趙秦英,吳 悅,桂仲璇,張 泉 ,葉映泉,王高翔,張 梅

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界常見惡性腫瘤之一,病死率僅次于肺癌[1-2]。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是結(jié)直腸癌的基石藥物,但是超過50%的結(jié)直腸癌患者對5-FU產(chǎn)生耐藥,阻斷化療進(jìn)程從而導(dǎo)致不良預(yù)后[3]。近期研究[4]表明,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和血管生成誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生耐藥表型,而缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-lα,HIF-1α)/血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路是EMT和血管生成進(jìn)程中的主要誘導(dǎo)因素,目前關(guān)于HIF-1α/VEGF信號通路逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌5-FU耐藥的相關(guān)研究較少。華蟾素(cinobufagin,CINO)是中華大蟾蜍皮中提取的干燥分泌物,其抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗腫瘤等功效已得到有效證實[5],研究[6]結(jié)果顯示,CINO能通過阻斷EMT過程抑制結(jié)腸癌移植瘤小鼠的侵襲轉(zhuǎn)移過程,并且通過HIF-1α/VEGF信號通路有效抑制腫瘤血管生成[7]。該研究旨在探討 CINO對結(jié)腸癌5-FU耐藥細(xì)胞的體內(nèi)抑制作用及其機(jī)制,以期為中西醫(yī)結(jié)合治療結(jié)腸癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT15(貨號:icell-h072)、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT15/5-FU 耐藥細(xì)胞株(貨號:icell-h073)及HCT15/5-FU 人結(jié)腸癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基(貨號:icell-h073-001b)購自上海賽百慷生物有限公司;5-FU(貨號:HY-90006)購自美國MCE 公司;華蟾素注射液購自安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司;MTT檢測試劑盒(貨號:CT0002)購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;ABW 基質(zhì)膠(貨號:0827045)購自上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司;Annexin V-FITC / PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號:BB-4101)購自美國BD公司;E-cadherin(貨號:20874-1-AP)、N-cadherin(貨號:22018-1-AP)購自美國Proteintech 公司;HIF-1α(貨號:AF1009)、Snail(貨號:AF6032)購自美國Affinity 公司;Vimentin(貨號:R22775)、VEGF(貨號:R26073)購自成都正能生物技術(shù)責(zé)任有限公司;LAUDR AQUAline AL 12型水浴鍋購自德國LAUDR公司;PowerPacTMBasic Power Supply 1645050 型電泳儀購自美國BIO-RAD公司; SpectraMax iD3 型酶標(biāo)儀購自美國MOLECULAR公司;CytomicsTMFC 500 型流式細(xì)胞儀購自美國 BECKMAN OULTER公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HCT15、HCT15/5-FU細(xì)胞分別培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基內(nèi),HCT15/5-FU細(xì)胞先是通過在完全培養(yǎng)基中逐漸提高5-FU的濃度(10～20 mg/L)篩選出具有抗藥性的細(xì)胞,然后在含有5-FU(20 mg/L)的培養(yǎng)液中穩(wěn)定培養(yǎng)以維持細(xì)胞耐藥性。

1.2.2細(xì)胞活力分析 取對數(shù)生長期的HCT15或HCT15/5-FU接種到96孔板中(1×104個/孔)。細(xì)胞生長24 h后,加入5-FU(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L)或5-FU (12 mg/L)+CINO(0.0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 mg/ml)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,吸去上清液,每孔加入90 μl 新鮮培養(yǎng)液、10 μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸除上清液,每孔加入110 μl Formazan 溶解液,避光慢搖10～15 min 后,于酶標(biāo)儀490 nm 處讀取吸光度(optical density,OD)值,實驗重復(fù)3 次,繪制細(xì)胞生長折線圖并計算半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concetration,IC50)值和耐藥指數(shù)(resistance index,RI),抑制率=[ (OD實驗組- OD空白組) /(OD對照組-OD空白組)]×100%,RI=HCT15/5-FU 細(xì)胞的IC50/HCT15細(xì)胞的IC50,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=使用 CINO前的IC50/使用CINO 后的IC50。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)實驗 將對數(shù)生長期HCT15/5-FU耐藥細(xì)胞株(1×105個/孔)接種于6 孔板中,培養(yǎng)24 h后,吸棄培養(yǎng)液,將5-FU (12 mg/L)+CINO(0、1、2、4 mg/ml)細(xì)胞培養(yǎng)液作用于細(xì)胞48 h后收集各組細(xì)胞,冷PBS洗2遍后用Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞至適宜濃度,再加入Annexin V-FITC 染色液避光孵育15 min 后,加PI 染料避光孵育5 min 后在流式細(xì)胞儀中檢測并分析細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3 個復(fù)孔,重復(fù)3 次。

1.2.4劃痕實驗 將對數(shù)生長期的HCT15/5-FU耐藥細(xì)胞株(1×105個/孔)接種于6 孔板中,培養(yǎng)24 h后用 p200 槍頭沿直尺豎直劃線,去除原培養(yǎng)液,將5-FU (12 mg/L)+CINO(0、1、2、4 mg/ml) 細(xì)胞培養(yǎng)液作用于細(xì)胞48 h 后收集各組細(xì)胞,在0 、48 h 的時間點分別拍照。每組設(shè)3 個復(fù)孔,重復(fù)3 次。

1.2.5Transwell小室遷移與侵襲實驗 將200 μl 的HCT15/5-FU 細(xì)胞懸液(1×105個/ml)接種于小室的上室(侵襲實驗的小室提前用60 μl 稀釋的基質(zhì)膠包被)。下室加入600 μl 含5-FU (12 mg/L)+CINO(0、1、2、4 mg/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)液,作用細(xì)胞48 h 后,取出上室,4%多聚甲醛固定20 min,結(jié)晶紫染色10 min,每個小室隨機(jī)選取5 個區(qū)域拍照、計數(shù)并分析數(shù)據(jù)。

1.2.6Western blot實驗 用5-FU (12 mg/L)+CINO(0、1、2、4 mg/ml)培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞,提取蛋白后,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜,10%脫脂牛奶搖床敷育2 h 后, 4 ℃ 敷育一抗過夜。次日,TBST 洗膜3 次,二抗室溫孵育1 h 后,TBST 3 次,使用ECL 發(fā)光液顯影。采用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析,測得條帶的灰度值,以各組目的蛋白與內(nèi)參(GAPDH)蛋白灰度值的比值來反映目的蛋白的相對表達(dá)水平,比較各組間的差異。每組實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 HCT15/5-FU細(xì)胞耐藥性的鑒定及CINO對 HCT15/5-FU 細(xì)胞耐藥性的影響如圖1A所示,5-FU (0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L) 作用于細(xì)胞48 h,HCT15 的IC50為(1.476±0.265 7)mg/L,HCT15/5-FU的 IC50為(12.87±0.636 4)mg/L,耐藥指數(shù)RI約為8.720 倍。在5-FU各濃度作用下,HCT15/5-FU 細(xì)胞的抑制率明顯低于HCT15 細(xì)胞 (F=9.692,P<0.05),說明HCT15/5-FU細(xì)胞對5-FU產(chǎn)生耐藥性。

圖1 5-FU或CINO對HCT15和HCT15/5-FU細(xì)胞生長抑制作用

如圖1B顯示,CINO(0.0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 mg/ml)作用HCT15/5-FU細(xì)胞12、24、48、72 h,對應(yīng)的IC50分別為(27.08 ±2.609)、(9.943±0.295 2) 、(3.989±0.640 6)、(6.903±0.758 7)mg/L,計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為0.475、1.294、3.226、1.857,提示CINO在48 h時,對HCT15/5-FU細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)效果最好,因此,在后續(xù)實驗中以48 h作用時間為標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 CINO對HCT15/5-FU細(xì)胞凋亡能力的影響如圖2結(jié)果所示,與對照組(5-FU 12 mg/L 單獨作用)(3.33±0.577)%相比,5-FU (12 mg/L)+CINO(1、2、4 mg/ml)作用48 h,HCT15/5-FU細(xì)胞凋亡率分別為(8.33±0.577)%、(13.33±1.528)%、(19.00±1.000)%,提示CINO具有誘導(dǎo)HCT15/5-FU細(xì)胞凋亡的能力,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=135.3,P<0.05)。

圖2 CINO對HCT15/5-FU細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 CINO對HCT15/5-FU細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響劃痕實驗顯示(圖3A、C),與對照組(5-FU 12 mg/L 單獨作用)相比,5-FU (12 mg/L)+CINO(1、2、4 mg/ml)作用48 h后,CINO顯著降低細(xì)胞劃痕愈合率(F=68.63,P<0.01),呈現(xiàn)濃度依賴性; Transwell遷移實驗顯示(圖3B、D),與對照組(5-FU 12 mg/L 單獨作用)相比,5-FU (12 mg/L)+CINO(1、2、4 mg/ml)作用48 h后,遷移細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)濃度依賴性的減少(F=276.1,P<0.01); Transwell 侵襲實驗表明(圖3B、D),與對照組(5-FU 12 mg/L 單獨作用)相比,5-FU (12 mg/L)+CINO(1、2、4 mg/ml)作用48 h后,侵襲細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)濃度依賴性地減少(F=182.9,P<0.01)。

圖3 CINO對HCT15/5-FU細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

EMT與結(jié)腸癌5-FU耐藥機(jī)制具有密切關(guān)系,為了檢測HCT15/5-FU細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),該實驗通過Western blot實驗對E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示(圖3E、F),CINO 明顯地上調(diào) E-cadherin 蛋白表達(dá)(F=94.31,P<0.01), 并具有濃度依賴性。對 N-cadherin 、Vimentin 、Snail 蛋白表達(dá)具有不同程度的抑制作用,與對照組(5-FU 12 mg/L 單獨作用)相比,N-cadherin 、Snail 在CINO 各濃度組均顯著降低(FN-cadherin=68.57,P<0.01;FSnail=131.9,P<0.01); 在CINO≥2 mg/ml 時, Vimentin 蛋白表達(dá)明顯下降(F=92.45,P<0.01)。

2.4 CINO對HCT15/5-FU細(xì)胞HIF-1α/VEGF信號通路的影響HIF-1α/VEGF信號通路在結(jié)腸癌5-FU耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用,并與EMT、血管生成密切相關(guān)。因此,該研究對HCT15/5-FU中HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,如圖4結(jié)果所示,在CINO≥2 mg/ml時,對結(jié)直腸癌5-FU耐藥的潛在生物標(biāo)志物HIF-1α蛋白表達(dá)具有抑制作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=84.33,P<0.01);VEGF在CINO各濃度組均顯著降低,并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=176,P<0.01)。說明HIF-1α/VEGF信號通路在CINO逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌5-FU耐藥中發(fā)揮功效,并呈現(xiàn)被抑制狀態(tài)。

圖4 Western blot檢測CINO對EMT、HIF-1α/VEGF相關(guān)蛋白的影響

3 討論

5-FU的應(yīng)用提高了結(jié)直腸癌患者的生存率,但其耐藥性是阻礙治療進(jìn)程的主要因素之一[8]。因此,研究結(jié)直腸癌5-FU耐藥機(jī)制,對尋找克服5-FU耐藥的治療策略至關(guān)重要。血管生成在化療耐藥機(jī)制中占有重要地位[9],VEGF作為最有效的促血管生成因子,在5-FU耐藥細(xì)胞的機(jī)制中主要受HIF-1α的調(diào)控,HIF-1α在低氧狀態(tài)下與VEGF基因中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合,誘導(dǎo)VEGF蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯,激活多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein, MDR)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)的表達(dá),刺激腫瘤EMT、血管生成以及化療耐藥的發(fā)生[10]?？寡苌伤幬飸?yīng)時而生,其中的代表藥物貝伐珠單抗具有結(jié)合VEGF所有結(jié)合位點、從源頭上阻斷血管生成的功能[11],是目前結(jié)直腸癌的一線治療藥物。雖然目前抗血管生成治療顯著改善了轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的預(yù)后,但抗血管生成治療期間出現(xiàn)的不良反應(yīng)限制了其治療效果。因此,尋找毒副作用小的抗血管生成藥物仍然是需要努力的目標(biāo)。

中醫(yī)藥具有低毒有效等特點,CINO作為中華大蟾蜍皮的干燥提取物,其抗癌作用已在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中取得有效進(jìn)展[12]。研究[13]表明,通過下調(diào)糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表達(dá),CINO能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的狀態(tài);胡葉 等[14]顯示,CINO具有抑制血管生成的功效,其機(jī)制與阻斷VEGF和VEGFR-2的結(jié)合相關(guān);Yang et al[15]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測CINO具有抑制HIF-1α/VEGF信號通路的潛力。目前CINO通過調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌5-FU耐藥的研究處于空白狀態(tài)。課題組以HCT15/5-FU耐藥細(xì)胞為研究對象、CINO為干預(yù)條件,研究CINO對HCT15/5-FU耐藥細(xì)胞的影響及其具體機(jī)制。MTT實驗結(jié)果表明CINO對5-FU治療具有增敏作用。Western blot實驗表明CINO是通過抑制結(jié)直腸癌5-FU耐藥的潛在生物標(biāo)志物HIF-1α蛋白的表達(dá)而發(fā)揮5-FU增敏作用,提示CINO有望成為臨床治療中的化療增敏劑。流式細(xì)胞凋亡實驗顯示CINO與5-FU的聯(lián)合使用顯著促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為細(xì)胞總凋亡率的增加。劃痕實驗、Transwell實驗結(jié)果顯示,CINO顯著抑制耐藥細(xì)胞遷移、侵襲能力,這一結(jié)果在Western blot中被驗證,表現(xiàn)為上調(diào)EMT上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平,抑制間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、細(xì)胞支架標(biāo)志物Vimentin以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白的表達(dá)。Western blot評價了CINO聯(lián)合5-FU對血管生成的影響,結(jié)果顯示與5-FU單獨使用相比,CINO與5-FU的聯(lián)合使用顯著抑制VEGF的表達(dá),并且抑制效果呈顯著的劑量依賴性,進(jìn)一步驗證了CINO通過下調(diào)HIF-1α/VEGF信號通路發(fā)揮逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌5-FU耐藥功效。

綜上所述,體外研究顯示CINO具有逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌5-FU耐藥的功效,其機(jī)制與HIF-1α/VEGF信號通路有關(guān)。但該研究尚且存在一定的不足之處,例如:未開展相應(yīng)的動物體內(nèi)實驗、體外實驗細(xì)胞株種類單一、對HIF-1α/VEGF信號通路的上游靶點未進(jìn)行深入探索等,課題組將針對這些問題繼續(xù)開展后續(xù)工作,進(jìn)一步完善豐富CINO逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌5-FU耐藥的相關(guān)研究。