摘要：對(duì)酵母在醬油發(fā)酵過程中的自溶現(xiàn)象及對(duì)成品醬油風(fēng)味的影響進(jìn)行了研究，醬油理化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。細(xì)胞數(shù)變化結(jié)果表明，20%鹽度發(fā)酵時(shí)，酵母生長(zhǎng)速度最慢，死亡率最高，達(dá)到72.9%；而16%和12%鹽度發(fā)酵組死亡率分別為61.7%、52.8%。染色圖片表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)胞結(jié)構(gòu)均受到不同程度的破壞，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色。風(fēng)味分析實(shí)驗(yàn)表明，20%鹽度發(fā)酵組細(xì)胞自溶加速，同時(shí)過度抑制酵母生長(zhǎng)，不利于醬油風(fēng)味的形成，12%鹽度發(fā)酵組酵母細(xì)胞數(shù)量最高，其酸類物質(zhì)含量也明顯高于其他兩組，過多的酸類物質(zhì)會(huì)使醬油產(chǎn)生不良?xì)馕?，影響醬油的感官品質(zhì)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，16%鹽度發(fā)酵組有利于醬油的發(fā)酵以及醬油綜合風(fēng)味的形成。

關(guān)鍵詞：醬油；魯氏接合酵母；自溶；風(fēng)味

中圖分類號(hào)：TS264.21? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）07-0014-06

Abstract： The autolysis phenomenon of yeast in the fermentation process of soy sauce and its effect on the flavor of finished soy sauce product are studied. The physical and chemical indexes of soy sauce are all in the normal range. The results of cell number changes show that when fermenting at 20% salinity， the yeast growth speed is the slowest and the mortality rate is the highest， reaching 72.9%， while the mortality rates of the 16% and 12% salinity fermentation groups are 61.7% and 52.8% respectively. The staining images show that the cell structure is damaged to varying degrees as the fermentation goes on， showing a distinct blue color. The flavor analysis experiment shows that cell autolysis of 20% salinity fermentation group accelerates. At the same time， the growth of yeast is excessively inhibited， which is not conducive to the formation of soy sauce flavor. The 12% salinity fermentation group has the largest number of yeast cells， and its acids' content is also significantly higher than that of the other two groups. Excessive acids will make soy sauce have bad flavor and affect the sensory quality of soy sauce. The comprehensive experiment results show that the 16% salinity fermentation group is more conducive to the fermentation of soy sauce and the formation of comprehensive flavor of soy sauce.

Key words： soy sauce; Zygosaccharomyces rouxii; autolysis; flavor

醬油是起源于我國(guó)的一種調(diào)味品，主要以富含蛋白質(zhì)和淀粉的大豆、小麥等為原料，經(jīng)預(yù)處理、制曲、發(fā)酵、壓榨等工序生產(chǎn)出來的一種香氣獨(dú)特、滋味鮮美的調(diào)味品，并且由于營(yíng)養(yǎng)豐富，對(duì)機(jī)體有一定的功效而逐漸被西方國(guó)家接受[1-2]。

酵母菌是應(yīng)用最早的一類微生物，從醬醪中分離出的酵母菌有7個(gè)屬，32個(gè)種，其中球擬酵母、魯氏接合酵母等與醬油質(zhì)量、風(fēng)味的形成密切相關(guān)[3]。

自溶現(xiàn)象（autolysis）在1875年被Salkowski發(fā)現(xiàn)并命名，解釋為隨著細(xì)胞的死亡而發(fā)生的一種胞內(nèi)大分子在多種水解酶的作用下分解為小分子物質(zhì)的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象通常發(fā)生在穩(wěn)定期后期，是一種自發(fā)的、全局化、不可逆的細(xì)胞代謝反應(yīng)[4-5]。而微生物的自溶現(xiàn)象受多種外界因素的影響，比如溫度、壓力、pH等控制不當(dāng)都會(huì)提高酵母自溶的概率，氯化鈉含量也是影響酵母自溶的關(guān)鍵因素之一[6]。高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵工藝最突出的特點(diǎn)是食鹽添加量的增加，這或許會(huì)對(duì)酵母自溶產(chǎn)生一定影響[7]。目前對(duì)酵母自溶的研究多集中于啤酒如何減輕酵母自溶現(xiàn)象，保持良好的啤酒特性，而對(duì)醬油發(fā)酵中酵母是否發(fā)生自溶、自溶程度、發(fā)生原因以及對(duì)醬油品質(zhì)的影響等研究較少。本研究主要圍繞著醬油發(fā)酵常用菌種魯氏接合酵母展開，分析其在醬油發(fā)酵過程中的自溶現(xiàn)象以及其對(duì)醬油風(fēng)味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

魯氏接合酵母：天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心存放。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、硼酸：天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；鹽酸：天津市化學(xué)試劑一廠；氯化鈉、硫酸鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硫酸銅：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

無菌操作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；顯微鏡 日本SANYO公司；GC-MS（ISQ7000）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；自動(dòng)凱氏定氮儀 山東海能科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 總酸測(cè)定

根據(jù)GB 12456—2021規(guī)定的方法測(cè)定[8]。

1.4.2 氨基酸態(tài)氮測(cè)定

根據(jù)GB 5009.235—2016規(guī)定的方法測(cè)定[9]。

1.4.3 全氮測(cè)定

稱取0.2 g硫酸銅與3 g硫酸鉀至消化管內(nèi)，并加入10 mL濃硫酸以及10 mL稀釋10倍后的樣品液，設(shè)置儀器溫度為200 ℃，保持40 min，再調(diào)節(jié)至300 ℃，保持30 min，最后調(diào)節(jié)至420 ℃，保持90 min，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，使用自動(dòng)凱氏定氮儀蒸餾5 min，用0.1 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行滴定，顏色出現(xiàn)紫紅色為滴定終點(diǎn)，并記錄鹽酸消耗量，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.4.4 還原糖測(cè)定

還原糖含量根據(jù)DNS法進(jìn)行測(cè)定[10]。

1.4.5 醬汁中酵母細(xì)胞數(shù)的變化及生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

醬汁中酵母細(xì)胞數(shù)的變化采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行測(cè)定。在計(jì)數(shù)板中央滴1滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液，取稀釋至適當(dāng)倍數(shù)的樣品稀釋液加入染色液中混勻，染色2～3 min，加蓋玻片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)變藍(lán)的細(xì)胞。計(jì)數(shù)使用25×16型計(jì)數(shù)板，取左上、左下、右上、右下以及中間5個(gè)大格內(nèi)的細(xì)胞。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，并計(jì)算死亡率。

25×16型血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：

酵母菌細(xì)胞數(shù)（mL）=80小格內(nèi)酵母菌總數(shù)80×400×10×1 000×稀釋倍數(shù)。

死亡率=死細(xì)胞總數(shù)總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.6 醬醪中酵母菌落數(shù)的變化

根據(jù)GB 4789.15—2016進(jìn)行測(cè)定[11]。高鹽稀態(tài)醬醪用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋后，選取3個(gè)適宜稀釋度樣品懸液吸取100 μL涂布于YPD固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，30 ℃下培養(yǎng)3 d，根據(jù)國(guó)標(biāo)要求進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.7 醬油風(fēng)味變化

醬油中風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法。

1.5 結(jié)果分析

利用SIMCA 14.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；采用Origin軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

不同鹽含量對(duì)醬油各項(xiàng)指標(biāo)有重要影響，總酸、氨基酸態(tài)氮、全氮和還原糖是反映醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)，與醬油發(fā)酵有著密切的聯(lián)系。為確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)在正常發(fā)酵條件下進(jìn)行，首先對(duì)不同鹽含量發(fā)酵醬油的各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

2.1 醬油總酸含量變化

總酸是醬油的重要理化指標(biāo)，適量的總酸可以緩和因含鹽量過高而帶來的咸味，使滋味變得柔和，這些酸類物質(zhì)與醬油中的酯類物質(zhì)可進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，豐富醬油的風(fēng)味物質(zhì)[12]。不同鹽含量發(fā)酵組醬油的總酸含量變化見圖1。

由圖1可知，3組樣品在發(fā)酵0～30 d內(nèi)總酸含量呈快速上升狀態(tài)，之后上升緩慢，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵前期各類酶活力相對(duì)旺盛，原料中的大分子物質(zhì)逐漸分解為小分子產(chǎn)物，酸類物質(zhì)增多，一些耐鹽性產(chǎn)酸微生物的生長(zhǎng)等都使得前期總酸含量增加；發(fā)酵結(jié)束時(shí)，3組總酸含量分別為2.00，1.86，1.81 g/dL。整個(gè)發(fā)酵期間，鹽含量越高的發(fā)酵組其總酸含量越低，即12%＞16%＞20%，這種現(xiàn)象可能是由于鹽含量的降低對(duì)一些產(chǎn)酸微生物的抑制作用減弱。

2.2 醬油氨基酸態(tài)氮含量變化

氨基酸態(tài)氮是以氨基酸形式存在的氮的總和，是醬油分級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。不同鹽含量發(fā)酵組醬油的氨基酸態(tài)氮含量變化見圖2。

由圖2可知，3組氨基酸態(tài)氮均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，各類酶活力旺盛，對(duì)原料分解迅速，導(dǎo)致前期增加較快，同時(shí)由于高濃度鹽水的加入，原料中被分解的可溶性氮和鹽水在滲透壓的作用下發(fā)生交換現(xiàn)象，也使其含量快速增加。發(fā)酵后期整個(gè)體系中的酶活力下降，各類微生物的代謝也消耗掉部分氨基酸態(tài)氮，最終使氨基酸態(tài)氮含量增加緩慢[13]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，3組醬油的氨基酸態(tài)氮含量分別為1.19，1.07，0.98 g/dL，均達(dá)到國(guó)標(biāo)中對(duì)特級(jí)醬油的要求。在發(fā)酵期間，鹽濃度越高的組別其氨基酸態(tài)氮含量越低，這是因?yàn)辂}分降低后微生物含量更豐富，對(duì)酶活的抑制作用更低，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量更高。

2.3 醬油全氮含量變化

全氮是醬油中可溶性含氮化合物的總稱，既包括原料和菌體中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的游離氨基酸，也包括發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)過度分解產(chǎn)生的游離氨基酸、多肽氮、菌體自溶后釋放的核酸類水解物等，是衡量原料利用率和醬油優(yōu)劣的重要指標(biāo)[14]。3組醬油全氮含量的變化見圖3。

由圖3可知，3組醬油全氮含量的變化均呈現(xiàn)在前30 d左右時(shí)增加較快隨后緩慢增加至穩(wěn)定狀態(tài)的趨勢(shì)，最終發(fā)酵結(jié)束時(shí)3組醬油全氮含量分別為1.70，1.67，1.59 g/dL，全氮含量均達(dá)到國(guó)標(biāo)要求。

2.4 醬油還原糖含量變化

在發(fā)酵過程中，淀粉質(zhì)原料在糖化酶、淀粉酶等的作用下被分解為還原糖，醬油的口感、風(fēng)味、色澤等都與還原糖含量密切相關(guān)。不同鹽含量發(fā)酵組醬油的還原糖含量變化見圖4。

由圖4可知，3組醬油還原糖含量均呈現(xiàn)先快速上升后逐漸降低至穩(wěn)定波動(dòng)的趨勢(shì)，在發(fā)酵第15天時(shí)，3組醬油還原糖含量均達(dá)到最大值，分別為4.20，4.39，4.64 g/dL。發(fā)酵初期，淀粉酶等活力旺盛，能快速將淀粉質(zhì)原料水解成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，因此前期還原糖含量快速升高，此時(shí)還原糖生成速度高于消耗速度。隨著發(fā)酵時(shí)間增加，酶活力下降，生成還原糖速度降低，并且酵母菌的加入消耗還原糖，形成醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，所以還原糖含量降低[15]。發(fā)酵后期，醬醪中pH下降，微生物活動(dòng)受到抑制，導(dǎo)致還原糖含量趨勢(shì)逐漸變緩。

綜合以上理化指標(biāo)，3組醬油發(fā)酵均為正常發(fā)酵，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 醬汁中酵母細(xì)胞數(shù)變化

自溶程度目前并沒有較明確的判斷指標(biāo)，國(guó)外研究者通過實(shí)驗(yàn)指出可測(cè)定培養(yǎng)液中的腺苷酸激酶含量來判定酵母自溶，但此方法所用儀器較難獲得；ASBC報(bào)道，在酵母自溶過程中，游離脂肪酸辛酸和癸酸的含量與其自溶有關(guān)，但測(cè)定方法較復(fù)雜[16—17]。氯化鈉常作為一種經(jīng)濟(jì)、安全的促溶劑應(yīng)用于菌體自溶中，氯化鈉可以提高胞外滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)壁分離，質(zhì)壁分離達(dá)到一定程度會(huì)引起細(xì)胞降解、胞內(nèi)物質(zhì)外溢[18]。細(xì)胞數(shù)的變化可以反映出酵母自溶的程度，首先利用醬汁模擬發(fā)酵，通過美藍(lán)染色法區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞或者代謝作用微弱的衰老細(xì)胞，可初步判斷發(fā)酵中酵母的自溶程度。

由圖5可知，在發(fā)酵前期，3組細(xì)胞數(shù)均快速上升，后期緩慢下降，在發(fā)酵17 d左右時(shí)，3組酵母細(xì)胞數(shù)均達(dá)到最大值，分別為2.45×107、2.2×107、2.1×107? 個(gè)/mL。在發(fā)酵過程中，高鹽發(fā)酵組的酵母細(xì)胞數(shù)始終低于低鹽發(fā)酵組。由圖6可知，鹽度越高的發(fā)酵組其細(xì)胞死亡率也逐漸升高，20%鹽度發(fā)酵組細(xì)胞死亡率達(dá)到79.2%，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是細(xì)胞長(zhǎng)期處于高鹽環(huán)境下，使得細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓發(fā)生變化，胞內(nèi)水分流失，影響細(xì)胞的增殖，膜內(nèi)外壓力的變化使細(xì)胞出現(xiàn)收縮或死亡，導(dǎo)致后期細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)下降，活細(xì)胞減少[19]。這說明高濃度的氯化鈉可以加速細(xì)胞的衰老死亡，促使酵母細(xì)胞更快地出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

在顯微鏡下分別觀察了發(fā)酵前期和發(fā)酵后期酵母細(xì)胞的出芽現(xiàn)象（見圖7），a～c是發(fā)酵前期在顯微鏡下觀察到的酵母生長(zhǎng)圖，視野中可以看到大量酵母細(xì)胞出芽旺盛，通過染色發(fā)現(xiàn)，只有個(gè)別酵母細(xì)胞被染為藍(lán)色，顯示了活細(xì)胞氧化還原性強(qiáng)的特征；d～f為發(fā)酵后期時(shí)顯微鏡觀察圖，視野內(nèi)可觀察到的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，大多細(xì)胞以單細(xì)胞形式存在，只有極少數(shù)存在出芽現(xiàn)象，染色后觀察到同一視野內(nèi)的細(xì)胞多數(shù)被染為藍(lán)色，這與整體酵母細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)，前期快速增加，后期緩慢下降，且細(xì)胞并不是全部死亡，仍有部分細(xì)胞處于出芽繁殖，說明自溶是一個(gè)長(zhǎng)期的過程。

2.6 醬醪中酵母菌落數(shù)變化

醬汁模擬發(fā)酵并不能完全代表真實(shí)發(fā)酵體系中酵母自溶的程度，因此測(cè)定了醬醪發(fā)酵過程中酵母菌落數(shù)的變化情況，其數(shù)量變化見圖8。

酵母初始接入量為1×106CFU/g，酵母加入當(dāng)天計(jì)為第0天，每隔15 d進(jìn)行一次取樣。由圖8可知，在酵母加入初期，3組酵母菌落數(shù)量與加入第0天相比均增加，在加入第15天時(shí)，12%發(fā)酵組菌落數(shù)量達(dá)到最大值，為1.2×106 CFU/g，而此時(shí)16%與20%兩組其數(shù)量較第0天有所下降，這是因?yàn)楦邼舛嚷然c對(duì)酵母細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，細(xì)胞正常生長(zhǎng)繁殖能力下降，導(dǎo)致生長(zhǎng)能力滯后；而到第30天時(shí)，20%和16%兩組酵母菌落數(shù)量達(dá)到最大值，分別為1.02×106，1.1×106 CFU/g，說明此時(shí)酵母已經(jīng)適應(yīng)高鹽環(huán)境，能夠生長(zhǎng)繁殖。30 d之后，3組菌落數(shù)均出現(xiàn)了不同程度的下降，到第90天時(shí)，20%發(fā)酵組已無菌落生長(zhǎng)，16%和12%兩組仍有菌落生長(zhǎng)，但與前期相比數(shù)量下降明顯，只有9×103，1.8×104 CFU/g；繼續(xù)監(jiān)測(cè)至第105天，3組均無菌落生長(zhǎng)。這一現(xiàn)象表明酵母在整個(gè)發(fā)酵過程中可以進(jìn)行較徹底的自溶，這一變化趨勢(shì)與上述醬汁模擬發(fā)酵中細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)相似，進(jìn)一步證明了氯化鈉濃度對(duì)酵母自溶的影響。

2.7 酵母自溶對(duì)醬油風(fēng)味的影響

自溶是一個(gè)緩慢且長(zhǎng)期的過程，這一過程中會(huì)釋放自溶產(chǎn)物并對(duì)醬油風(fēng)味產(chǎn)生影響，對(duì)成品醬油利用GC-MS進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，3組醬油樣品共檢測(cè)出155種香氣化合物成分，其中醇類物質(zhì)27種，醛類物質(zhì)20種，酚類物質(zhì)5種，酮類物質(zhì)21種，酯類物質(zhì)34種，酸類物質(zhì)10種，吡嗪類物質(zhì)10種，呋喃類物質(zhì)3種，烷烴類物質(zhì)10種以及其他類化合物15種。其中20%發(fā)酵組中酯類物質(zhì)最多，12%發(fā)酵組中酸類物質(zhì)最多。

為區(qū)分不同發(fā)酵組中的差異風(fēng)味代謝物，采用偏最小二乘回歸方程的方法（PLS-DA模型）對(duì)不同條件下的樣本進(jìn)行分析。由圖10可知，不同樣本間得到了較好的分離，20%鹽濃度發(fā)酵組分布在第一象限，12%發(fā)酵組分布在第三象限，16%發(fā)酵組分布在第四象限。進(jìn)一步采用VIP值篩選不同條件下的差異代謝物，進(jìn)行200次假設(shè)驗(yàn)證，選取VIP值大于1的物質(zhì)，即為不同樣本間的差異代謝物，共篩選出24種差異代謝物，差異代謝物聚類分析見圖11。

差異代謝物中醇類物質(zhì)有7種，包括苯乙醇、1-辛烯-3-醇、異戊醇、乙醇、2-甲基丁醇、（2S，3S）-（+）-2，3-丁二醇、反式-2-辛烯-1-醇，醇類物質(zhì)是醬油的主要呈香物質(zhì)，1-辛烯-3-醇帶有蘑菇香氣，使醬油鮮香醇厚，苯乙醇可賦予醬油蜂蜜的香氣，異戊醇具有麥芽香氣，能賦予醬油濃郁感[20]。由圖11可知，12%發(fā)酵組醇類物質(zhì)含量最高，結(jié)合酵母細(xì)胞數(shù)和菌落數(shù)在發(fā)酵過程中的變化分析這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是酵母在低濃度氯化鈉中抑制作用較小，細(xì)胞正常生長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)含量較高。20%和16%兩組醇類物質(zhì)含量降低，一方面是由于高濃度氯化鈉的抑制作用使酵母細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)差異，另一方面是在氯化鈉作用下，醬醪中的酵母細(xì)胞被破壞，酵母自溶進(jìn)程加快，風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵過程中釋放，發(fā)酵結(jié)束時(shí)部分風(fēng)味物質(zhì)含量出現(xiàn)降低。

酸類物質(zhì)包括醋酸、異戊酸、2-甲基丁酸，由圖11可知，酸類物質(zhì)含量在12%發(fā)酵組中最高，其原因與氯化鈉對(duì)微生物的抑制作用減弱、微生物的產(chǎn)酸增加有關(guān)，同時(shí)也與理化指標(biāo)中12%發(fā)酵組總酸含量最高相一致。異戊酸和2-甲基丁酸具有奶酪香，可以豐富醬油的香氣，但是過多的酸類物質(zhì)則會(huì)使醬油產(chǎn)生不良風(fēng)味。

醛類物質(zhì)有6種，包括苯乙醛、苯甲醛、異戊醛、2-甲基丁醛、2，4-二甲基苯甲醛、反-2-辛烯醛；醛類物質(zhì)在醬油中的含量一般較少，但微量的醛類對(duì)醬油的香氣成分有著一定的調(diào)和作用，這些物質(zhì)可為醬油提供花香、杏仁香、咖啡可可香、蘋果香等氣味，都是醬油中的關(guān)鍵香氣化合物。

酯類物質(zhì)有4種，分別是苯乙酸甲酯、乙酸乙酯、亞油酸甲酯、反式-13-十八烯酸甲酯。酯類物質(zhì)具有香甜、濃郁柔和的味道，可以使關(guān)鍵香味更加醇厚，起到掩蓋不良風(fēng)味、減淡咸味的作用，酯類物質(zhì)除了酯化反應(yīng)生成外，酵母的酯酶還可以將游離脂肪酸游離出來，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酯類物質(zhì)[21]。其中乙酸乙酯、苯乙酸乙酯在12%發(fā)酵組中含量最高，導(dǎo)致酯類物質(zhì)含量降低的原因可能是酯酶被降解以及前體物醇類被消耗。

呋喃酮類物質(zhì)5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮可以為醬油提供焦糖香氣，緩和鹽味，有研究指出這類物質(zhì)主要是由醬油釀造原料中的D-木酮糖-5-磷酸在酵母的作用下生成的[22]。

吡嗪類物質(zhì)包括川芎嗪和2，3，5-三甲基吡嗪，酮類物質(zhì)包括3-辛酮。

3 結(jié)論

本文以工業(yè)發(fā)酵用菌種魯氏接合酵母為研究對(duì)象，設(shè)置不同鹽度發(fā)酵組，考察氯化鈉濃度對(duì)酵母自溶的影響以及成品醬油風(fēng)味的變化。醬汁中酵母細(xì)胞以及醬醪中菌落數(shù)的變化均說明高濃度的氯化鈉會(huì)抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，加速酵母的死亡，促進(jìn)酵母提前出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，無法充分參與醬醪成熟與風(fēng)味物質(zhì)的生成，同時(shí)因自溶提前使風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)；12%發(fā)酵組的抑制作用不明顯，微生物快速生長(zhǎng)，風(fēng)味分析發(fā)現(xiàn)酸類物質(zhì)含量明顯高于其他兩組。綜合考慮認(rèn)為，16%發(fā)酵組更有利于醬油發(fā)酵，一方面酵母在發(fā)酵中可以徹底完成自溶且自溶進(jìn)程并不會(huì)提前，另一方面對(duì)產(chǎn)酸微生物等有較強(qiáng)的抑制作用，有利于促進(jìn)醬油綜合風(fēng)味的形成。該研究為評(píng)價(jià)醬油發(fā)酵過程中酵母自溶現(xiàn)象以及進(jìn)一步提升醬油風(fēng)味提供了一定依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]梁小玲，張巧苑，李潔珠.醬油釀造工藝分析[J].現(xiàn)代食品，2022，28（8）：65-67.

[2]譚戈，徐晴元，郭麗瓊，等.釀造醬油微生物多樣性及風(fēng)味物質(zhì)研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2021，46（6）：160-163，179.

[3]張麗.高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中添加酵母的研究[D].貴陽：貴州大學(xué)，2019.

[4]WANG J J， LI M Q， ZHENG F Y， et al. Cell wall polysaccharides： before and after autolysis of brewer's yeast[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology，2018，34（9）：137.

[5]PONSMERCAD P， GIMNEZ P， VILOMARA G， et al. Monitoring yeast autolysis in sparkling wines from nine consecutive vintages produced by the traditional method[J].Australian Journal of Grape and Wine Research，2021，28（3）：347-357.

[6]楊更.脈沖電場(chǎng)對(duì)誘導(dǎo)釀酒酵母自溶及其自溶產(chǎn)物品質(zhì)影響的研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2020.

[7]郭明威.產(chǎn)生醬油關(guān)鍵香氣物質(zhì)4-乙基愈創(chuàng)木酚的微生物和發(fā)酵工藝研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2021.

[8]國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定：GB 12456—2021[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2021.

[9]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：GB 5009.235—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[10]牛亞冰.三株米曲霉菌種發(fā)酵性能的比較[D].天津：天津科技大學(xué)，2018.

[11]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)：GB 4789.15—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[12]譚戈，朱新貴，李學(xué)偉，等.強(qiáng)化魯氏接合酵母對(duì)醬油品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技，2022，43（13）：86-93.

[13]TIN H S，周斌，侯莎，等.鹽分對(duì)廣式高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2022，48（1）：45-54.

[14]郭琳.不同醬油發(fā)酵工藝的比較研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2017.

[15]莊婉菁，覃旋，劉曉艷，等.高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2019（17）：66-68.

[16]KATERˇINA ， TOM B， JAKUB N， et al. Application of high-pressure processing to assure the storage stability of unfiltered lager beer[J].Molecules，2020，25（10）：2414.

[17]張明芳.高溫敏感型啤酒酵母的選育及其自溶研究[D].無錫：江南大學(xué)，2020.

[18]BOONYEUN P， SHOTIPRUK A， PROMMUAK C， et al. Enhancement of amino acid production by two-step autolysis of spent Brewer's yeast[J].Chemical Engineering Communications，2011，198（12）：1594-1602.

[19]俞曉霞.高鹽脅迫誘導(dǎo)光滑球擬酵母細(xì)胞凋亡的生理機(jī)制及內(nèi)外源調(diào)控策略[D].無錫：江南大學(xué)，2015.

[20]GAO X L， FENG T， SHENG M J， et al. Characterization of the aroma-active compounds in black soybean sauce， a distinctive soy sauce[J].Food Chemistry，2021，364：130334.

[21]鄧岳，楊陽，梁麗靜，等.傳統(tǒng)工藝釀造醬油微生物多樣性與風(fēng)味研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2021，46（3）：104-108.

[22]郭建，伍學(xué)明，樊君，等.魯氏酵母和球擬酵母不同接種方式對(duì)高鹽稀態(tài)釀造醬油品質(zhì)的影響[J].中國(guó)調(diào)味品，2019，44（2）：100-104.