李 藝 霍路曼* 胡 劍 鄭百芹 李愛軍 董李學 張思宇 龐學良*

（1．唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北 唐山 063000；2．農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)評價與營養(yǎng)健康重點實驗室，河北 唐山 063000；3．唐山市動物疫病預防控制中心，河北 唐山 063000）

嘔吐毒素（DON）是動物飼料中常見的真菌毒素之一，因其分子結(jié)構(gòu)為雪腐鐮刀菌烯醇的4-脫氧衍生物，又被稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）。目前，在米、面、油中均不同程度地檢出DON[1]。糧食飼料作為動物主要的食物來源，其品質(zhì)直接影響畜禽產(chǎn)品質(zhì)量。據(jù)調(diào)查，每年大約有25%的飼料因貯存、運輸不當受到不同程度的霉菌毒素污染[2-3]。

研究表明，飼料中DON污染較普遍[4-6]。當動物攝入了被DON污染的飼料后，會抑制腸道吸收，降低腸道功能，從而導致動物免疫力下降，食欲減退，甚至造成死亡[7-9]。1998 年，在國際癌癥研究機構(gòu)公布的評價報告中，DON 被列為3 類致癌物。Trenholm 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當DON 含量在0～14 mg/kg，每增加1 mg/kg，豬的采食量降低6%，當含量達到10 mg/kg 以上時，豬出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。

我國《飼料衛(wèi)生標準》（GB 13078—2017）中對飼料產(chǎn)品DON限量值有著嚴格的規(guī)定，其中犢牛、羔羊、泌乳期精料補充料要求DON含量≤1 mg/kg，其他精料補充料要求DON含量≤3 mg/kg，豬配合飼料要求DON含量≤1 mg/kg，其他配合飼料要求DON 含量≤3 mg/kg[11]。目前，檢測飼料中DON常用的國標方法為《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》（GB/T 30956—2014），該方法檢測時間長、成本高。隨著檢測儀器的不斷升級，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因具有分析范圍廣、檢測限低和靈敏度高等特點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測行業(yè)[12]。

本研究針對飼料中DON檢測方法時間長、成本高的問題，建立一種基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測定飼料中DON的方法，以期能夠達到短時間、大批量飼料樣本檢測，提高試驗效率，節(jié)省檢測成本的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

G6470B超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫公司），KN-026S 渦旋振蕩器（北京科德諾思技術(shù)有限公司），KQ-800KDB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），離心機、JJ200A電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），有機微孔濾膜（0.22 μm），嘔吐毒素免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司），真菌毒素凈化柱（北京科德諾思技術(shù)有限公司）。

嘔吐毒素標準物質(zhì)（100 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司），飼料樣品購自河北省唐山市。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制

準確移取100 mg/L 的嘔吐毒素（DON）標準物質(zhì)1.00 mL于10 mL容量瓶中，使用乙腈定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的標準溶液，有效期一個月。

1.2.2 標準工作液的配制

使用時，使用空白基質(zhì)溶液將標準溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L的標準工作液，于4 ℃冰箱保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 樣品前處理

稱取飼料樣品2.00 g 于50 mL 離心管中，加入DON標準溶液（外標法），加入10 mL 超純水，3 000 r/min 振蕩20 min，超聲提取10 min，8 000 r/min離心10 min，取上層清液，使用真菌毒素凈化柱去除雜質(zhì)，過0.22 μm的有機微孔濾膜，濾液供LC-MS/MS測定。

1.2.4 精密度測定

稱取2 g 飼料樣品，添加水平分別為0.01、0.05、0.10 μg/kg，每個濃度做3次平行，計算精密度。

式中：RSD為相對標準偏差；S為標準偏差；xˉ為算數(shù)平均值；xi為樣品測定值；n為樣品重復測定次數(shù)。

1.2.5 回收率測定

在飼料樣品中，添加DON 標準溶液，添加水平為0.01、0.05、0.1 μg/kg，每個水平做3 次平行，每個平行重復6次，計算回收率。

式中：c0為回收濃度（μg/kg）；c1為樣品添加濃度（μg/kg）。

1.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件為C18 色譜柱（100 mm ×2.1 mm）、柱溫40 ℃、流速0.30 mL/min、進樣體積5 μL；流動相A 為0.1%甲酸水，流動相B 為乙腈。流動相度洗脫時間見表1。

表1 流動相梯度洗脫時間

質(zhì)譜條件為ESI 正離子掃描模式，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速7 L/min，噴嘴電壓500 V，毛細管電壓3 500 V，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min，霧化氣45 psi，其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 DON質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

0.01 mg/L DON標準溶液定性離子與定量離子色譜結(jié)果見圖1。由圖1 可知，按照1.3 設(shè)定的超高效液相色譜與質(zhì)譜條件，通過分析，DON 在1.69 min 峰形良好，出峰附近無任何雜峰干擾，是理想的色譜檢測方法。

圖1 0．01 mg/L DON標準溶液定性離子與定量離子色譜結(jié)果

2.2 定量分析

經(jīng)調(diào)研與檢測發(fā)現(xiàn)，飼料樣品中大多含有嘔吐毒素。進行加標試驗前，為保證試驗的準確性，對多批次飼料樣品進行檢測篩選，選取空白樣品作為試驗基質(zhì)，空白飼料樣品DON色譜結(jié)果見圖2。

圖2 空白飼料樣品DON色譜結(jié)果

使用空白基質(zhì)溶液，配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10 μg/L 的標準工作液，標準曲線見圖3，加標樣品色譜結(jié)果見圖4。

圖3 DON標準曲線

圖4 加標樣品色譜圖

取空白飼料樣品，添加一定量的DON標準溶液，使其添加水平分別為0.01、0.05、0.10 μg/kg，每個添加水平做6個平行樣品，連續(xù)重復3 d，計算樣品回收率與相對標準偏差。本研究以DON 回收率80%～120%、相對標準偏差小于10%時的最小添加濃度為定量限，DON的回收率及精密度結(jié)果見表3。兩種檢測方法相關(guān)參數(shù)對比見表4。

表3 嘔吐毒素的回收率及精密度

表4 兩種檢測方法相關(guān)參數(shù)對比

由圖3、表3和表4可知，DON在飼料樣品中線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 0～0.999 9 范圍內(nèi)，得到的回收率在83.92%～94.65%之間，RSD 值在6.35%～7.09%之間，檢出限為0.01 μg/kg，符合檢測要求。與《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》（GB/T 30956—2014）相比，檢測時間由250 min縮短至44 min，檢測成本由300 元/批降低至160 元/批。定量限由0.10 mg/kg降低至0.01 mg/kg。

2.3 實際樣品測定

采用試驗方法測定216批飼料樣品，其中有194批樣品不同程度地檢出DON，但均不超國家限量標準（≤1 000 μg/kg），檢出率為89.81%，檢出最大值為578.2 μg/kg，見表5、圖5。

圖5 216批飼料樣品嘔吐毒素分布柱形圖

表5 216批飼料樣品檢測結(jié)果單位：μg/kg

由圖5可知，大部分飼料中含有DON，DON 含量在0～100 μg/kg 有136 批，100～200 μg/kg 有41 批，200～300 μg/kg有11批，300～400 μg/kg有4批，400～500 μg/kg有2批。

2.4 提取溶液的選擇（見圖6～圖8）

圖6 提取液為0．2%甲酸乙腈為時的色譜結(jié)果

圖7 提取液為乙腈水（84∶16）時的色譜結(jié)果

圖8 提取液為純水時的色譜結(jié)果

為了驗證不同提取溶液對提取效果的影響，試驗采用同一方法進行試驗，只改變提取溶液種類。由圖6、圖7、圖8 可知，當提取溶液中加入部分超純水后，回收率要高于提取液全部為乙腈，當提取溶劑全部為超純水時，響應(yīng)強度最高、峰形最好、回收率最高。

免疫親和柱和真菌毒素凈化柱等不同固相萃取小柱對嘔吐毒素提取效果的影響見表6。由表6可知，當提取溶劑為超純水時，免疫親和柱回收率為90.53%，凈化柱回收率為88.75%，兩者回收率相差不大，但從檢測成本分析，真菌毒素凈化柱要低于免疫親和柱。

表6 不同固相萃取小柱對DON提取效果的影響 單位：%

3 討論

施琦等[13]使用乙腈水（4∶1）為提取溶劑，建立了蝦飼料中DON液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，檢出限12.63 μg/kg。張大偉等[14]以50%乙腈水溶液為提取溶劑，建立了飼料中DON液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，檢出限為2 μg/kg。符金華等[15]使用乙腈-水-乙酸溶液（70∶29∶1）作為提取溶劑，建立飼料中DON液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。范志辰等[16]使用5 mL水和5 mL含1%甲酸的乙腈溶液作為提取液，建立了飼料中DON檢測方法，檢出限為20 μg/kg。

本試驗對比了酸化乙腈、乙腈水和純水等不同溶液作為提取溶劑時對飼料中嘔吐毒素提取效果的影響，以添加水平為0.01 μg/kg 的回收率為判定依據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當提取溶液中加入部分超純水后回收率要高于提取液全部為乙腈時的回收率，當提取溶劑全部為超純水時，響應(yīng)強度最高、峰形最好、回收率最高，這可能與嘔吐毒素屬于醇類物質(zhì)，易溶于水有關(guān)。本試驗表明，免疫親和柱回收率要高于真菌毒素凈化柱，但相差不大，真菌毒素凈化柱比免疫親和柱低140元/批。

4 結(jié)論

本研究基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)合優(yōu)化的前處理與上機條件，建立了一種操作簡單、檢測時間短、成本低、準確性高、實用性強的飼料中嘔吐毒素快速定量檢測技術(shù)，為進行大規(guī)模飼料監(jiān)測提供了參考。