張霄 于雯馨 薛宇博 胡丁丁 馮超

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),呼和浩特,010011)

內(nèi)蒙古地處干旱、半干旱氣候帶,具有氣候酷寒、干旱缺水、沙化嚴(yán)重等特點(diǎn),導(dǎo)致植被生長困難,生態(tài)環(huán)境十分脆弱[1]。當(dāng)前的植被恢復(fù)困難,適宜北方草原退化生境予以修復(fù)的鄉(xiāng)土物種稀缺,現(xiàn)有措施效果局限,需要尋找適宜的物種及其他植被恢復(fù)方法。

苔蘚植物作為先鋒物種,在環(huán)境污染監(jiān)測方面存在巨大的價(jià)值與潛力[2-4],在防止雨滴對土壤的影響、保護(hù)表土、延緩地表徑流侵蝕、構(gòu)建抗侵蝕土壤結(jié)構(gòu)等方面具有重要作用[5-10]。但是,旱生苔蘚自然分布較少,非常容易受到地面表面的干擾,而且其結(jié)皮層從干擾中自然恢復(fù)需要的時間較長[11],嚴(yán)重限制了其在水土保持等領(lǐng)域的應(yīng)用。魏志穎等[12]研究表明,蔗糖對于山墻蘚原絲體的形成和擴(kuò)展生長均具促進(jìn)作用,質(zhì)量濃度為30 g/L時原絲體形成時間最早、擴(kuò)展直徑最大,但抑制了芽體的分化,質(zhì)量濃度為15 g/L時對芽體分化具明顯促進(jìn)作用。李育中等[13]使用液體培養(yǎng)基對雙色真蘚進(jìn)行懸浮培養(yǎng),并進(jìn)行了孢子培養(yǎng)與愈傷組織的誘導(dǎo)。Zhao et al.[14]使用液體培養(yǎng)基建立泥碳蘚培養(yǎng)體系,并發(fā)現(xiàn)線狀原絲會隨著片狀原絲體增加而減少。因此,快速人工栽培對于加速在惡劣環(huán)境下苔蘚結(jié)皮層的恢復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

Tao et al.[15]研究表明,霍格蘭(Hogland)培養(yǎng)基對沙漠苔蘚地殼的生長有促進(jìn)作用。關(guān)于苔蘚組織培養(yǎng),已經(jīng)探索出影響苔蘚繁殖的多個因素,如水分、光照、pH、培養(yǎng)基種類及激素使用等因素,都與苔蘚的繁殖方式與速度存在關(guān)聯(lián),但其在不同破碎程度時苔蘚的生長周期及其對培養(yǎng)基中元素的吸收程度,研究的較少。為此,本研究在對內(nèi)蒙古草原分布調(diào)查的基礎(chǔ)上,選定角齒蘚(Ceratodonpurpureus(Hedw.)Brid.)、叢生真蘚(BryumcaespiticiumHedw.)、葫蘆蘚(FunariahygrometricaHedw.)、赤蘚(Syntrichiasinensis(Müll.Hal.)Ochyra)、絹蘚(Entodoncladorrhizans(Hedw.)Müll.Hal.)、紫萼蘚(GrimmiaplagiopodiaHedw.)、垂枝蘚(Rhytidiumrugosum(Hedw.)Kindb)這些類群作為培養(yǎng)對象,通過整株、高打碎、低打碎3種不同接種方式以及3種不同pH梯度(6、7、8)的諾普(Knop)培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng);觀察苔蘚樣品生長周期、破碎程度的生長方式及3種pH梯度對苔蘚樣品生長的影響,分析苔蘚對金屬元素(Zn、Ca、Mg、K)和非金屬(N、S、P)吸收程度及苔蘚樣品生長所需營養(yǎng)成分,探索苔蘚物種的快速繁殖方法;旨在為內(nèi)蒙古草原旱生蘚類的大規(guī)模繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用苔蘚類群遴選及來源

在自然環(huán)境中,旱生蘚類由于其生長緩慢,嚴(yán)重制約其生態(tài)功能的應(yīng)用,而旱生蘚類大面積繁殖還處于空白,特別是培養(yǎng)中最關(guān)鍵的繁殖方式和元素吸收的研究較少。本研究在前期對內(nèi)蒙古草原分布調(diào)查的基礎(chǔ)上,最終選定角齒蘚、叢生真蘚、葫蘆蘚、赤蘚、絹蘚、紫萼蘚、垂枝蘚這些類群作為培養(yǎng)對象。

角齒蘚、叢生真蘚、葫蘆蘚——收集于中國內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟勝利礦區(qū)(地理坐標(biāo):北緯43°2′～44°52′、東經(jīng)115°13′～117°6′);該地年平均氣溫3.6 ℃,年平均降水量289 mm,年平均風(fēng)速4.5 m/s,土壤類型為風(fēng)沙土質(zhì)。

赤蘚——收集于中國內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒渾善達(dá)克沙地(地理坐標(biāo):北緯41°56′～44°26′、東經(jīng)112°22′～117°57′);該地年平均氣溫1.5 ℃,年平均降水量東部為365.1 mm、西部為156.5 mm,年平均風(fēng)速4.5 m/s,土壤類型為風(fēng)沙土和栗鈣土。

絹蘚、紫萼蘚——收集于中國內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市大青山環(huán)境保護(hù)區(qū)(地理坐標(biāo):北緯40°34′～41°14′、東經(jīng)109°47′～112°17′);該地年平均氣溫14.1 ℃,年平均降水量849 mm,年平均風(fēng)速2.72 m/s,土壤類型為栗鈣土質(zhì)。

垂枝蘚——收集于中國內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市(地理坐標(biāo):北緯47°5′～53°20′、東經(jīng)115°31′～126°4′);該地年平均氣溫0 ℃,年平均降水量350.5 mm,年平均風(fēng)速3.2 m/s,土壤類型為黑土、暗棕壤、黑鈣土、草甸土質(zhì)。

在其相應(yīng)生境內(nèi),選取生長良好且發(fā)育一致的苔蘚群落,隨機(jī)選取3個樣點(diǎn),使用鏟子分別采取赤蘚、角齒蘚、叢生真蘚、葫蘆蘚、絹蘚、垂枝蘚、紫萼蘚,取得樣品21份,封存后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 組織培養(yǎng)苔蘚的培養(yǎng)基的配制

本研究試驗(yàn)選取諾普(Knop)液體培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)。培養(yǎng)基成分:硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)為1 000 mg、硝酸鉀(KNO3)為250 mg、磷酸二氫鉀(KH2PO4)為250 mg、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)為250 mg、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)為3 mg、蒸餾水為1 000 mL。

1.3 苔蘚植株的破碎處理及組織培養(yǎng)苔蘚的接種與培養(yǎng)

將諾普培養(yǎng)基倒入3個1 L錐形瓶中,使用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6、7、8。將其均分于63個100 mL的三角瓶中并用封口膜包裹;使用高壓蒸汽滅菌鍋將實(shí)驗(yàn)工具進(jìn)行滅菌。2 h后,取出工具置于超凈臺內(nèi),同時打開超凈工作臺的紫外射線燈與通風(fēng)裝置,對培養(yǎng)工具及超凈工作臺進(jìn)行35 min的消毒工作。

將植株放入蒸餾水中浸泡至植物體完全舒展,將其依次放置在解剖鏡下觀察,并使用蒸餾水沖洗苔蘚表面的泥土、沙粒等雜質(zhì)。重復(fù)以上步驟,直至無明顯雜質(zhì)且保留其完整假根。

本試驗(yàn)采取3種植株處理方式,即高破碎處理、低破碎處理、整株。高打碎處理,即使用美國Next Advance快速組織細(xì)胞破碎儀8檔,運(yùn)行1 min,將苔蘚植株進(jìn)行破碎處理為平均長度1 mm的小段;低打碎處理,即使用刀片,將苔蘚植物切為其長度1/3的小段。在超凈工作臺內(nèi)使用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30 s,然后放入無菌水漂洗并用濾紙吸干;重復(fù)以上步驟3次。將各處理以此接種到諾普培養(yǎng)基上,每個培養(yǎng)基接種3株苔蘚,并設(shè)置3個重復(fù)。接種完畢,將苔蘚放置于布魯帕德(Blue Pard)培養(yǎng)箱中(培養(yǎng)溫度25 ℃,光照強(qiáng)度2 500～3 500 lx,光照光照12 h、黑暗12 h),培養(yǎng)30 d。諾普培養(yǎng)基包括4種金屬元素(Zn、Ca、Mg、K)、3種非金屬元素(N、S、P)。

1.4 組織培養(yǎng)苔蘚培養(yǎng)基消毒時間及消毒劑的篩選

苔蘚組織培養(yǎng)的相關(guān)研究,主要集中在培養(yǎng)基成分選擇、消毒方式、組培條件篩選等方面。選擇體積分?jǐn)?shù)為70%的無水乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液作為消毒試劑,設(shè)計(jì)8個消毒方案(30 s乙醇+10 s次氯酸鈉、30 s乙醇+5 s次氯酸鈉、30 s乙醇+0 s次氯酸鈉、20 s乙醇+10 s次氯酸鈉、20 s乙醇+5 s次氯酸鈉、20 s乙醇+0 s次氯酸鈉、10 s乙醇+10 s次氯酸鈉、10 s乙醇+0 s次氯酸鈉),將苔蘚外植體做以上梯度處理后接種到諾普培養(yǎng)基上。20 d后,通過觀察其外植體的狀態(tài)、成活率以及染菌情況,不同苔蘚植物適應(yīng)的消毒時間與消毒液種類存在差異,通過梯度試驗(yàn)最終確定“30 s乙醇+0 s次氯酸鈉”為多數(shù)外植體消毒的最佳方案。

1.5 苔蘚培養(yǎng)基剩余元素的測定

培養(yǎng)30 d后,選擇pH為6的培養(yǎng)基,取出外植體、原絲體后,將剩余培養(yǎng)液使用無磷濾紙過濾3次,直至無明顯雜質(zhì);使用原子吸收光度計(jì)-火焰法測定Zn、Ca、Mg、K元素,使用流動分析儀測量N元素;使用硫酸鋇比濁法測定S元素,使用鉬鍶胺比色法測定P元素。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:采取原子吸收光度計(jì)-火焰法對其進(jìn)行檢測,取5.0 mL鈣元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)置于50.0 mL容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為100 mg/L的鈣使用液;再分別吸取0、0.5、2.5、5.0、7.5 mL鈣標(biāo)準(zhǔn)液加入50.0 mL的容量瓶,并定容至刻度線,最終得到質(zhì)量濃度為0、1.0、5.0、10.0、15.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。用同樣方法繪制鉀、鎂、鋅元素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理:標(biāo)準(zhǔn)溶液配制完畢后,將儀器置于工作狀態(tài),開始空燒;待儀器基線穩(wěn)定后,調(diào)節(jié)基線和增益;待基線穩(wěn)定后,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線各質(zhì)量濃度點(diǎn)的測定;標(biāo)準(zhǔn)曲線測定完畢后,開始測量待測樣品。設(shè)置空白對照組3個重復(fù),將配好的空白諾普培養(yǎng)基與其它樣本在相同條件環(huán)境放置35 d。35 d后,取出培養(yǎng)的pH為7的苔蘚樣本及其原絲體,使用9 mm無磷濾紙將液體培養(yǎng)基過濾2次,直至無雜質(zhì),使用原子吸收光度計(jì)-火焰法進(jìn)行測定。依據(jù)測定結(jié)果,分析不同苔蘚對于元素的吸收程度;測定剩余元素越多,說明此種苔蘚樣本對于該元素的吸收量相對越少。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù),數(shù)據(jù)均采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析、多因素方差分析方法,比較其差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同破碎處理對苔蘚植物生長的影響

不同植株的破碎處理,對苔蘚植物的生長產(chǎn)生影響。根據(jù)觀測統(tǒng)計(jì)(見表1),整株與低打碎處理樣本的生長率,高于高打碎處理的苔蘚樣本。不同的pH環(huán)境影響其破碎程度的生長率,在pH為8的培養(yǎng)環(huán)境時,高破碎程度的苔蘚整體生長率,顯著高于整株、低破碎程度苔蘚生長率;在pH為7的培養(yǎng)環(huán)境時,整株程度的苔蘚整體生長率,顯著低于高破碎程度苔蘚生長率。赤蘚、叢生真蘚、紫萼蘚、垂枝蘚高破碎處理成功生長的株數(shù),分別占其破碎程度株數(shù)的55.56%、88.89%、88.89%、100%,高于整株、低打碎處理,表明其適用于高破碎方式繁殖。葫蘆蘚,絹蘚的低破碎處理成功生長的株數(shù),分別占其破碎程度株數(shù)的66.67%、88.89%,高于整株、高打碎處理,表明其適用于低破碎的繁殖方式。部分苔蘚植物,高破碎后更傾向于產(chǎn)生大量的原絲體,而低打碎植株更傾向于產(chǎn)生大量的莖葉體,最終發(fā)展成完整的植株。

表1 不同破碎處理的苔蘚植物在不同pH培養(yǎng)環(huán)境時的總體生長率

2.2 培養(yǎng)基pH對苔蘚植物生長的影響

采取梯度試驗(yàn),配劑pH為6、7、8的諾普培養(yǎng)基,將苔蘚外植體接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)35d期間觀察記錄其生長狀況。由圖1可見:在諾普培養(yǎng)基中,不同pH對苔蘚植物原絲體及莖葉體的生長量和發(fā)育時間產(chǎn)生顯著的影響。高pH對于紫萼蘚的生長有明顯的促進(jìn)作用,而對叢生真蘚、赤蘚具有明顯抑制作用。與pH為6、pH為8相比,pH為7時的培養(yǎng)基能夠使角齒蘚、赤蘚、葫蘆蘚、絹蘚、垂枝蘚的增長速度較為穩(wěn)定。在培養(yǎng)32 d時,各個pH培養(yǎng)環(huán)境的苔蘚生長趨于平穩(wěn),達(dá)到最高峰值。經(jīng)過35 d的觀察記錄發(fā)現(xiàn),原絲體量隨著莖葉體量升高而下降,推測減少的部分原絲體轉(zhuǎn)化為莖葉體,從而繼續(xù)生長。

—■—pH=6;—●—pH=7;—▲—pH=8。

2.3 金屬元素對苔蘚植物生長的影響

隨著培養(yǎng)試驗(yàn)的持續(xù),苔蘚培養(yǎng)基內(nèi)鉀離子質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降的變化趨勢。經(jīng)過測量,空白對照組鉀離子的平均剩余量為39.17 mg/L。由表2可見:角齒蘚對鉀離子的吸收量最高,其培養(yǎng)基中剩余鉀離子質(zhì)量濃度平均為4.63 mg/L,吸收了對照組平均值的88.20%;絹蘚培養(yǎng)基中剩余鉀離子質(zhì)量濃度平均為4.63 mg/L,吸收了對照組平均值的88.17%;垂枝蘚培養(yǎng)基中剩余鉀離子質(zhì)量濃度平均為4.83 mg/L,吸收了對照組的87.66%;角齒蘚為小型苔蘚,絹蘚與垂枝蘚為大型蘚種,說明苔蘚的形態(tài)大小與其吸收鉀元素的量不成正比。而葫蘆蘚對鉀離子的吸收量較小,僅僅吸收了對照組的61.68%;赤蘚、紫萼蘚、叢生真蘚培養(yǎng)基中剩余鉀離子質(zhì)量濃度平均分別為6.45、6.18、9.40 mg/L。苔蘚對元素吸收量的差表明,在培養(yǎng)苔蘚過程中,不同苔蘚所需要添加的元素質(zhì)量濃度有所差異,適當(dāng)增加培養(yǎng)基中鉀元素的質(zhì)量濃度對其有促進(jìn)作用。

表2 苔蘚培養(yǎng)基中4種金屬離子的剩余量

隨著培養(yǎng)試驗(yàn)的持續(xù),苔蘚培養(yǎng)基內(nèi)鈣元素質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降的變化趨勢。經(jīng)過測量,空白對照組鈣離子的平均剩余量為81.98 mg/L。由表2可見:與其它蘚種相比,絹蘚對鈣離子吸收量較大,平均吸收了空白對照的23.46%;其余蘚種對鈣離子吸收量差異不大,角齒蘚培養(yǎng)基中剩余鈣離子質(zhì)量濃度為65.97 mg/L,吸收了空白對照的19.52%;叢生真蘚培養(yǎng)基中剩余鈣離子質(zhì)量濃度為66.27 mg/L,吸收了空白對照的20.10%;葫蘆蘚培養(yǎng)基中剩余鈣離子質(zhì)量濃度為65.91 mg/L,吸收了空白對照的19.60%;赤蘚培養(yǎng)基中剩余鈣離子質(zhì)量濃度為65.50 mg/L,吸收了空白對照的19.16%;紫萼蘚培養(yǎng)基中剩余鈣離子質(zhì)量濃度為65.84 mg/L,吸收了空白對照的19.69%;垂枝蘚培養(yǎng)基中剩余鈣離子質(zhì)量濃度為65.68 mg/L,吸收了空白對照的19.87%。7種苔蘚對鈣離子吸收量的差異不顯著。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)看,在絹蘚的培養(yǎng)過程中,適當(dāng)增加鈣離子質(zhì)量濃度是必要的。

由表2可見:在諾普培養(yǎng)基的離子質(zhì)量濃度范圍內(nèi),7種苔蘚吸收了空白對照的100%,說明鎂離子、鋅離子是苔蘚發(fā)育過程中至關(guān)重要的元素。在今后的試驗(yàn)中,可以適當(dāng)提高鎂離子、鋅離子的質(zhì)量濃度,觀察其吸收程度。

2.4 非金屬元素對苔蘚植物生長的影響

采取鉬酸胺-抗壞血酸比色法測定磷離子質(zhì)量濃度。由表3可見:絹蘚對磷的吸收量最大(平均僅剩余0.64 mg/L),而與其它苔蘚相比,角齒蘚對磷的平均吸收量最小(剩余2.21 mg/L)。不同種類苔蘚對磷的吸收量不同;整體看,除紫萼蘚、角齒蘚、絹蘚以外,每個苔蘚對磷的吸收量差異不顯著。使用流動分析儀測定硝態(tài)氮質(zhì)量濃度。由表3可見:絹蘚對硝態(tài)氮的吸收量最大;與其它苔蘚相比,角齒蘚對硝態(tài)氮的平均吸收量最小,平均剩余0.43 mg/L;說明不同種類苔蘚對于硝態(tài)氮的吸收量不同。整體看,大型、中型蘚種(如垂枝蘚、絹蘚、赤蘚)對于硝態(tài)氮的吸收量較高,而小型蘚種對硝態(tài)氮的吸收相對較少。在此后培養(yǎng)方案中,可以根據(jù)苔蘚配子體的形態(tài)大小適當(dāng)增加氮的質(zhì)量濃度,以此提高其產(chǎn)量。

表3 苔蘚培養(yǎng)基中3種非金屬離子的剩余量

使用硫酸鋇比濁法測定硫離子質(zhì)量濃度。取5支50 mL比色管,分別加入0、1、3、5、7 mL硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mg/L),用蒸餾水稀釋至25 mL,加入8滴HCl、5 mL無水乙醇;搖勻后,加入5 mL氯化鋇(BaCl)溶液;以一定的方式振搖60 s,靜置5 min后作為標(biāo)準(zhǔn)濁度,在波長420 nm處測量吸光度。以硫酸根濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線。由表3可見:垂枝蘚對硫的吸收量最大,與其它苔蘚相比,葫蘆蘚對硫的平均吸收量最小,不同苔蘚對于硫元素的吸收量差異顯著(P<0.05)。黃麗雅等[16]研究表明,硫是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一。硫不僅參與半胱氨酸和蛋白質(zhì)等初生代謝產(chǎn)物的合成,還與硫代葡萄糖苷、植保素、植物螯合肽、維生素、輔酶A等次生代謝物質(zhì)的合成密不可分。因此,適量的硫可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育,提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量,提高植物受環(huán)境脅迫的能力。

3 討論與結(jié)論

礦區(qū)的大量開采,會對周圍土壤環(huán)境造成重金屬污染。王登富等[17]對廢棄卡林型金礦區(qū)苔蘚進(jìn)行研究表明,硬葉扭口蘚(Barbularigidula)對Zn、Cd具有較強(qiáng)的富集能力,可作為Zn、Cd重金屬污染監(jiān)測的指示植物;匡其羽等[18]研究表明,蘚類多樣性與重金屬污染之間的關(guān)系,能夠成為王家灣金礦區(qū)多種金屬污染的生態(tài)監(jiān)測指標(biāo)之一。本研究表明,不同苔蘚對不同的金屬元素吸收程度不同,對鈣離子的吸收,比對鉀離子的吸收相對少,但仍然是不可或缺的元素之一。在非金屬元素中,不同苔蘚對非金屬元素吸收程度的差異,比不同苔蘚對金屬元素吸收程度的差異大,尤其是大型蘚種其吸收的P、S、N明顯高于其它中小型蘚種。通過研究苔蘚對于元素吸收的差異性,能夠?yàn)樘μ\作為指示植物富集功能提供新思路。

苔蘚配子體的消毒方式,決定著苔蘚組織培養(yǎng)試驗(yàn)的成敗,不同苔蘚對于消毒劑的耐受度不同,需要謹(jǐn)慎選擇消毒劑類型,嚴(yán)格把控消毒時間。高葉青[19]使用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡30 s和質(zhì)量濃度為0.1 g/L氯化汞消毒90～120 s,無菌水漂洗至少3次。但根據(jù)本研究試驗(yàn)過程看,體積分?jǐn)?shù)為70%的無水乙醇,比質(zhì)量濃度為0.1 g/L氯化汞與體積分?jǐn)?shù)為1%次氯酸鈉溶液更易提高苔蘚樣本的成活率,并同時降低苔蘚樣本的感染率。本研究表明,大型苔蘚(如垂植蘚、絹蘚等苔蘚)更易出現(xiàn)葉片發(fā)黃等現(xiàn)象,因此要特別注意減少其消毒時長,并使用無菌水漂洗至少3次。

在本次pH梯度試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),pH為6培養(yǎng)基的苔蘚原絲體出現(xiàn)的時間較早,且大幅度縮短了其由原絲體發(fā)育為莖葉體的時間。在今后大面積培養(yǎng)試驗(yàn)中,可以考慮采用偏酸性的基質(zhì),縮短其發(fā)育時間,以增加其產(chǎn)量。在今后大面積培養(yǎng)方案中,為某種目標(biāo)苔蘚定制其適應(yīng)的培養(yǎng)基,能夠有效地減少成本、提高產(chǎn)量。