的毒性。在受試期內(nèi)，陰性對(duì)照組及藥物組細(xì)胞均為正常狀態(tài)。金貝口服液最高終濃度為10 μL·mL-1時(shí)，未觀察到明顯的細(xì)胞毒性。因此，金貝口服液對(duì)藥物的最大無毒濃度大于10 μL·mL-1（圖1-A）。

圖1 金貝口服液對(duì)SARS-CoV-2 的抑制效果Figure 1 Inhibitory effect for Jinbei Oral Liquid on SARS-CoV-2

選擇無毒濃度的金貝口服液（10 μL·mL-1）進(jìn)行其抗SARS-CoV-2 效果的研究。首先用觀察CPE 的方法，研究金貝口服液抑制SARS-CoV-2 的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金貝口服液在終濃度為10 μL·mL-1時(shí)，可以抑制約50% 的由SARS-CoV-2 導(dǎo)致的細(xì)胞病變（表1），說明金貝口服液對(duì)SARS-CoV-2 有一定的抑制效果。

表1 終濃度10 μL·mL-1 的金貝口服液對(duì)SARS-CoV-2 致細(xì)胞病變的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of 10 μL·mL-1 of Jinbei Oral Liquid on cytopathy induced by SARS-CoV-2

進(jìn)一步用蝕斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證金貝口服液抑制SARS-CoV-2 的效果。不同濃度的金貝口服液與SARS-CoV-2 一起孵育感染細(xì)胞，3 d 后，記錄蝕斑數(shù)量。根據(jù)藥物組減少的蝕斑數(shù)量計(jì)算金貝口服液的抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)金貝口服液終濃度為10、5、3.3、2.5 μL·mL-1時(shí)，其對(duì)SARS-CoV-2 的抑制率分別為28.57%、22.86%、14.29%、8.57%（圖1-B），說明金貝口服液對(duì)SARS-CoV-2 具有一定的抑制效果，且呈劑量依賴性。

3.2 金貝口服液對(duì)3CLpro 活性的抑制效果 3CLpro為SARS-CoV-2 復(fù)制過程中的關(guān)鍵蛋白酶，為了進(jìn)一步研究金貝口服液抗SARS-CoV-2 的作用機(jī)制，首先選擇3CLpro 作為藥物靶點(diǎn)，利用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的基于3CLpro 活性的高通量藥物篩選體系，評(píng)價(jià)不同濃度的金貝口服液對(duì)3CLpro 活性的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)金貝口服液終濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.313 μL·mL-1時(shí)，1 h 內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加值大約分別為3 700、8 500、16 000、21 000、24 000、27 000（圖2-A）。經(jīng)計(jì)算，不同濃度的金貝口服液對(duì)3CLpro 的抑制率分別為（87.105±0.685）%、（70.040±0.686）% 、（44.587±1.069）% 、（24.834±0.908）%、（14.233±0.519）%和（4.029±0.507）%，說明金貝口服液對(duì)3CLpro 活性有良好的抑制作用，且呈現(xiàn)藥物劑量依賴的關(guān)系。通過擬合計(jì)算，得出金貝口 服 液 對(duì)3CLpro 的IC50為（2.757±0.082）μL·mL-1（圖2-B）。

圖2 金貝口服液對(duì)3CLpro 的抑制效果Figure 2 Inhibitory effect for Jinbei Oral Liquid on 3CLpro

3.3 金貝口服液對(duì)PLP 活性的抑制效果 為了進(jìn)一步研究金貝口服液抗SARS-CoV-2 的作用機(jī)制，選擇在SARS-CoV-2 復(fù)制過程中的另一關(guān)鍵蛋白酶PLP 作為藥物靶點(diǎn)，利用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的基于PLP 活性的高通量藥物篩選體系，評(píng)價(jià)不同濃度的金貝口服液對(duì)PLP 活性的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)金貝口服液終濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 μL·mL-1時(shí)，1 h 內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加值大約分別為-1 300、700、5 000、9 000、15 000、18 000、26 000（圖3-A）。經(jīng)計(jì)算不同濃度的金貝口服液對(duì)PLP 的抑制率分別為（105.058±1.101）%、（97.483±0.568）% 、（80.182±0.885）% 、（65.291±4.811）% 、（43.820±0.148）%、（30.776±0.533）%，說明金貝口服液對(duì)PLP 活性有良好的抑制作用，且呈現(xiàn)藥物劑量依賴的關(guān)系（圖3-B）。通過擬合計(jì)算，得出金貝口服液對(duì)PLP 的IC50為（3.527±0.188）μL·mL-1。

圖3 金貝口服液對(duì)木瓜樣蛋白酶（PLP）的抑制效果Figure 3 Inhibitory effect for Jinbei Oral Liquid on PLP

3.4 金貝口服液的成分分析 為了進(jìn)一步闡明金貝口服液抗SARS-CoV-2 的作用機(jī)制，采用超高效液相色譜（ultraperformance liquid chromatography，UPLC）對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分分析，以確定其化學(xué)組成。

首先對(duì)UPLC 的色譜條件進(jìn)行方法學(xué)考察，包括完整性、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性試驗(yàn)。完整性試驗(yàn)結(jié)果顯示，64 min 后基本無其他色譜峰出現(xiàn)，說明在64 min 內(nèi)，本方法已將供試品的信息最大化體現(xiàn)。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均不高于0.35%；相對(duì)峰面積的RSD 均不高于1.43%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液各成分較穩(wěn)定。精密度試驗(yàn)顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均不高于0.12%，相對(duì)峰面積的RSD 均不高于1.29%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均不高于0.08%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于0.54%，表明本方法重復(fù)性良好。以上結(jié)果均符合指紋圖譜分析要求，該色譜條件可用。

隨后，對(duì)10 批金貝口服液供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，確定其共有峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有28 個(gè)共有峰（圖4-A），并生成對(duì)照指紋圖譜共有模式（圖4-B）。在各色譜峰中，22 號(hào)峰的峰形好、峰面積較大、分離度良好，故選作S 峰。

圖4 不同批次金貝口服液共有峰的確認(rèn)Figure 4 Confirmation of the common peaks in different batches of Jinbei Oral Liquid

隨后繼續(xù)對(duì)共有峰進(jìn)行定性分析，將供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、空白溶液（甲醇）的色譜峰保留時(shí)間和紫外光譜信息進(jìn)行對(duì)比，最終鑒定出12 個(gè)成分，8 號(hào)峰為新綠原酸、9 號(hào)峰為原兒茶醛、11 號(hào)峰為綠原酸、12 號(hào)峰為隱綠原酸、18 號(hào)峰為連翹酯苷A、19 號(hào)峰為異綠原酸B、21 號(hào)峰為異綠原酸C、22 號(hào)峰為黃芩苷、23 號(hào)峰為丹酚酸B、26 號(hào)峰為漢黃芩苷、27 號(hào)峰為甘草酸、28 號(hào)峰為漢黃芩素（圖5）。

圖5 金貝口服液共有峰的定性分析Figure 5 Qualitative analysis of the common peaks of Jinbei Oral Liquid

根據(jù)單味藥材對(duì)照溶液，對(duì)鑒定出的12 個(gè)特征峰進(jìn)行歸屬分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：8、11 和12 號(hào)峰歸屬于金銀花、川芎；9 號(hào)峰歸屬于丹參、金銀花；18 號(hào)峰歸屬于連翹；19 和21 號(hào)峰歸屬于金銀花；22、26和28 號(hào)峰歸屬于黃芩；23 號(hào)峰歸屬于丹參；27 號(hào)峰歸性于甘草（圖6-A）。為進(jìn)一步驗(yàn)證此歸屬結(jié)果，對(duì)缺味陰性對(duì)照溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果與上述研究結(jié)論一致（圖6-B）。

圖6 金貝口服液共有峰的歸屬分析Figure 6 Attribution analysis of common peaks of Jinbei Oral Liquid

3.5 金貝口服液的12 種成分的分子對(duì)接 為進(jìn)一步闡明金貝口服液抗SARS-CoV-2 的作用機(jī)制，對(duì)UPLC 指認(rèn)的金貝口服液的12 種成分分別與3CLpro和PLP 進(jìn)行分子對(duì)接。通常認(rèn)為配體與蛋白受體結(jié)合形成穩(wěn)定構(gòu)象時(shí)的結(jié)合能越低，二者越契合，發(fā)生作用的可能性越大，故可以分子對(duì)接score 值為指標(biāo)，評(píng)估關(guān)鍵活性化合物與3CLpro 和PLP 的結(jié)合能力。一般認(rèn)為，結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1表示兩者可以結(jié)合，≤-7.0 kcal·mol-1表示兩者有較好的結(jié)合能力[4]。分子對(duì)接結(jié)果表明連翹酯苷A、黃芩苷、丹酚酸B、漢黃芩苷、漢黃芩素、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B 與3CLpro 和PLP 均有較好的結(jié)合能力（表2），很有可能是金貝口服液抗SARS-CoV-2 的有效成分。

表2 金貝口服液中的12 種成分與SARS-CoV-2 3CLpro、PLP 的結(jié)合能Table 2 Binding energy of 12 components in Jinbei Oral Liquid with SARS-CoV-2 3CLpro and PLP

4 討論

COVID-19 影響著人類生命健康，其病原體SARS-CoV-2 復(fù)制所必需的蛋白酶3CLpro 和PLP 是目前廣譜抗冠狀病毒藥物研發(fā)的關(guān)鍵靶標(biāo)。中醫(yī)藥在此次COVID-19 的防治中發(fā)揮了重要作用，已有研究[5-6]表明有較多中草藥提取物及天然產(chǎn)物對(duì)SARS-CoV-2 3CLpro 和PLP 具有很好的抑制作用，這對(duì)于廣譜抗冠狀病毒候選藥物的開發(fā)具有重要價(jià)值與意義。

金貝口服液是來源于臨床經(jīng)驗(yàn)方的中藥口服液，最初主要用于治療感冒咳嗽、氣管炎和支氣管炎等上呼吸道常見疾病。目前已有臨床數(shù)據(jù)[3]證實(shí)金貝口服液能夠有效治療COVID-19，但其作用機(jī)制不明。本研究發(fā)現(xiàn)金貝口服液在體外能抑制SARS-CoV-2復(fù)制，并對(duì)SARS-CoV-2 的重要蛋白酶3CLpro 和PLP 具有較強(qiáng)的抑制作用。因此，我們合理推測(cè)金貝口服液可能通過抑制3CLpro 和PLP 活性，發(fā)揮其抗SARS-CoV-2 的作用。

隨后，本研究采用UPLC 方法對(duì)金貝口服液的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，共完成12 個(gè)成分的指認(rèn)與歸屬分析。與傳統(tǒng)的高效液相色譜比較，UPLC 具有更高的分離度、靈敏度、更大的信息量[7]。這12 個(gè)成分與3CLpro、PLP 的分子對(duì)接結(jié)果顯示連翹酯苷A、黃芩苷、丹酚酸B、漢黃芩苷、漢黃芩素、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B 與3CLpro 和PLP 均有較好的結(jié)合能力，且這些化學(xué)成分口服生物利用度（OB）均大于30%，類藥性（DL）均大于0.18。并且目前已有文獻(xiàn)報(bào)道黃芩苷[8]、綠原酸、連翹酯苷A[9]可抑制3CLpro 活性，故我們合理推測(cè)這些成分能夠直接作用于3CLpro 和PLP，阻止病毒增殖，從而使金貝口服液發(fā)揮抗SARS-CoV-2 的作用。此外，丹酚酸B 可以通過阻止病毒融合抑制SARS-CoV-2 感染靶細(xì)胞[10]；甘草酸可以有效抑制SARS-CoV-2 S-RBD與ACE2 的相互作用[11]，從而抑制病毒侵入細(xì)胞。這可能是金貝口服液能夠抑制SARS-CoV-2 活性的原因之一。

一項(xiàng)關(guān)于新冠病者感染的臨床中醫(yī)證候文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析及證候規(guī)律總結(jié)的研究[12]顯示，肺脾氣虛、氣陰兩虛證是新冠病毒感染所致出現(xiàn)頻數(shù)最多的證型，而金貝口服液還具有益氣養(yǎng)陰的功效，這表明金貝口服液不僅可以直接抑制SARS-CoV-2 來發(fā)揮藥效，還可作為對(duì)癥治療藥物，具備作為COVID-19 臨床用藥的較大潛力。