徐全飛 牛宇 潘保華 蒙秋霞 馮婉君 聶建軍

摘??? 要：為了充分利用和開(kāi)發(fā)山西云丘山野生木耳種質(zhì)資源，以從山西云丘山的柳木上采集、分離、純化到的野生木耳菌株為供試材料（YM²27），對(duì)該菌株生物學(xué)特性進(jìn)行研究。以菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)勢(shì)、色澤、菌落形態(tài)和菌絲日平均生長(zhǎng)速度為指標(biāo)，研究了不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、pH和培養(yǎng)溫度對(duì)該野生木耳菌絲生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：供試菌株YM²27最適宜菌絲生長(zhǎng)的碳源是麥芽糖，最適氮源是蛋白胨和酵母粉，最適無(wú)機(jī)鹽是磷酸二氫鉀，最適宜 pH范圍在6.5～7.5之間，該野生木耳菌株菌絲在17～29 ℃之間均可快速生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，菌絲濃密、潔白、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、菌落完整、生長(zhǎng)速度最快。木耳的種質(zhì)資源是育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，有效收集、評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用種質(zhì)資源對(duì)山西省木耳產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

關(guān)鍵詞：野生木耳：碳源：氮源：無(wú)機(jī)鹽：培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)：S646.6???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.07.010

Study on Biological Characteristics of Wild Auricularia auricula Stains in Mount Yun， Shanxi Province

XU Quanfei1， NIU Yu1， PAN Baohua1， MENG Qiuxia2， FENG Wanjun1， NIE Jianjun1

（1. College of Agricultural Economics and Management， Shanxi Agricultural University， Taiyuan， Shanxi 030006，China; 2.College of Resources and Environment，Shanxi Agricultural University， Taiyuan， Shanxi 030031， China）

Abstract： In order to fully utilize and develop the wild Auricularia auricular germplasm resources in Mount Yun， Shanxi Province， this article used wild Auricularia auricular strain（YM²27） as the test material to study its biological characteristics，which was collected， isolated， and purified from willow trees in Mount Yun， Shanxi Province. The morphology， growth potential， color， and average daily growth rate of and the colony morphology were used as evaluation indexes to investigate the effects of different carbon source， nitrogen source， inorganic salt， pH and culture temperature on mycelial growth of the isolate on solid medium. The results showed that the optimal carbon source for mycelial growth of YM²27 was maltose ， the optimal nitrogen sources were peptone and yeast powder ， the optimal inorganic salt was potassium dihydrogen phosphate ， and the optimal pH was 6.5-7.5. While the mycelia of YM²27 could grow fast at the culture temperature of 17-29 ℃， they grew the fastest and were dense， white at 25 ℃， showing stronger growth potential and forming complete colony. Germplasm resource is the base of breeding. Therefore the collection， evaluation， protection and utilization of the germplasm resource is of great significance to the healthy development of the Auricularia auricular industry in Shanxi Province.

Key words： Wild Auricularia auricular; carbon resource; nitrogen resource; inorganic salt; culture conditions

黑木耳[Auricularia auricula（L.ex Hook.）Underw][1]，口感鮮美，質(zhì)地脆嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，而且含有多糖、維生素K、纖維素酶、黑色素等活性成分，是一種重要的食藥用真菌[2]，也是我國(guó)主要栽培的食用菌之一[3]。山西省黑木耳主栽品種大多引自于東北[4]，實(shí)際生產(chǎn)中存在出芽不整齊、菌種轉(zhuǎn)接次數(shù)過(guò)多導(dǎo)致活性退化和栽培產(chǎn)量、品質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題[5-6]。因此，充分發(fā)掘當(dāng)?shù)氐哪径吧Y源，可作為黑木耳種質(zhì)創(chuàng)制和品種選育的重要來(lái)源。目前，山西野生黑木耳開(kāi)發(fā)利用相關(guān)研究主要集中在種質(zhì)資源的收集、鑒定和生物學(xué)試驗(yàn)階段中[7]，還未見(jiàn)關(guān)于云丘山野生木耳馴化的相關(guān)報(bào)道。本研究于2021年7月下旬，從山西省臨汾市云丘山的柳樹(shù)倒木上采集到供試野生菌株，經(jīng)鑒定為黑木耳，該野生菌株子實(shí)體厚而富有彈性、膠質(zhì)、半透明，初期呈碗狀，后耳片伸展為耳狀或淺圓盤狀，紅褐色，背面絨毛較短且密集，干后棕褐色至黑色，質(zhì)地脆質(zhì)。該野生木耳菌株子實(shí)體性狀優(yōu)良，通過(guò)對(duì)該野生菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，旨在為該菌株馴化栽培、開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

木耳菌株采自于山西省臨汾市云丘山，采用組織分離法[2]獲得該菌株，轉(zhuǎn)接到PDA試管培養(yǎng)基上，進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得純菌株，再挑選菌絲潔白、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、菌落邊緣整齊的菌株作為供試菌株，現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)YM²27。

1.2 供試培養(yǎng)基配方

①組織分離培養(yǎng)基[馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉培養(yǎng)基（PDA）]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH值為7。

②菌種活化培養(yǎng)基[馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（CPDA）]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O1.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

③供試碳源培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蛋白胨3 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL和供試碳源。供試碳源分別為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和甘露醇，均為20 g，以空白碳源為對(duì)照。

④供試氮源培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O1.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL和供試氮源。供試氮源分別為蛋白胨、豆粉、酵母粉、麩皮、硝酸銨和尿素，均為2 g，以空白氮源為對(duì)照。

⑤供試無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL和供試無(wú)機(jī)鹽。供試無(wú)機(jī)鹽分別為KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、NaCl和CuSO4，均為3 g，以空白無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照。

⑥供試pH培養(yǎng)基：在超凈工作臺(tái)上用1.0 mol·L-1的HCL溶液和1.0 mol·L-1 NaOH的溶液調(diào)配PDA平板培養(yǎng)基的pH，分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 活化供試菌株 從菌種保藏柜中取出供試菌株，常溫下放置14 h，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作[8]，轉(zhuǎn)接到CPDA平皿培養(yǎng)基上，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1周[9]，作為供試菌株進(jìn)行以下試驗(yàn)。

1.3.2 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、pH篩選試驗(yàn) 在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌操作，在活化后的供試培養(yǎng)基上，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的菌絲，用已滅菌的打孔器（直徑5 mm）取出，分別轉(zhuǎn)接到供試碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和pH平板培養(yǎng)基中央，放置到25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)，2 d后菌絲萌發(fā)開(kāi)始生長(zhǎng)，按照十字劃線法用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄菌落直徑，觀察記錄菌絲的形態(tài)、色澤、生長(zhǎng)勢(shì)和菌落形態(tài)，每個(gè)處理重復(fù)3次，取數(shù)據(jù)的平均值。菌絲日均生長(zhǎng)速度計(jì)算公式如下：

式中，R表示菌落直徑（mm）；D表示菌絲培養(yǎng)天數(shù)；V表示菌絲生長(zhǎng)速度[10-11]。

1.3.3 生長(zhǎng)溫度試驗(yàn) 將供試菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基內(nèi)，分別置于9、13、17、21、25、29 ℃條件下避光培養(yǎng)，觀測(cè)記錄菌絲的生長(zhǎng)速度、色澤、長(zhǎng)勢(shì)和菌落形態(tài)，每個(gè)處理重復(fù)3次，取數(shù)據(jù)的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Microsofe Excel 2007，相關(guān)分析使用 SPSS19.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)該菌株菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表1可知，以空白碳源為對(duì)照不同碳源對(duì)該野生木耳菌絲體形態(tài)、生長(zhǎng)勢(shì)、平均日生長(zhǎng)速度等均不同。從菌絲生長(zhǎng)速度看，以蔗糖為碳源時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，其次是麥芽糖培養(yǎng)基，經(jīng)方差分析可知，兩者差異不顯著，葡萄糖、果糖和乳糖培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)速度較快，它們之間差異不明顯，甘露醇培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)速度較慢，空白培養(yǎng)基絲生長(zhǎng)速度最慢；在葡萄糖、麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲體濃密，其次是蔗糖、乳糖培養(yǎng)基；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲體潔白，其次是果糖、乳糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基；在葡萄糖、麥芽糖和乳糖培養(yǎng)基菌絲體生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，蔗糖培養(yǎng)基菌絲體生長(zhǎng)勢(shì)一般，對(duì)照培養(yǎng)基菌絲體生長(zhǎng)勢(shì)最弱，葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和對(duì)照培養(yǎng)基菌落邊緣整齊。綜合分析，該野生木耳菌株最佳碳源是麥芽糖，其次是葡萄糖。

2.2 不同氮源對(duì)該菌株菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表2可知，CK培養(yǎng)基上菌絲體稀疏、灰白色，生長(zhǎng)勢(shì)弱、菌落邊緣不整齊，平均生長(zhǎng)速度慢；其次是豆粉培養(yǎng)基，菌絲體濃密、潔白、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、菌絲生長(zhǎng)速度較快；麩皮培養(yǎng)基上，菌絲體密、乳白色、生長(zhǎng)勢(shì)一般、菌落邊緣整齊、菌絲平均生長(zhǎng)速度慢；硝酸銨培養(yǎng)基菌絲體稀疏、灰白、長(zhǎng)勢(shì)弱、菌落邊緣不整齊、菌絲生長(zhǎng)慢；尿素培養(yǎng)基只有少量菌絲萌發(fā)，后期不生長(zhǎng)；蛋白胨、酵母粉培養(yǎng)基菌絲體致密、潔白、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、菌落邊緣整齊、平均生長(zhǎng)速度快，兩者之間菌絲平均日生長(zhǎng)速度經(jīng)方差分析差異不顯著。綜合評(píng)定，蛋白胨或酵母粉為該菌株的最佳氮源。2.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)該菌株菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表3可知，在以空白無(wú)機(jī)鹽對(duì)照，野生木耳菌株在不同無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上，菌絲體形態(tài)、色澤、生長(zhǎng)勢(shì)、菌落邊緣形態(tài)，以及平均日生長(zhǎng)速度都有所不同，磷酸二氫鉀培養(yǎng)基上菌絲體濃密、潔白、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、平均日生長(zhǎng)速度最快（4.18 mm·d-1），其次是硫酸亞鐵上菌絲體長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、濃密、潔白、菌絲長(zhǎng)速較快；在硫酸鎂和氯化鈉培養(yǎng)基上，菌絲體密、生長(zhǎng)勢(shì)一般、菌絲長(zhǎng)速較快；在硫酸銅培養(yǎng)基上只有少量萌發(fā)菌絲，后期不生長(zhǎng)。綜合評(píng)定，該野生木耳菌株的最適宜無(wú)機(jī)鹽是磷酸二氫鉀，其次是硫酸亞鐵，硫酸銅不適宜作為該菌株的無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行添加。

2.4不同pH對(duì)該菌株菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表4可知，野生木耳菌株在pH 5.0～8.5之間均能生長(zhǎng)，在pH 6.5～7.5之間菌絲體潔白、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、菌絲平均日生長(zhǎng)速度快，經(jīng)方差分析可知，其差異不顯著；其次pH為 6.0時(shí)，菌絲體密、潔白、生長(zhǎng)勢(shì)一般，平均生長(zhǎng)速度較快；當(dāng)培養(yǎng)基pH為8.5和5.0時(shí)，該野生木耳菌株菌絲體稀疏、色澤灰白、長(zhǎng)勢(shì)弱，培養(yǎng)基pH為8.5菌絲生長(zhǎng)速度最慢為2.45 mm·d-1。因此，該菌株最適宜pH范圍是6.5～7.5之間。

2.5 不同溫度對(duì)該菌株菌絲生長(zhǎng)速度的影響

不同溫度處理該野生木耳菌絲平均生長(zhǎng)速度不同，如圖1所示。該菌株菌絲在9～29 ℃之間均可生長(zhǎng)，在9～17 ℃之間菌絲生長(zhǎng)較為緩慢，在17～25 ℃之間菌絲快速生長(zhǎng)，25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快達(dá)4.73 mm·d-1，25～29 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)開(kāi)始速度逐漸減慢，且菌絲長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?。因此，該菌株菌絲最適宜生長(zhǎng)溫度為25 ℃。

3 討論與結(jié)論

山西省呂梁山脈擁有豐富的野生木耳種質(zhì)資源，在夏、秋季節(jié)生長(zhǎng)在櫟、槐、柳等多種闊葉樹(shù)腐木上，單生或群生，但是有關(guān)馴化利用的較少，實(shí)際生長(zhǎng)中，引進(jìn)的菌種又存在諸多的弊端，有必要選擇性狀優(yōu)良的野生木耳菌株進(jìn)行馴化栽培研究，豐富木耳的育種材料。本研究以采自山西省臨汾市云丘山上的野生木耳菌株為材料，通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了野生木耳菌株菌絲生長(zhǎng)的最適碳源是麥芽糖，最適氮源是蛋白胨和酵母粉，最適無(wú)機(jī)鹽是磷酸二氫鉀。與其他研究結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同地域野生木耳菌株生物學(xué)特性存在一定差異。聶建軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，褐黃木耳最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是酵母浸膏；張曉宇等[13]研究發(fā)現(xiàn)，脆木耳最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是牛肉粉；楊杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳菌株最佳碳源是甘露醇，最佳氮源是酵母粉。本研究中，硝酸銨不利于該菌株菌絲的生長(zhǎng)。王敬等[15]研究表明，4個(gè)木耳屬野生菌株氮源利用最差的是硝酸銨，與本研究相符。試驗(yàn)中尿素不適合作為該菌株的氮源，菌絲只萌發(fā)不生長(zhǎng)，筆者研究姑射山毛木耳的試驗(yàn)結(jié)果也表明，尿素對(duì)菌絲也有明顯的抑制生長(zhǎng)作用，與本研究結(jié)論一致。不同木耳菌株的菌絲對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)吸收利用存在一定差異，這可能與菌株生長(zhǎng)的氣候環(huán)境有關(guān)。因此，只有明確該野生木耳菌株的生物學(xué)特性，才有利于進(jìn)一步馴化研究。

在pH和溫度篩選試驗(yàn)中，該菌株最適宜pH在6.5～7.5之間，pH為5.5～6.5之間培養(yǎng)的菌絲也可以較快的生長(zhǎng)，pH為8.5時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度明顯減慢，說(shuō)明該菌株耐酸不耐堿；該菌株最適宜生長(zhǎng)溫度為25 ℃，菌絲在17～29 ℃之間均可快速生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌株對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣，是該菌株的一個(gè)優(yōu)良性狀，接下來(lái)應(yīng)進(jìn)一步研究該菌株子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)溫度的要求。

本研究明確了該野生木耳菌株對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、pH和溫度的不同要求。該野生木耳菌株的最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是蛋白胨和酵母粉，最佳無(wú)機(jī)鹽是磷酸二氫鉀，最適宜pH為6.5～7.5，最適宜生長(zhǎng)溫度為25 ℃。

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