鄧煜 侯佳

摘要 ?玫瑰為薔薇目薔薇科植物，屬于落葉灌木，歷史悠久，是我國傳統(tǒng)的名花之一，有著很高的觀賞、藥用和食用價值。玫瑰花含有豐富的類黃酮素，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性功能，因此玫瑰類黃酮素的研究受到了很多學(xué)者的關(guān)注。 從植物類黃酮的提取與檢測2個方面進(jìn)行探討總結(jié)，分析比較不同方法的特點和原理，從而為玫瑰類黃酮素的研究利用提供豐富的技術(shù)方法和思考途徑。

關(guān)鍵詞 ?玫瑰；類黃酮素；提??；檢測

中圖分類號 ?R284 ??文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0008-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.003

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Research Progress on Extraction Method and Quantitative Detection Method of Flavonoids from Rose

DENG Yu1，HOU Jia2

（1.School of Horticulture and Plant Protection，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；2.Vocational and Technical College，Inner Mongolia Agricultrual University，Baotou，Inner Mongolia 014109）

Abstract ?Rose is a deciduous shrub of the Rosaceae family. It is a traditional famous flower in my country. It is rich in nutrients and has high ornamental， medicinal and edible value. Rose is rich in flavonoids， which have various biological activities such as antioxidant， anti-aging， and anti-tumor. Therefore， the research on rose flavonoids has attracted the attention of many scholars. This paper mainly discusses and summarizes the extraction and detection of plant flavonoids， analyzes and compares the characteristics and principles of different methods， so as to provide rich technical methods and thinking ways for the research and utilization of rose flavonoids.

Key words ?Rose;Flavonoids;Extraction;Detection

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）屬于薔薇科薔薇屬植物，為多年生常綠或落葉的觀花灌木，特性是抗逆性強(qiáng)、花色多樣、花香撲鼻，有很好的表達(dá)意義，在我國乃至世界花卉發(fā)展上都有著很高的地位。玫瑰分布范圍較廣，世界多地均有大規(guī)模栽種，新疆、山東、甘肅、云南等地為我國主要的玫瑰生產(chǎn)基地。我國玫瑰野生資源破壞嚴(yán)重， 僅遼東半島和吉林琿春尚有分布。因此，野生玫瑰已列為我國二級保護(hù)植物［1］。種植玫瑰在各方面有著很高的價值，其不但可以用于園林綠化，而且還是重要的工業(yè)和醫(yī)藥材料，有著十分突出的觀賞、藥用和食用價值［2］。

1 類黃酮素研究現(xiàn)狀

類黃酮素化合物是玫瑰花中的一種天然化合物，近年來因其功能性突出而成為研究熱點。黃酮類化合物有著很多對人體有益的生理活性作用，它有抗?jié)?、抗菌、抗炎、降血脂和?zhèn)痛等作用，玫瑰花的各種附加利用價值和其體內(nèi)所含的類黃酮素有著很大關(guān)聯(lián)［3］。張蓮莉等［4］對苦水、金枝、平陰3種主要的食用玫瑰的茶湯及甲醇提取物進(jìn)行抗氧化活性測試，均具有較好的抗氧化效果，其中金邊和平陰玫瑰茶花中黃酮類成分含量與抗氧化活性相關(guān)系數(shù)大于0.9。Lee等［5］利用甲醇溶液提取玫瑰花，并研究證實了玫瑰花的甲醇浸提物可以通過抑制乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性而抑制人前列腺細(xì)胞系的生長。何熹等［6］建立高血脂的大鼠模型，并用不同濃度玫瑰黃酮對其進(jìn)行36 d灌胃，結(jié)果顯示高、中、低濃度的玫瑰黃酮均能明顯降低大鼠的血清甘油三酯（TG）水平，低濃度黃酮對提高高密度脂蛋白（HDL-C）效果不顯著，中、高濃度黃酮提高血清高密度脂蛋白效果顯著。郭玉婷等［7］對新疆小枝玫瑰的降血糖活性進(jìn)行了研究，通過水提與醇提的玫瑰花提取液作用于α-葡萄糖苷酶， 均對α-葡萄糖苷酶活性具有較好的抑制作用，且醇提后的玫瑰花提取液效果要優(yōu)于水提。丁婷婷等［8］提取山刺玫總黃酮作用于小鼠模型組中，結(jié)果顯示衰老組模型比對照組小鼠的腦組織神經(jīng)元細(xì)胞有所增加，變性及壞死的細(xì)胞數(shù)量減少，且與給藥濃度呈劑量依賴性。王軍喜等［9］采用濾紙片法測定了玫瑰露的抑菌效果，以不同種類的細(xì)菌、霉菌和酵母菌種為試驗對象，分別加入玫瑰花露。測試結(jié)果顯示，在3類試驗對象中，玫瑰花露對細(xì)菌表現(xiàn)出最好的抑菌效果，其中抑制沙門氏菌的生長效果最為明顯，其MIC為0.98 mL/L。

2 類黃酮素提取方法

根據(jù)相似相溶原理，提取物質(zhì)類黃酮素化合物組分，將其轉(zhuǎn)入提取溶液中，這就是類黃酮的提取原理。類黃酮素種類多，結(jié)構(gòu)來源不同，其溶解能力也隨之不同。針對不同類型植物、不同種類黃酮化合物，應(yīng)當(dāng)考慮其特性選擇適當(dāng)?shù)娜軇?/p>

類黃酮素提取的每個階段都至關(guān)重要，可以把過程簡單概括為選擇原料、預(yù)先處理、浸提和分離純化。其中對細(xì)胞進(jìn)行干燥、粉碎等預(yù)處理可以使得溶劑更易進(jìn)入細(xì)胞，從而提高提取類黃酮素的效率。而浸提過程的目的也是提高擴(kuò)散速度和增加提取效率。分離純化階段就是將提取出來溶液中的其他無關(guān)雜質(zhì)分離出去，但通過多年試驗結(jié)果，任何分離純化方法都只是相對性的去除雜質(zhì)，同理，類黃酮獲得率也只是相對性的提高［10］。

目前醇類提取、堿提以及其他溶劑提取等傳統(tǒng)溶劑提取法運(yùn)用較為廣泛，但還包括超臨界流體萃取、酶工程、物理場輔助等一些新興提取技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)提取法獲得率低、耗能大，溶液含雜質(zhì)多。因此，更多的新興提取方法被研究運(yùn)用于類黃酮素提取中。曾惠明等［11］采用單因素法對比乙醇加熱回流浸提、微波提取、超聲波提取以及組合工藝提取類黃酮素的效果，優(yōu)化其工藝參數(shù)。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，乙醇加熱回流浸提效果最佳，微波和超聲輔助雖然浸提率較低，但作用時間短，能耗較低。三元組合工藝具有較大優(yōu)勢，提取率為3.17 mg/g，可將提取率提高15.7%。

2.1 溶劑提取法

溶劑提取法是一種較經(jīng)典的提取方法，也是目前實驗室常用方法之一。它是根據(jù)植物類黃酮的極性和溶解度不同，使用適當(dāng)?shù)娜軇⑵鋸闹参镏刑崛〕鰜恚?2］。根據(jù)提取介質(zhì)的不同，可以分為醇提法、堿提法、有機(jī)溶劑提取法。

醇類提取法經(jīng)常以甲醇和乙醇2種物質(zhì)作為常用類黃酮素提取劑。在實際實驗中，大多運(yùn)用冷浸漬法或者回流熱提取法。冷浸漬法不用加熱，過程簡單，可操作性強(qiáng)，能很好地保持提取物的穩(wěn)定性，但整個提取過程需要重復(fù)多次，溶劑消耗大，耗時且效率、質(zhì)量低；回流熱提取法提取的類黃酮得率高、效率快，但需要重復(fù)提取，注重加熱條件，因此成分不穩(wěn)定的原料不宜采用該方法［13］。王琴飛等［14］發(fā)現(xiàn)，以40%和80%的乙醇水溶液，在料液比為1 ∶ 75 （g ∶mL）條件下，可快速有效提取木薯中4種黃酮醇物質(zhì)。李焱［15］利用有機(jī)溶劑回流提取法提取出了紫果西番蓮種籽中類黃酮的含量，約為151.34 mg/g，并對該方法進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)以90 ?℃的溫度，用70%的乙醇處理料液比例為1 ∶ 60 （g ∶mL）的溶液2.5 h時，可以得到最佳的優(yōu)化提取工藝。

酚羥基可以與堿類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，而黃酮類化合物中具有該成分，因此，堿性提取法能夠充分被利用于提取黃酮化合物中。首先使用堿性溶液［如NaOH、Ca（OH）2等］將類黃酮素浸取出來，之后再將浸出溶液與酸性試劑反應(yīng)，最終提取出所需的黃酮化合物，也被稱為堿提酸沉提取法。其中浸出過程不能使用高濃度堿溶液，防止破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)［10］。因此，楊德全等［16］研究提出了堿提酸沉加醇法，其過濾工藝過程較為順利，干燥、簡單、快速，但由于在酸性稀醇中，類黃酮素會溶解一部分，所以最終得率較低。吳劍等［17］利用氫氧化鈉溶液，以pH 10的堿性溶液運(yùn)用熱浸提方法提取柑橘皮渣中的類黃酮。試驗后發(fā)現(xiàn)以64.6 ℃為基礎(chǔ)溫度，將料液比為1 ∶ 12 （g ∶mL）的溶液熱浸提2.2 h時提取效果最佳，得率為0.115%。

有機(jī)溶劑萃取法用于輔助純化其他方法。將原料用其他方法提取后，再用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑（如乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等）進(jìn)行萃取、過濾，最后將濾液減壓蒸餾回收后測定類黃酮素含量。該方法操作設(shè)備簡易，產(chǎn)品獲得率高，尤其使用丙酮可以得到較高的類黃酮素含量，因此應(yīng)用十分廣泛。

2.2 超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界流體萃取技術(shù)是利用臨界或超臨界狀態(tài)的流體及被萃取的物質(zhì)在不同的蒸汽壓力下所具有的不同化學(xué)親和力和溶解能力進(jìn)行分離純化的操作。被用作超臨界流體的溶劑有CO2、H2O、C2H4、C3H8、CH3OH、NO2等，其中CO2最易于達(dá)到臨界條件，并且無污染、存在廣泛易于制得。

CO2超臨界萃取法在高低壓狀態(tài)下，利用液態(tài)CO2提取后汽化而使得類黃酮素化合物分離。該方法一步完成，提取時間短、條件適宜，并能很好地保持類黃酮化合物的活性，并且提取得率高，無污染［18］。潘利華等［19］利用超臨界流體萃取法研究發(fā)現(xiàn)了大豆異黃酮的最佳提取條件：以55 ℃、30 MPa的環(huán)境萃取，液態(tài)CO2流量為8 L/h。

研究發(fā)現(xiàn)，在CO2超臨界萃取類黃酮過程中，溶液中類黃酮濃度隨著萃取進(jìn)程的深入而升高，因此使用CO2超臨界萃取技術(shù)不僅能萃取、分離產(chǎn)物，還可具有濃縮的功能。CO2超臨界萃取是在密閉環(huán)境中進(jìn)行，因此除了萃取玫瑰類黃酮外，還能提取揮發(fā)性強(qiáng)的玫瑰精油，而且作用條件溫和，溶劑不殘留，不影響產(chǎn)品的品質(zhì)，為玫瑰后續(xù)更高價值提供了新思路［6］。

2.3 酶輔助工程提取法

酶輔助提取法的實質(zhì)就是利用酶的專一性，使細(xì)胞壁溶解，釋放內(nèi)部的活性物質(zhì)，并且分解雜質(zhì)，從而提取出所需成分［20］。其中纖維素酶、果膠酶、復(fù)合酶等近些年被較多地應(yīng)用于類黃酮素的提取［21］。

酶輔助提取法常與溶劑提取法聯(lián)用，從而提高得率。選用合適的專用酶輔助，可以將油溶性的類黃酮素轉(zhuǎn)化為水溶性，還可以分解植物組織達(dá)到利于提取的目的，更能去除雜質(zhì)，簡化工藝流程。該提取法不僅具有成本低、提取率高、目的性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點，而且為綠色化學(xué)提供了可能，在類黃酮的提取中被廣泛應(yīng)用。朱華［22］利用酶輔助提取地錢中總黃酮化合物，并提出了最佳提取條件：使用0.2 mg/mL濃度的酶-1介質(zhì)，料液比為1 ∶ 20 （g ∶ml），以50 ℃、pH 4.5的環(huán)境條件酶解120 min，得到1.96%的總黃酮。

2.4 物理場輔助提取技術(shù)

超聲波輔助提取法是利用超聲波效應(yīng)，破壞植物細(xì)胞壁，使天然化合物成分能夠快速地被提取到有機(jī)溶劑當(dāng)中，起到了輔助類黃酮提取的效果［23］。應(yīng)用超聲波技術(shù)輔助提取植物類黃酮成分，操作簡便，可以縮短提取時間，提高提取效率，但溶劑消耗量較大。戢得蓉等［24］以雪蓮果葉為原料，設(shè)計單因素及響應(yīng)面試驗，優(yōu)化超聲波輔助酶法提取雪蓮果葉中總黃酮的最佳工藝。結(jié)果表明：利用超聲波輔助酶法提取雪蓮果葉總黃酮的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1 ∶ 60 （g ∶mL）、超聲溫度50 ℃、超聲處理12 min、酶解pH 4.8、纖維素酶質(zhì)量濃度0.40 mg/mL、酶解時間66 min，該工藝下總黃酮提取率為6317%。利用超聲波輔助酶法提取的雪蓮果葉中總黃酮提取物具有較好的抗氧化能力。

微波場輔助提取技術(shù)可以利用微波場使細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境發(fā)生變化，出現(xiàn)溫度升高、壓力變大的現(xiàn)象，直至細(xì)胞破裂，內(nèi)部物質(zhì)被釋放，黃酮化合物被周圍的溶劑溶解，從而快速溶出。其原理就是利用微波場作用加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)擴(kuò)散溶解、釋放、被提取，可以很明顯地獲得較高含量的黃酮化合物［25］。采用微波輔助提取植物類黃酮，可以大大縮短提取時間，節(jié)約能源，提高提取效率［26］。張玉等［27］用水提取類黃酮化合物，再利用微波法輔助，進(jìn)而提出了以料水比為1 ∶ 4時，65 ℃處理4 min的微波法輔助提取柑橘皮渣中類黃酮的適宜條件，從而得到1.03%的類黃酮化合物。

2.5 其他新興提取技術(shù)

超濾技術(shù)實質(zhì)上就是以錯流的形式過濾溶劑，從而達(dá)到分離純化的效果［28］。該類技術(shù)無加熱、高壓等特殊操作、不用添加任何試劑、能重復(fù)利用、分離快效果好。

高速離心分離技術(shù)利用離心機(jī)運(yùn)作，達(dá)到去除雜質(zhì)分離所需組分的效果［29］。該方法保證了提取率和提取物的穩(wěn)定性，并且耗時短、成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

高速逆流色譜技術(shù)根據(jù)相對平衡的2種溶劑，將其中具有不同分配比的組分分離出來［30］。用于類黃酮的分離純化時，該技術(shù)產(chǎn)出快，質(zhì)量高、耗費(fèi)溶劑少、不污染類黃酮提取物。

3 類黃酮素檢測方法

針對類黃酮素化合物的檢測，有很多不同方法。目前研究檢測類黃酮素主要包括光譜分析、色譜分析和電化學(xué)分析3大類方法，每種檢測技術(shù)各有特點［31］。

3.1 光譜分析——分光光度計法

研究發(fā)現(xiàn)酚羥基及其還原性羰基結(jié)構(gòu)可以與金屬鹽離子試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，形成有色配合物，而類黃酮素化合物有類似的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。分光光度計法原理就是利用這種原理進(jìn)行顯色反應(yīng)，等達(dá)到平衡后，再測定溶液吸光度，進(jìn)而檢測出溶液溶質(zhì)中黃酮化合物的濃度。該類方法操作簡單，使用簡易，運(yùn)用成本低，但在測定含量方面不太精準(zhǔn)。

傅春燕等［32］利用紫外分光光度計法測定瓜馥木中黃酮的含量，選擇9個不同產(chǎn)地的瓜馥木進(jìn)行比較，波長定為516 nm，試驗結(jié)果表明，瓜馥木中總黃酮的濃度與其吸光度呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，其中有著0.025 6的相關(guān)度，平均9976%的回收率，RSD為2.85%。

3.2 色譜分析測定法

類黃酮素化合物不易揮發(fā)，但受熱極易分解，具有紫外吸收和熒光、分子離子峰穩(wěn)定的特點，因此高效液相色譜法［33］能夠很好地利用上述類黃酮素特性對其進(jìn)行含量測定。劉暢等［34］采用HPLC技術(shù)測定分析龍帥、龍紅、龍秋等6個蘋果果實類黃酮物質(zhì)，結(jié)果表明，12種類黃酮組分因品種不同，所占比例表現(xiàn)出較大差異，通過對不同蘋果品種間類黃酮組分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)類黃酮各組分之間存在顯著相關(guān)性。該類技術(shù)試驗操作精準(zhǔn)，可重復(fù)測定且特性良好，十分適用于黃酮化合物測定，但成本要價較高。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）能夠充分地定性定量分析各種已知或未知的組分。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用LC-MS法的代謝組學(xué)研究已經(jīng)被充分應(yīng)用于果樹類的黃酮化合物測定分析中［35］。該類方法利用已存的數(shù)據(jù)庫，能夠更加全面地檢測出更多種類的類黃酮素化合物。在實際運(yùn)用中，最好根據(jù)所需試驗?zāi)康倪x擇不同檢測方法，甚至聯(lián)合多種方法進(jìn)行工作［36］。

薄層色譜掃描法（TLCS）實質(zhì)上就是掃描光照射在薄層板上所出現(xiàn)的特殊斑點光譜，從而得到圖像數(shù)據(jù)，進(jìn)而對化合物進(jìn)行定量檢測分析。高淑云等［37］使用薄層掃描法測定麻葉千里光中黃酮化合物的含量，約為0.783%，回收率992%。之后又采用紫外分光光度法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，薄層色譜掃描法更為快速準(zhǔn)確，檢測率高。該方法利用樣本數(shù)量少，檢測分析靈敏、快速，并且結(jié)果比較精確，RSD達(dá)到1%～2%甚至更小的誤差。針對樣本中極其微量的黃酮化合物，TLCS法也可以掃描測定出所含含量［38］。

色譜分析中，超臨界流體色譜法（SFC）也作為一種新興技術(shù)來檢測類黃酮素化合物。類黃酮素中羥基會因為化合物不同而出現(xiàn)分布位置和數(shù)量上的差異，因此，不同黃酮化合物在超臨界CO2中的極性和溶解度也會有所不同，甚至差異極大。流動相構(gòu)成、環(huán)境溫度等因素均對超臨界流體色譜法的效果產(chǎn)生影響。王學(xué)軍等［39］利用SFC法分析測定了銀杏葉類黃酮化合物中槲皮素和蘆丁的含量，試驗過程中以在超臨界CO2下，具0.05％濃度三氟乙酸的乙醇溶液為溶劑，且比例為10 ∶ 1，結(jié)果測定出槲皮素

回收率99.2%、RSD 23％，而蘆丁回收率101.3%、RSD 2.8％。

3.3 電化學(xué)分析——毛細(xì)管電泳法

針對植物中類黃酮素的定量檢測，電化學(xué)分析法主要是毛細(xì)管區(qū)域電泳（CZE）［40］。毛細(xì)管電泳法是一種電泳分離分析方法。其本質(zhì)就是根據(jù)所研究樣品中各種物質(zhì)間的流通性和分配差異，從而分離出所需組分進(jìn)行檢測。該類技術(shù)樣本處理方便，耗量低、操作簡易快速、能很好地適應(yīng)外界環(huán)境，并且可以分離檢測雙操作，獲得率高。白新偉等［41］運(yùn)用柱前衍生-毛細(xì)管電泳法分離測定苦蕎殼中的8種黃酮類化合物，結(jié)果顯示，在最優(yōu)條件下，8種黃酮類化合物衍生物可在9 min內(nèi)實現(xiàn)快速高效的基線分離和測定；8種黃酮類化合物衍生物在一定的范圍內(nèi)和其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，并在苦蕎殼樣品中檢出了5種黃酮類化合物。

4 小結(jié)

玫瑰具有重要的開發(fā)價值，而其含有的黃酮類化合物因具有對人體健康有利的生理活性而成為目前研究的熱點［42］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，類黃酮素的提取與檢測方法也層出不窮， 該研究主要探討了傳統(tǒng)方法和部分新興輔助技術(shù)。通過對近年的研究分析，類黃酮素的提取檢測大多都采用了多重方法相結(jié)合的形式，這種方式即充分考慮了試驗材料的適配度，也盡力保證了類黃酮素的提取得率和檢測準(zhǔn)確性。

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