爽爽　代蕊　陳崎　劉慧潔　姜曉紅　特木爾布和　譚瑤　張志強(qiáng)

摘要：為了探究紫花苜蓿組成型抗薊馬轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以自主培育的抗薊馬苜蓿品種草原4號(hào)為研究對(duì)象，以感薊馬苜蓿品種草原2號(hào)為對(duì)照，采用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。試驗(yàn)共獲得82.34 Gb clean data，組裝得到77 837個(gè)unigenes，139 949個(gè)轉(zhuǎn)錄本，平均序列長(zhǎng)度為830.17 bp；共有47 573個(gè)unigenes被注釋到六大數(shù)據(jù)庫(kù)中。與草原2號(hào)相比，草原4號(hào)共檢測(cè)到差異基因2 388個(gè)，其中上調(diào)基因1 361個(gè)，下調(diào)基因1 027個(gè)。KEGG對(duì)相關(guān)差異基因的功能注釋表明，上調(diào)基因主要注釋到能量代謝、碳水化合物代謝等代謝過(guò)程以及遺傳信息處理相關(guān)途徑，下調(diào)基因主要注釋到遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)途徑。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)所選的8個(gè)基因在2個(gè)品種中的相對(duì)表達(dá)量同RNA-Seq測(cè)的結(jié)果一致，說(shuō)明本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果可靠。結(jié)果可為揭示苜蓿組成型抗薊馬機(jī)理奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為抗薊馬新品種培育及薊馬防治提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：苜蓿；抗薊馬；轉(zhuǎn)錄組；RNA-seq

中圖分類號(hào)：S476；S433.89文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）05-0044-07

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）被稱為“牧草之王”，是一種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)且固氮能力強(qiáng)的優(yōu)良牧草，是中國(guó)及世界栽培最廣泛的牧草。但在紫花苜蓿的栽培生產(chǎn)過(guò)程中，蟲害是影響紫花苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。我國(guó)已報(bào)道的苜蓿害蟲有8目48科297種，而薊馬（Thripidae）已成為苜蓿生產(chǎn)的主要害蟲之一［1-2］。薊馬是纓翅目昆蟲的統(tǒng)稱，是一種危險(xiǎn)性入侵害蟲，寄主范圍較廣，其特有的銼吸式口器既可以通過(guò)挫破植物表皮，消耗韌皮部組織的汁液造成直接的攝食損害，也可以通過(guò)傳播番茄斑萎病毒在內(nèi)的多種病毒造成間接的損害，從而導(dǎo)致作物、蔬菜及牧草的產(chǎn)量和質(zhì)量下降［3-4］。據(jù)報(bào)道，我國(guó)在苜蓿生產(chǎn)中，薊馬每年造成10%～30%的草產(chǎn)量損失［5］。目前，薊馬的防治管理主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但過(guò)量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致薊馬抗藥性、生態(tài)系統(tǒng)破壞和食品安全等問(wèn)題［6-7］。因此，從長(zhǎng)遠(yuǎn)和經(jīng)濟(jì)環(huán)保的角度出發(fā)，通過(guò)培育抗薊馬苜蓿新品種減少薊馬危害具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益［8-9］。從不同角度對(duì)植物抗薊馬機(jī)理的揭示是抗薊馬新品種培育及薊馬防治的理論支撐。

在與昆蟲的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物已經(jīng)進(jìn)化出包括組成型防御和誘導(dǎo)型防御在內(nèi)的復(fù)雜的防御機(jī)制來(lái)抵御草食性害蟲的侵害。組成型防御是植物所固有的，不需要昆蟲取食誘導(dǎo)就能產(chǎn)生的防御策略，一般包括物理防御和化學(xué)防御。通常，植物表面毛狀體、蠟質(zhì)角質(zhì)層、硅和細(xì)胞壁等物理結(jié)構(gòu)是阻止昆蟲取食的第一道防線［10-12］，而包括毒素或代謝物在內(nèi)的生化防御則是第二道防線［13-14］。近年來(lái)，從表型特征、生化防御、代謝調(diào)控、多組學(xué)及分子機(jī)制等不同層面有關(guān)不同植物抗薊馬機(jī)制的研究也成為熱點(diǎn)［4，8-9，15-16］。

在廣泛收集抗源的基礎(chǔ)上，筆者所在課題組采用輪回選擇法，成功選育出草原4號(hào)紫花苜蓿——抗薊馬苜蓿新品種［10］。以感薊馬苜蓿品種草原2號(hào)為對(duì)照，筆者所在課題組已經(jīng)從表型特征、生化防御、激素等角度開展苜蓿抗薊馬機(jī)理的探索［16-20］，但缺乏從分子層面對(duì)草原4號(hào)組成型抗薊馬機(jī)制的分析。因此，本研究以草原4號(hào)和草原2號(hào)苜蓿為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，探索草原4號(hào)組成型抗薊馬的相關(guān)分子調(diào)控途徑，為苜蓿組成型抗蟲機(jī)制的深入挖掘及通過(guò)生物技術(shù)手段進(jìn)行苜蓿新品種培育提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料及生長(zhǎng)條件

以草原4號(hào)苜蓿（Medicago sativa L.‘Caoyuan No.4）和草原2號(hào)苜蓿（Medicago varia Martin.‘Caoyuan No.2）為試驗(yàn)材料，2個(gè)品種皆為課題組培育的國(guó)家審定品種。依據(jù)蟲情指數(shù)低于0.5表示品種為抗蟲品種的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［21］，前期的抗薊馬評(píng)價(jià)證明，草原4號(hào)苜蓿的蟲情指數(shù)為0.334，為抗薊馬品種；草原2號(hào)苜蓿的蟲情指數(shù)為0.901，為感薊馬品種［19］。于2019年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院人工氣候室內(nèi)種植草原2號(hào)和草原4號(hào)苜蓿各30盆，每盆3株，其生長(zhǎng)條件為晝夜平均溫度為（30±5） ℃和（20±5） ℃，相對(duì)濕度為（65±5）%和（70±5）%，保證所有材料生長(zhǎng)環(huán)境一致，培育3周后，取頂部3～4張葉子于液氮中速凍，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?，每個(gè)品種3個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 測(cè)序

將低溫保存的葉片材料送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序分析，所用測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 4000（版本2×150 bp）。測(cè)序原始序列數(shù)據(jù)保存在NCBI存檔（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra，登錄號(hào) PRJNA622603）。

1.2.2 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

使用Trinity （https：//github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq）在線工具對(duì)所有樣本的clean data進(jìn)行De novo組裝，獲得unigenes，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化評(píng)估；將所有基因和轉(zhuǎn)錄本分別與 NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO 和 KEGG 等六大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)從而獲取注釋信息，并統(tǒng)計(jì)各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋情況；通過(guò)與NR（NCBI非冗余蛋白庫(kù)）綜合數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，查看本物種轉(zhuǎn)錄本序列與相近物種的相似情況；通過(guò)主成分分析（PCA）深入挖掘樣品之間的關(guān)系和變異大小。使用DESeq2軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因的篩選，篩選參數(shù)為adjust P-value<0.05 & |log2FC| ≥1；并對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG功能注釋與富集分析［16，22］。

1.2.3 qRT-PCR 驗(yàn)證

從不同處理的葉子中提取總RNA，使用帶有g(shù)DNA Eraser的 PrimeScript RT試劑進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。使用ABI7500FAST 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR相關(guān)基因的表達(dá)量分析。反應(yīng)使用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)進(jìn)行，并使用2-ΔΔCT 法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算［23］。qRT-PCR結(jié)果同RNA-seq測(cè)定的相應(yīng)基因的TPM值進(jìn)行比較分析，驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。試驗(yàn)中使用的基因和引物序列如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、組裝和注釋概述

通過(guò)使用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)，對(duì)抗薊馬苜蓿品種草原4號(hào)（R_CK）和感薊馬苜蓿品種草原2號(hào)（S_CK）的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。每個(gè)處理3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，共完成6個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組分析，獲得82.34 Gb clean data。使用Trinity對(duì)所有樣本clean data進(jìn)行De novo組裝，組裝得到的unigene個(gè)數(shù)為77 837條，轉(zhuǎn)錄本個(gè)數(shù)為139 949條，平均序列長(zhǎng)度為830.17 bp，N50平均長(zhǎng)度為1 386 bp，E90N50 平均長(zhǎng)度為2 187 bp（表2）。

通過(guò)所有unigenes和轉(zhuǎn)錄本分別與NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO 和 KEGG 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在75 756個(gè)組裝的unigenes中，發(fā)現(xiàn)共有46 789個(gè)unigenes被注釋到六大數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別為NR （46 152）、Swiss-Prot（28 837）、Pfam （28 506）、eeNOG（33 999）、GO（39 565） 和 KEGG（17 270），且其中11 511個(gè)unigenes在6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同注釋（圖1-a）。通過(guò)與NR庫(kù)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn) 38 392 個(gè)（81.82%）注釋的unigenes與蒺藜苜蓿的序列匹配（圖1-b）。

2.2 差異基因分析

樣品的主成分分析（PCA）表明，S_CK和R_CK之間存在明顯差異，且2個(gè)品種的3個(gè)樣品分別聚在一起，說(shuō)明樣本間差異主要來(lái)源于品種差異，且測(cè)試樣品重復(fù)性較好，可以依據(jù)品種進(jìn)行差異基因分析（圖2-a）。如圖2-b所示，與草原2號(hào)相比，草原4號(hào)共檢測(cè)到差異基因2 388個(gè)，其中上調(diào)基因1 361個(gè)，下調(diào)基因1 027個(gè)。

KEGG注釋分析發(fā)現(xiàn)，與草原2號(hào)相比，草原4號(hào)中有174個(gè)上調(diào)基因和212個(gè)下調(diào)基因分別注釋到代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)等五大類KEGG代謝通路的18個(gè)不同的代謝途徑中（圖3-a、圖3-b）。其中，上調(diào)基因主要注釋到能量代謝、碳水化合物代謝等代謝過(guò)程以及折疊、分類和降解、復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯等遺傳信息處理相關(guān)途徑（圖3-a）；下調(diào)基因主要注釋到折疊、分類和降解、復(fù)制和修復(fù)等遺傳信息處理相關(guān)途徑以及屬于細(xì)胞過(guò)程的轉(zhuǎn)運(yùn)和催化途徑和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)途徑（圖3-b）。

Go富集分析表明，草原4號(hào)和草原2號(hào)差異基因主要富集在端粒組織、端粒維持、解剖結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)等生物過(guò)程中， 說(shuō)明2個(gè)品種本身的遺傳特點(diǎn)可能同抗薊馬性直接相關(guān)（圖4）。

2.3 差異基因的qRT-PCR基因驗(yàn)證

為了確認(rèn)通過(guò)RNA-Seq鑒定的不同基因表達(dá)的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取了8個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。如圖5所示，qRT-PCR結(jié)果表明草原4號(hào)中TRINITY_DN10608_c0_g2、TRINITY_DN12291_c0_g1和TRINITY_DN17228_c0_g1等3個(gè)基因的表達(dá)量都極顯著高于草原2號(hào)，而TRINITY_DN11714_c0_g1、TRINITY_DN11779_c0_g2、TRINITY_DN10336_c0_g1、TRINITY_DN10194_c1_g1和TRINITY_DN1145_c1_g1等5個(gè)基因的表達(dá)量都顯著低于草原2號(hào)，8個(gè)基因的qRT-PCR表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序TPM值（RNA-Seq）的表達(dá)趨勢(shì)一致，說(shuō)明RNA-Seq測(cè)得的基因相對(duì)表達(dá)量結(jié)果可靠。

3 討論

隨著國(guó)家“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”計(jì)劃的實(shí)施及我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，我國(guó)苜蓿種植面積逐年增加，僅內(nèi)蒙古目前苜蓿人工草地保有面積超過(guò)1 000萬(wàn)畝（1 hm2=15畝）。然而，蟲害已經(jīng)成為影響苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。無(wú)論是草產(chǎn)業(yè)發(fā)展還是生態(tài)建設(shè)均需要大量抗病蟲的優(yōu)良苜蓿品種。植物抗病蟲新品種選育及病蟲害防治受多方面因素影響，通過(guò)深入了解植物的抗蟲機(jī)制，特別是多角度闡釋苜?？顾E馬的機(jī)理，對(duì)苜?？瓜x品種選育及薊馬防治具有重要的理論意義［24］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于植物抗薊馬的分子機(jī)制也多有報(bào)道。研究者通過(guò)QTL圖譜在胡椒的第6染色體上定位到了抗薊馬位點(diǎn)并開展了抗薊馬基因功能的研究［25-26］，相似的研究在辣椒［27］和番茄［28］中都有開展。此外，Tu等利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，以甘農(nóng) 1 號(hào)和 WL323 苜蓿品種為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)苜蓿誘導(dǎo)性抗薊馬與類黃酮生物合成、β-丙氨酸代謝及水楊酸代謝途徑的基因密切相關(guān)［4］。

生物體的表型由 DNA、RNA、蛋白質(zhì)及代謝物等多個(gè)層面調(diào)控決定，mRNA研究可以獲得樣本之間的差異基因、復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的必然紐帶，是解析生物分子調(diào)控機(jī)理的重要手段［29］。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以自主培育的抗薊馬苜蓿品種草原4號(hào)為研究對(duì)象，采用轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平探索苜蓿組成型抗薊馬的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的整體評(píng)估，表明測(cè)序結(jié)果質(zhì)量較好。PCA結(jié)果表明草原4號(hào)和草原2號(hào)品種間差異較大，且各處理間重復(fù)性較好，為差異基因的篩選鑒定提供保證。該結(jié)果與Tu等報(bào)道的結(jié)果［14］一致，說(shuō)明抗薊馬品種和感薊馬品種在基因型上存在明顯的差異。對(duì)差異基因的功能注釋發(fā)現(xiàn)，抗薊馬品種草原4號(hào)上調(diào)基因主要注釋到遺傳信息處理相關(guān)途徑、細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)途徑， 表明草原4號(hào)抗薊馬特性和其本身的遺傳信息直接相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，植物初級(jí)代謝如碳水化合物、氮代謝相關(guān)產(chǎn)物在植物對(duì)昆蟲的組成和誘導(dǎo)型防御中都具有重要作用［30］。本研究發(fā)現(xiàn)與感蟲品種草原2號(hào)相比，草原4號(hào)下調(diào)基因主要注釋到能量代謝、碳水化合物代謝等初生代謝過(guò)程以及遺傳信息處理相關(guān)途徑。因此，筆者所在課題組推測(cè)，在苜蓿組成型抗薊馬防御反應(yīng)中，初生代謝途徑可能扮演著更重要的角色。與此不同的是大量的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在植物的組成或誘導(dǎo)型抗薊馬過(guò)程中，生物堿、黃酮類、萜類等次生代謝產(chǎn)物更為重要［4，6，16，31］。本研究結(jié)果為深入闡述苜蓿組成型抗薊馬機(jī)理、薊馬防治及利用生物技術(shù)手段進(jìn)行抗薊馬植物品種選育提供理論支撐。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，草原4號(hào)紫花苜蓿組成型抗蟲與其本身遺傳信息處理相關(guān)途徑、細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)途徑密切相關(guān)，同時(shí)能量代謝、碳水化合物代謝等初生代謝途徑在苜蓿組成型抗薊馬防御反應(yīng)中具有重要作用。研究結(jié)果為揭示苜蓿組成型抗薊馬機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為抗薊馬新品種培育及薊馬防治提供理論支撐。

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收稿日期：2022-04-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32160333、32060388）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（編號(hào)：2021MS03011）。

作者簡(jiǎn)介：爽 爽（1999—），女，內(nèi)蒙古通遼人，碩士研究生，主要從事草學(xué)方面的研究。E-mail：bss@emails.imau.edu.cn。

通信作者：張志強(qiáng)，博士，副教授，主要從事牧草抗逆及品種選育方面的研究。E-mail：zhangzq19890102@126.com。