趙會(huì)敏 姚新轉(zhuǎn) 張傳明 呂立堂

(貴州大學(xué),貴陽(yáng),550025)

城鄉(xiāng)綠化土壤中的氮元素分布并不均勻[1],過(guò)量的補(bǔ)充氮素也會(huì)對(duì)土壤環(huán)境造成影響[2],這為人工補(bǔ)充氮元素帶來(lái)了極大的困難。同時(shí),氮素作為植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)中的限制性養(yǎng)分之一,缺少或過(guò)量都會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3-4]。因此,培育可以耐受低氮環(huán)境的林木品種,對(duì)于城鄉(xiāng)綠化具有重要意義。楊樹(shù)是林業(yè)研究領(lǐng)域的模式植物,其基因組相對(duì)較小,易于進(jìn)行遺傳研究;同時(shí)其適應(yīng)性強(qiáng),生長(zhǎng)速度快,具有優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)特性,已利用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了抗病蟲(chóng)、抗寒凍、抗旱、抗鹽堿等機(jī)制研究[5-6]。由于具有樹(shù)干通直挺拔、根系發(fā)達(dá)、枝葉長(zhǎng)勢(shì)繁茂、抗寒抗旱能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于速生用材林和防護(hù)林[7]。有研究發(fā)現(xiàn),毛楊樹(shù)具有較強(qiáng)的抗空氣中粉塵及有毒氣體的效果[8],是一種比較理想的城鄉(xiāng)綠化樹(shù)種。

由于植物吸收、同化和利用土壤中的氮是通過(guò)多種途徑進(jìn)行的[9],而高親和、低親和的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)同化和吸收硝態(tài)氮是其主要途徑[10-11]。通常情況下,植物通過(guò)低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)調(diào)控高氮環(huán)境中氮的吸收同化,通過(guò)高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)調(diào)控低氮環(huán)境中氮的吸收同化[12]。因此,利用植物這種調(diào)節(jié)自身相關(guān)基因表達(dá)量以適應(yīng)外界低氮脅迫環(huán)境的作用機(jī)制[13],通過(guò)轉(zhuǎn)入外源基因誘導(dǎo)植物氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化[14],是一種切實(shí)有效的提高植物氮素利用率的途徑[15]。Fang et al.[16]在對(duì)低親和力硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)家族PTR/NRT1(NPF)中的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPTR9進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),OsPTR9在水稻各個(gè)組織均有表達(dá),其表達(dá)量與外源氮素含量具有明顯的相關(guān)性;同時(shí),在同樣條件下培養(yǎng)的OsPTR9基因的超表達(dá)、RNA干涉和敲除植株,其氮素吸收利用和相關(guān)表型與野生型植株出現(xiàn)了明顯差異,并且其表達(dá)量與水稻吸收銨密切相關(guān)。

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPTR9可以促進(jìn)水稻中銨的吸收并提高其氮代謝效率,但關(guān)于其在木本植物中的功能的研究較少。為此,本研究以三倍體毛白楊(PopulusL.)為試驗(yàn)研究對(duì)象,采用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將OsPTR9基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)中,經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定獲得15株轉(zhuǎn)基因植株;以野生型楊樹(shù)無(wú)菌苗葉片為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化繼代培養(yǎng)的野生型楊樹(shù)無(wú)菌組培苗為對(duì)照;參考霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配方配置低氮營(yíng)養(yǎng)液,選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的4個(gè)楊樹(shù)株系進(jìn)行低氮脅迫處理,觀測(cè)其低氮脅迫表型、測(cè)定其氮磷鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量,分析轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植株對(duì)低氮環(huán)境的耐受性。旨在為探索楊樹(shù)應(yīng)對(duì)低氮脅迫的調(diào)控機(jī)制、后續(xù)開(kāi)展植物的氮調(diào)控相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)所用毛白楊品種為三倍體毛白楊(PopulusL.),來(lái)源于金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院師范學(xué)院,培養(yǎng)條件:光周期為16 h光照(28 ℃)、8 h黑暗(25 ℃),光合有效輻射為90 μmol·m-2·s-1。

OsPTR9超表達(dá)載體委托武漢伯遠(yuǎn)生物有限公司構(gòu)建,農(nóng)桿菌菌株LB4404由本實(shí)驗(yàn)室保存,相關(guān)引物由北京攀科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化及分子鑒定方法:采用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化楊樹(shù)[17]。以野生型楊樹(shù)無(wú)菌苗葉片為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,4周后愈傷組織長(zhǎng)出,進(jìn)行繼代培養(yǎng)獲得抗性芽,抗性芽長(zhǎng)至2～3 cm,然后將抗性芽切下,置于生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。4周后待無(wú)菌苗長(zhǎng)至7～10 cm煉苗2 d后移栽到礫土盆中。從楊樹(shù)葉片中提取DNA,利用OsPTR9基因序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物。

低氮脅迫楊樹(shù)幼苗的試驗(yàn)設(shè)計(jì):參考霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配方[18],配置低氮營(yíng)養(yǎng)液(見(jiàn)表1)。楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因幼苗和野生型幼苗移栽培養(yǎng)初期,施加低氮營(yíng)養(yǎng)液100 mL/盆,同時(shí)補(bǔ)充適量的硝酸銨,待其生長(zhǎng)穩(wěn)定后,逐步削減硝酸銨補(bǔ)加量,直至降為0.01 mg/L后,開(kāi)始進(jìn)行低氮脅迫處理。植株低氮處理期間,低氮營(yíng)養(yǎng)液3 d添加1次,同時(shí)補(bǔ)充足量水分;處理60 d后,觀察超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù)與野生型楊樹(shù)的表型差異;采取楊樹(shù)頂端往下的第四片葉片,液氮速凍后,-80 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 借鑒霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配方配置的低氮營(yíng)養(yǎng)液配方的各種化合物溶液的母液添加量

低氮脅迫處理后楊樹(shù)氮、磷、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法:將保存在-80 ℃的楊樹(shù)葉片樣本烘干研磨粉碎后,采用消煮法檢測(cè)其氮、磷、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)。用H2SO4-H2O2消解樣品后,應(yīng)用凱氏定氮儀在堿性條件下(NaOH)測(cè)定N元素質(zhì)量分?jǐn)?shù),應(yīng)用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法定量測(cè)定P元素質(zhì)量分?jǐn)?shù),應(yīng)用NH4OAc浸提-火焰光度計(jì)法定量測(cè)定K元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)[19-20]。

氮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)方法:提取保存在-80 ℃的楊樹(shù)葉片總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以Actin為內(nèi)參基因,利用熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)氮代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量[17],引物見(jiàn)表2。

表2 相關(guān)基因反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)引物序列

數(shù)據(jù)處理:采用EXCEL軟件、GraphPad Prism 8對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,試驗(yàn)經(jīng)3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植株的獲得

長(zhǎng)勢(shì)基本一致的8株超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性(見(jiàn)圖1),表明OsPTR9基因成功導(dǎo)入楊樹(shù)中;對(duì)進(jìn)行低氮脅迫處理的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中OsPTR9基因的定量結(jié)果(見(jiàn)表3),表明OsPTR9基因在楊樹(shù)中超量表達(dá)。

WT為野生型楊樹(shù)植株;LN1～LN8為8株超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù)植株。

表3 OsPTR9基因在楊樹(shù)不同株系中的表達(dá)量

2.2 超量表達(dá)OsPTR9基因?qū)Φ偷{迫時(shí)楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

選取3個(gè)超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù)株系(LN1、LN2、LN3)進(jìn)行低氮耐受型試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)低氮脅迫處理28 d后,野生型楊樹(shù)幼苗出現(xiàn)了明顯的低氮癥狀,葉片泛黃、枯萎、直至脫落;超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù)幼苗無(wú)明顯低氮癥狀(見(jiàn)圖2)。此外,選取低氮脅迫60 d后的1個(gè)株系(LN4)和野生型楊樹(shù),觀察表型發(fā)現(xiàn),野生型楊樹(shù)葉片偏小(見(jiàn)圖3a)、植株矮小(見(jiàn)圖3b),發(fā)育遲緩;而轉(zhuǎn)OsPTR9基因楊樹(shù)葉片偏大(見(jiàn)圖3a)、植株健壯(見(jiàn)圖3b)。其中,LN4株系最大葉片長(zhǎng)度為野生型最大葉片長(zhǎng)度的1.8倍、最大葉片寬度為野生型最大葉片寬度的2.4倍、株高為野生型株高的2.1倍(見(jiàn)表4)。表明超量表達(dá)OsPTR9基因提高了楊樹(shù)對(duì)低氮脅迫的耐受性,可以有效促進(jìn)低氮脅迫時(shí)楊樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育。

WT為野生型楊樹(shù)植株;LN1、LN2、LN3為3株超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù)植株。

WT為野生型楊樹(shù)植株;LN4為超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù)植株。

表4 低氮脅迫處理60 d后野生型、轉(zhuǎn)基因型楊樹(shù)的葉片尺寸和植株高度

2.3 轉(zhuǎn)基因型楊樹(shù)與野生型楊樹(shù)葉片的氮、磷、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異

超量表達(dá)OsPTR9基因的楊樹(shù)葉片氮、磷、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù),均高于野生型楊樹(shù)(見(jiàn)表5),其中氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了15%、磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了19%、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了21%;說(shuō)明超量表達(dá)OsPTR9基因,可以促進(jìn)植物在葉片儲(chǔ)存更多的N、P、K,緩解低氮脅迫時(shí)的生存壓力。

表5 低氮脅迫處理60 d后野生型楊樹(shù)和轉(zhuǎn)基因型楊樹(shù)葉片的氮、磷、鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4 超量表達(dá)OsPTR9基因?qū)顦?shù)中氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步分析超量表達(dá)OsPTR9基因在楊樹(shù)低氮脅迫時(shí)的作用機(jī)制,對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型楊樹(shù)中一些氮代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,楊樹(shù)中氮代謝相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因株系和野生型中的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯差異(見(jiàn)表6)。其中,轉(zhuǎn)基因株系中,高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT2.5)基因表達(dá)量,為野生型的10.6倍;高親和力鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HAK5)基因的表達(dá)量,為野生型的1.9倍;谷氨酸合成酶(GOGAT1、GOGAT2)基因表達(dá)量,是野生型的1.5倍、2.7倍;谷氨酰胺合成酶(GS1.1、GS1.2、GS1.3、GS2)基因表達(dá)量,是野生型的79.7倍、10.9倍、27.2倍、5.3倍;PTR1.2、PTR2.11、PTR3.1、PTR6.3基因表達(dá)量,分別為野生型的3.6倍、2.2倍、2.1倍和2.5倍。綜合以上結(jié)果,說(shuō)明超量表達(dá)OsPTR9基因促進(jìn)了楊樹(shù)中氮代謝相關(guān)基因的表達(dá);促進(jìn)高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷氨酰胺合成酶基因的高表達(dá),是OsPTR9基因調(diào)控楊樹(shù)在低氮脅迫時(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的主要途徑。

表6 氮代謝相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因型株系和野生型楊樹(shù)中的表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

超量表達(dá)氮代謝相關(guān)的基因,是一種非常有效的可以改變植物低氮耐受性的方法。在煙草[21]、擬南芥[14]等模式植物中得到了驗(yàn)證。本研究將水稻中發(fā)現(xiàn)的與氮吸收和氮代謝相關(guān)的OsPTR9基因[16],通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入楊樹(shù)中,隨后對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)進(jìn)行低氮脅迫處理。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)OsPTR9基因楊樹(shù)表現(xiàn)出了明顯的低氮耐受性,缺氮癥狀出現(xiàn)時(shí)間比野生型明顯延后,低氮處理時(shí)生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于野生型,說(shuō)明OsPTR9基因可以提高植物對(duì)低氮脅迫的耐受性;但其相應(yīng)的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

氮、磷、鉀對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性有著重要的影響。通常情況下,植物在低氮脅迫時(shí),會(huì)通過(guò)減少磷的攝入降低代謝水平,以維持其基本的生存[22],促進(jìn)鉀的吸收以提高氮利用率[23-24]。而葉片作為植物儲(chǔ)存和同化氮磷鉀的重要器官,葉片氮磷鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以在一定程度上反映出植物整體的氮磷鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)[25]。已有研究表明,OsPTR9的表達(dá)受銨態(tài)鹽的調(diào)控,并且OsPTR9基因表達(dá)量降低對(duì)植株冠根、株高、生長(zhǎng)量有負(fù)面影響[16]。本研究結(jié)果表明,低氮處理后轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植株高度和葉片大小,顯著高于野生型;轉(zhuǎn)基因葉片中的氮磷鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù),顯著高于野生型。在低氮環(huán)境下超量表達(dá)OsPTR9基因促進(jìn)了銨的攝取,增加了根中和葉片中的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù),保證了楊樹(shù)植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育,并使其生物量增加,從而提高楊樹(shù)的耐受性。但目前對(duì)于氮、磷、鉀在葉片存儲(chǔ)量的增加,是通過(guò)從外界環(huán)境中吸收氮、磷、鉀這一途徑,還是通過(guò)提高楊樹(shù)中氮、磷、鉀的代謝效率從而降低氮、磷、鉀的損耗的方式,還有待探究。