杜 燕 唐 瑜 歐 霞 林 麗 張 中 汪瑤臺 羅 勇 鄒建中

惡性腫瘤會嚴重影響人類心身健康，尤其是乳腺癌，作為女性最常見的惡性腫瘤之一，受環(huán)境、遺傳、生活方式等影響，近年其發(fā)病呈年輕化趨勢［1-2］。因此，迫切需要探索一種精準的診療方式，早期發(fā)現并對癥治療，以減輕手術、放化療帶來的身體及心理負擔，提高患者生活質量［3］。高強度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）作為一種非侵入性腫瘤消融新技術在臨床已廣泛應用，納米粒協同HIFU可以提高消融腫瘤的效率，但其存在靶向性差、成像模式單一的局限。因此，如何更安全、高效地提高納米粒協同HIFU 消融腫瘤的療效是臨床亟需解決的問題。本實驗通過制備載IR780/全氟己烷（PFH）的脂質體納米粒（IR780-CLs），旨在實現診療一體化的目的，為乳腺癌的精準診療提供新思路。

材料與方法

一、主要實驗材料及儀器

1.主要材料：IR780 碘化物（美國Sigma 公司）；二甲基亞砜（DMSO）、三氯甲烷（重慶川東化工有限公司）；二棕櫚?；蚜字―PPC）、聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000-Amine）、膽固醇鹽酸鹽（美國Avanti公司）；PFH（上海麥克林生化科技有限公司）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、細胞膜紅色熒光探針（DiI）均由上海碧云天生物技術有限公司提供；4T1 乳腺癌細胞由重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所提供。

2.主要儀器：聲震儀（XL2020，美國Sonic 公司）；旋轉蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；透射電鏡（H-7600，日本日立公司）；Zeta 電位及粒度分析儀（美國布魯克海文儀器公司）；超聲波清洗儀（上海超聲儀器有限公司）；電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；紫外分光光度計（NanoDrop 2000，美國Thermo Scientific 公司）；高速離心機（德國Eppendorf 公司）；光聲成像系統(tǒng)（Vevo LAZR，加拿大Visual Sonics 公司）；共聚焦顯微鏡（A1+R，日本Nikon 公司）；DFY 軟件（重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所），JC 200 海扶刀?聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)（重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司）。被動空化檢測由空化檢測換能器（V309-SU，焦距40 mm，直徑13 mm，中心頻率5 MHz，美國泛美公司）、NI 超高速數據采集卡（PXIe-5122，美國國家儀器有限公司）及LabVIEW 數據采集程序（v10.0.1，美國國家儀器有限公司）組成。

二、實驗方法

1.IR780-CLs的制備：使用電子天平按質量比12∶4∶4∶1精密稱取DPPC、DSPE-PEG2000-Amine、膽固醇鹽酸鹽、IR780 碘化物，加入100 ml 的圓底燒瓶內，并將15 ml 三氯甲烷置于水浴鍋內充分溶解。于避光條件下將裝有混合物的圓底燒瓶連接在旋轉蒸發(fā)儀上，設置參數為45℃、100 r/min，1 h 后去除圓底燒瓶內的三氯甲烷，瓶壁形成均勻的脂質體薄膜。加入2 ml PBS至燒瓶內，置于超聲波清洗儀上充分振蕩使脂質體薄膜完全溶解，將溶解后的脂質體溶液轉移至10 ml EP管內，加入200μl PFH，在冰浴條件下將上述混合液用聲振儀均質乳化3 min（功率125 W，工作時間2 s，間歇1 s）。將乳化后的IR780-CLs 溶液轉移至15 ml 離心管，加入雙蒸水至10 ml再放入高速離心機（8000 r/min、5 min）中洗滌3 次，棄掉離心后的上清液和未包裹的材料，得到同時包裹IR780 與PFH 的脂質體納米粒白色沉淀，最后加入10 ml 去離子水重懸納米粒，置于4℃冰箱保存、備用。

2.IR780-CLs 基本理化性質的檢測：將制備好的IR780-CLs 用去離子水稀釋后，使用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)，Zeta 電位及粒度分析儀檢測其電位和粒徑。將IR780 碘化物溶解于DMSO 配置成不同濃度（1、2、5、10、20、30、40μg/ml）的混合液，使用紫外分光光度計檢測其特異性吸收峰和不同濃度IR780 在特異性吸收峰下的吸光度，并繪制標準曲線計算其包封率。

3.IR780-CLs 的體外靶向性檢測：將對數生長的4T1 乳腺癌細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24 h 后加入DiI 標記的IR780-CLs，分別孵育0.5、2、4 h 后用PBS 洗滌3 次，去除多余納米粒，并用4%多聚甲醛固定細胞，最后避光加入DAPI進行細胞核染色，使用共聚焦顯微鏡觀察納米粒與4T1乳腺癌細胞的結合情況。

4.IR780-CLs 的體外雙模態(tài)成像：①體外超聲成像。使用瓊脂糖凝膠粉制作帶孔的固體脂糖凝膠模型，取PBS和IR780-CLs溶液（80μg/ml）各1 ml置于瓊脂糖凝膠塊中，用120 W、3 s 的能量輻照，采集輻照前后的二維及超聲造影圖像，并用DFY 軟件對回聲信號的灰度變化值進行定量分析。②體外光聲成像。使用瓊脂糖凝膠粉制作帶孔的固體脂糖凝膠模型，將IR780-CLs 配置成不同濃度（20、40、60、80 μg/ml）溶液，取上述溶液各100μl分別置于瓊脂糖凝膠塊中，放入光聲成像系統(tǒng)進行光聲成像，獲取其光聲信號值。

5.離體牛肝實驗及被動空化檢測：選擇肝實質均勻、肝內管道較少的一整葉新鮮離體牛肝，洗凈后將其置于脫氣水中負壓脫氣50 min，切成100 mm×100 mm×50 mm塊狀并置于底部有透聲膜的HIFU專用模具內，用注射器抽取PBS 和IR780-CLs 溶液各100μl垂直插入牛肝內（分別設為PBS 組和IR780-CLs 組），通過聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)對牛肝內針頭的位置進行準確定位，保證針頭位置與HIFU 輻照焦點重合，然后推出注射器內溶液，即刻用不同能量（120 W、3 s，150 W、3 s，180 W、3 s）進行輻照，同時采用空化檢測換能器檢測空化信號。使用帶通濾波器提取3～7 MHz 信號，并對該頻帶范圍內的諧波信號及高次諧波附近±30 kHz的信號進行濾除，得到瞬態(tài)空化發(fā)生特征信號的寬帶噪聲。取寬帶噪聲信號幅度的均方根值（RMS）隨時間變化曲線作為反映實時空化信號的指標。HIFU 輻照后，沿消融最大面切開，測量靶區(qū)凝固性壞死區(qū)體積并計算能效因子（EEF），EEF（J/mm3）=?PT/V，其中?=0.7，為HIFU 換能器系數，V 為HIFU 輻照后靶區(qū)產生的凝固性壞死區(qū)體積，P 為輻照功率，T 為輻照時間。EEF越低，代表HIFU消融效率越高。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、IR780-CLs的基本理化性質

成功制備的IR780-CLs外觀呈綠色乳液狀，透射電鏡顯示納米粒呈表面光滑的球形，粒徑約200～300 nm（圖1），平均粒徑為（246.5±12.4）nm，表面帶正電荷，平均電位為（34.5±3.2）mV。紫外分光光度計檢測不同濃度IR780吸收光譜，發(fā)現IR780在780 nm處出現特異性吸收峰。通過特異性吸收峰與濃度的關系，得到IR780濃度-吸光度標準曲線：Y=0.0191X+0.0439（R2=0.9909），其包封率為88%。

圖1 IR780-CLs透射電鏡圖

二、IR780-CLs的體外靶向性檢測結果

共聚焦顯微鏡顯示DiI 標記的納米粒呈紅色熒光，DAPI 標記的細胞核呈藍色熒光。隨著孵育時間的延長，靶向至細胞周圍的IR780-CLs 逐漸增多。見圖2。

圖2 IR780-CLs的體外靶向性檢測圖（標尺為100μm）

三、IR780-CLs的體外雙模態(tài)成像結果

1.體外超聲成像顯示，IR780-CLs輻照前后二維超聲回聲信號的灰度變化值分別為42.09±0.35 和48.25±0.93，超聲造影回聲信號的灰度變化值分別為45.10±0.74 和87.30±1.76，兩者輻照前后回聲信號的灰度變化值較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）；而PBS 無明顯變化。見圖3。

圖3 PBS和IR780-CLs輻照前后二維超聲和超聲造影圖

2.體外光聲成像顯示，濃度為20、40、60、80μg/ml的IR780-CLs 溶液對應的光聲信號值分別為0.476、0.864、1.378、1.996 a.u.。見圖4。

圖4 不同濃度IR780-CLs溶液的體外光聲成像圖

四、離體牛肝增效實驗結果

HIFU 輻照后，牛肝靶區(qū)凝固性壞死區(qū)呈邊界清晰、形態(tài)規(guī)則的灰白色（圖5）；隨輻照能量的增加，IR780-CLs 組和PBS 組牛肝凝固性壞死區(qū)體積均增加，EEF 均減小，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。見表1。

表1 兩組不同HIFU輻照能量下離體牛肝凝固性壞死區(qū)體積及EEF比較（）

表1 兩組不同HIFU輻照能量下離體牛肝凝固性壞死區(qū)體積及EEF比較（）

與PBS組同一輻照能量下比較，#P＜0.001。EEF：能效因子

組別EEF（J/mm3）2.86±0.05 1.54±0.04#EEF（J/mm3）1.73±0.02 0.49±0.01#EEF（J/mm3）6.47±0.09 3.11±0.06#150 W、3 s凝固性壞死區(qū)體積（mm3）88.03±1.58 164.36±3.75#PBS組IR780-CLs組120 W、3 s凝固性壞死區(qū)體積（mm3）38.98±0.53 81.17±1.53#180 W、3 s凝固性壞死區(qū)體積（mm3）145.95±1.99 512.05±3.19#

圖5 兩組不同HIFU輻照能量下離體牛肝凝固性壞死區(qū)大體圖

五、被動空化檢測結果

被動空化檢測結果顯示，隨著HIFU 輻照能量的增加，IR780-CLs 組和PBS 組RMS 均增加，在同一HIFU 輻照能量下，IR780-CLs 組的RMS 均高于PBS組。見圖6。

圖6 兩組不同HIFU輻照能量下離體牛肝靶區(qū)內RMS隨時間變化規(guī)律

討論

HIFU是一種微無創(chuàng)治療腫瘤的新技術，現已廣泛應用于各種實體腫瘤的臨床治療［4］，但如何提高HIFU對形態(tài)不規(guī)則、邊界不清晰、體積較大及血供豐富腫瘤的消融效率一直是臨床亟需解決的問題［5］。納米粒能改善腫瘤靶區(qū)的微環(huán)境，有研究［6-7］表明將其作為HIFU 增效劑能提高消融效率；孫廷宇等［8］使用脂質納米氟碳液滴（L-PFP）協同HIFU 消融兔肝的實驗研究發(fā)現，L-PFP通過增強空化效應能有效提高HIFU消融效率。但單一成像模式的納米粒在HIFU消融腫瘤的同時不能提供全面的診斷信息，而包裹光熱材料的納米粒能在實現有效顯像的同時對腫瘤進行治療，可以極大地增強腫瘤的診療效果。本實驗應用薄膜水化法成功制備同時包裹IR780與PFH的多功能納米粒IR780-CLs，旨在評估其體外超聲、光聲雙模態(tài)成像能力及其協同HIFU增效體外消融牛肝的效果，并初步探討其增效機制。

本實驗體外超聲成像結果顯示，IR780-CLs 輻照后二維超聲及超聲造影回聲信號的灰度變化值均較輻照前增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），分析原因主要為IR780-CLs 包裹PFH，PFH 作為一種相變材料，常溫下為液態(tài)，性質穩(wěn)定［9］，HIFU 輻照靶區(qū)產生的熱效應能激發(fā)PFH 發(fā)生液氣相變產生微泡，增強靶區(qū)空化效應，從而提高HIFU消融腫瘤的效率［10］。體外光聲成像實驗結果顯示，IR780-CLs 具有良好的光聲成像能力，光聲信號值隨納米粒溶液濃度增加呈線性增加。IR780是一種近紅外熒光染料，除了具有良好的近紅外熒光性能外，納米粒體外靶向檢測也表明IR780-CLs 能很好地與4T1 乳腺癌細胞結合。與既往研究［11-12］報道IR780具有腫瘤線粒體靶向能力，可特異性聚集于腫瘤區(qū)域的結論相符，為進一步開展體內精準診療提供了可行性依據。

離體牛肝實驗結果表明，隨輻照能量的增加，IR780-CLs 組和PBS 組靶區(qū)凝固性壞死區(qū)體積均增加，EEF 均減小，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。分析原因為IR780-CLs 中的PFH 在HIFU輻照時發(fā)生液氣相變產生微泡，明顯增加了靶區(qū)空化核的數量，有效增加HIFU 輻照時的空化效應。本實驗被動空化檢測結果顯示，在HIFU輻照過程中PBS組產生的RMS 較低，而IR780-CLs 組RMS 較高，說明空化效應在IR780-CLs 協同增效HIFU 過程中發(fā)揮了主要的作用，為體內抗腫瘤研究奠定了基礎。

綜上所述，本實驗成功制備IR780-CLs，體外實驗表明其具有良好的超聲、光聲雙模態(tài)成像能力，并能顯著提高HIFU 消融牛肝的效率，空化效應可能為其增效HIFU 的主要機制，但其在體內的效果及作用尚需今后進一步探討。