周豪楠　馬喜玲　涂志偉　李林桐　胡遠鋒　肖旭峰　羅莎　范淑英

摘要：挖掘與粉葛葛根素生物合成的相關(guān)基因，為相關(guān)控制基因的驗證及深入研究提供理論參考。對6個生長時期的粉葛塊根進行轉(zhuǎn)錄組測序，在葛根素含量最高時期與最低時期初步篩選差異表達基因，對各時期葛根素及其上下游代謝物含量變化趨勢與差異表達基因相對表達量進行相關(guān)性分析，最終挖掘出相關(guān)性較高的基因片段。結(jié)果表明，經(jīng)2步篩選差異基因后，挖掘11個與粉葛葛根素生物合成相關(guān)的片段，共編碼3個基因，分別為異黃酮羥化酶控制基因（I2′H）、異黃酮7-O-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶控制基因（IF7GT）和異黃酮合酶控制基因（IFS1），其中I2′H、IF7GT、IFS1均與葛根素的生物合成呈現(xiàn)正向相關(guān)，即均正向調(diào)控葛根素的生物合成。說明I2′H與IF7GT所編碼的酶主要負責調(diào)控大豆苷元向芒柄花素和大豆苷的合成，兩者同為葛根素上游代謝物的支鏈代謝物，因此與葛根素的含量呈正向相關(guān)，而IFS1則通過調(diào)控2，7，4′-3-羥基異黃酮的生物合成與異甘草素向葛根素的直接合成，最終調(diào)控葛根素生物合成進程。

關(guān)鍵詞：粉葛；葛根素；轉(zhuǎn)錄組；異黃酮羥化酶控制基因；異黃酮7-O-葡糖苷轉(zhuǎn)移酶控制基因；異黃酮合酶控制基因

中圖分類號：S188文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0030-08

粉葛（Pueraria montana var. thomsonii）屬豆科葛屬，它在我國的栽培史可追朔至南梁（公元502年）以前，自此之后對粉葛的炮制方法也日新月異，期間出現(xiàn)過搗為末法、蒸焙法、炒法、煨法等［1］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中釋義主消渴，起陰氣，解諸毒；《本草綱目》中，釋名：葛、雞齊、鹿藿、黃斤，根部供食，鮮食可緩內(nèi)熱脈洪，可解酒，可升陽止瀉。2001年，葛屬野生與栽培作物在我國栽培面積已達40萬hm2，年終產(chǎn)可達150萬t［2］。同年，鄭水慶等對粉葛主栽的云南地區(qū)進行了植物資源調(diào)查，并將云南地區(qū)現(xiàn)有葛屬作物細分為9類，根據(jù)其主要的藥用價值黃酮類物質(zhì)進行排名，以野葛藥用價值最高，粉葛次之［3］?？v觀世界，葛屬作物栽培主要分布于亞洲東南部［4］，因此相關(guān)的葛類研究樣本主要來自中國、泰國、日本等地。時至如今，相關(guān)研究顯示，粉葛的淀粉含量（鮮樣）可高達20%，且其中含有少量維生素與礦質(zhì)元素，干物質(zhì)中黃酮類次生代謝物及異黃酮類次生代謝物總量可達 500 mg/kg［5-6］。因而在新時代背景下粉葛具有了更深刻的藥食兼用的含義，而其綜合利用價值也相應被提升至新的維度。例如，利用粉葛株內(nèi)豐富的異黃酮提取物生產(chǎn)靶向藥物緩解心腦血管疾?。?］和利用粉葛淀粉含量高且含有微量礦質(zhì)元素的性質(zhì)生產(chǎn)保健食品等［8］。

粉葛的研究興起較早，一方面是對粉葛體內(nèi)異黃酮類代謝物代謝合成機制的研究，有學者對粉葛黃酮類代謝物起始合成的控制片段基因作了全片段克隆并在大腸桿菌中過表達，通過比對最終鑒定出粉葛基因組內(nèi)存在的查爾酮異構(gòu)酶（CHI）合成基因［9］；伴隨這一浪潮的興起，He 等展開了針對粉葛異黃酮代謝通路的基因組研究，通過建立表達序列標簽（EST）文庫及相關(guān)片段的過表達（表達序列標簽），成功從粉葛內(nèi)鑒定出查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、查爾酮還原酶（CHR）、2′-羥基異黃酮脫水酶（2′HID）的控制片段基因［10］；羽健賓等成功從粉葛內(nèi)克隆出了查爾酮合酶（PtCHS）基因的全片段，片段全長1 179 bp，編碼了389個氨基酸［11］；Li等的研究表明，在粉葛塊根內(nèi)異黃酮的積累伴隨著PIUGT1基因的高度表達，因此，他們認為該7-O葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的編碼基因?qū)Ξ慄S酮在粉葛體內(nèi)的生物合成起關(guān)鍵控制作用［12］。另一方面，關(guān)于粉葛藥用價值的研究從未間斷過，其中被關(guān)注最多的是粉葛塊根內(nèi)的葛根素，由于其具有廣泛的藥理特性［13］，在血管擴張［14］、心臟保護［15］、抗氧化［16］、抑制乙醇吸收［17］等領域皆有應用?，F(xiàn)如今的研究進展［18-19］中認可度較高的粉葛生物合成通路有2個（圖1），一是大豆苷元在一個糖苷轉(zhuǎn)移酶（GT）的催化下最終在大豆苷元8號C原子位增加一個糖苷，該通路的葛根素生物合成主要受到大豆苷元含量的控制；另一個是大豆苷元的上游產(chǎn)物2，7，4′-3-羥基異黃酮在GT的催化下形成三羥基異黃酮8-碳葡萄糖苷，隨后在脫水酶（HID）的作用下形成葛根素。

目前，研究報道均集中在異黃酮類代謝物在粉葛塊根內(nèi)的生物合成機制，但關(guān)于粉葛葛根素生物合成的機制方面卻鮮有報道。為進一步研究葛根素生物合成的機制，試驗通過對6個生長時期的粉葛塊根進行轉(zhuǎn)錄組測序，與各時期目標代謝物含量進行聯(lián)合分析，從而挖掘出與葛根素生物合成最為相關(guān)的基因，以期為后期遺傳轉(zhuǎn)化試驗的驗證和最終探索葛根素生物合成的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣本 江西主栽粉葛品種贛葛一號。

1.1.2 試驗器材 高效液相色譜儀LC-20AT（日本SHIMADZU公司）、反相色譜柱C18 4.6 mm×250 mm（日本SHIMADZU公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本獲取 樣本于2021年栽培于江西省宜春市奉新縣棚下試驗基地，基肥為1 800 kg/hm2有機肥料，定植后于每月的第1天施600 kg/hm2液體肥（氮、磷、鉀含量均為20%），于2021年6—11月每月的30日收取供試樣本，并于2021年12月開展試驗（編號及取樣說明見表1）。

1.2.2 葛根素、大豆苷元、大豆苷含量測定 測定方法參考Cherdshewasart 等的方法［20］。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 無參考基因轉(zhuǎn)錄組測序由北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.2.4 RT-qPCR驗證 使用華越洋RNA提取試劑盒提取總RNA，使用TaKaRa RT-PCR kit試劑盒對目標片段進行相對表達量測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析與制圖

使用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用GGplot2、Origin 2022 pro軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉葛塊根內(nèi)葛根素、大豆苷元、大豆苷的含量

由圖2可知，粉葛塊根內(nèi)葛根素含量總體呈現(xiàn)先增后降的趨勢，GP7R時期粉葛塊根內(nèi)葛根素含量最高，達到了12.35 mg/100 g（鮮質(zhì)量）；GP8R與GP9R時期葛根素含量整體無明顯變化，但均顯著低于GP6R與GP7R時期，在GP10R與GP11R時期時，粉葛塊根內(nèi)葛根素含量持續(xù)下降。大豆苷和大豆苷元作為葛根素生物合成途徑上游2，7，4′-3-羥基異黃酮的分支產(chǎn)物，其含量變化也總體呈現(xiàn)先增后降的規(guī)律，不同的是大豆苷含量在GP8R時期達到峰值，而大豆苷元含量則與葛根素含量變化趨勢大體一致。

2.2 粉葛轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析

以Illumina測序平臺對6個生長時期粉葛塊根樣本進行全長轉(zhuǎn)錄組測序，獲得全長非嵌合序列177 535條。對全長非嵌合的Unigene進行聚類得到高質(zhì)量一致Unigenes共75 943個，對高質(zhì)量一致Unigenes合并進行去冗余分析得到42 211個Unigenes，對去冗余后的Unigenes進行功能注釋后共有40 650個Unigenes得到注釋（表2）。各樣本GC含量均高于44%，Q30均高于91%（表3）。

2.3 差異表達基因GO和KEGG通路注釋分析

根據(jù)試驗測得的各月份間粉葛塊根內(nèi)葛根素含量變化數(shù)據(jù)，選取葛根素含量變化最大的2個生長時期：7月和11月，根據(jù)轉(zhuǎn)錄本中被注釋的Unigenes表達量的FPKM（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段）值，以log2差異倍數(shù)（FC）≥1和錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.1為標準，篩選出961個差異Unigenes，其中上調(diào)表達的共549個，下調(diào)表達的共412個。根據(jù)GO注釋，這961個差異Unigenes主要被注釋至生物過程中的細胞過程、代謝過程和單生物過程中。根據(jù)KEGG的注釋，這961個差異Unigenes也主要被注釋在代謝過程的氨基酸生物合成、淀粉與糖代謝途徑和碳代謝中（圖3和圖4）。

2.4 差異表達基因GO和KEGG富集分析

初步篩選出的961個差異表達基因在GO數(shù)據(jù)庫中主要被富集在生物過程的磷信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)和蔗糖代謝中（圖5）；在KEGG的富集分析中選擇了Q值（矯正后的P值）低于1的注釋片段進行富集，并按Q值由低到高進行排序，結(jié)果顯示，可信度較高的富集通路（圖6）分別為異黃酮類物質(zhì)生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、半胱氨酸-蛋氨酸代謝。

2.5 差異表達基因相對表達量分析與篩選

從上述初步篩選的差異表達基因中篩選出異黃酮代謝通路差異表達基因共13個，而后根據(jù)上述粉葛塊根內(nèi)葛根素、大豆苷、大豆苷元含量隨月份變化的趨勢規(guī)律，結(jié)合轉(zhuǎn)錄本所測得的異黃酮代謝通路的13個差異Unigenes的相對表達量FPKM值（歸一化處理后），篩選出各月份FPKM值變化規(guī)律與代謝物產(chǎn)物含量數(shù)據(jù)呈正向相關(guān)的Unigenes共11個，無與代謝物含量變化呈負向相關(guān)的Unigene（相對表達量變化趨勢見圖7）。

2.6 代謝物與差異表達基因表達量相關(guān)性分析

圖8反映出所篩選出的11個差異基因與3種代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，11個基因片段均與葛根素的生物合成呈現(xiàn)正相關(guān)，各個片段與粉葛葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量變化具有顯著相關(guān)性。

2.7 篩選后的差異表達基因注釋

根據(jù)KEGG的注釋（表4），11個Unigenes有6個編碼了異黃酮2′-羥化酶控制基因（K13260）、 2個編碼了異黃酮7-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶控制基因（K13263）、3個編碼了2-羥基異黃酮合酶控制基因（K13257），結(jié)合注釋可知，在粉葛的生長過程中I2′H、IF7GT與IFS1均與葛根素的生物合成存在正向相關(guān)性。

2.8 RT-q PCR驗證

選取轉(zhuǎn)錄本篩選后具有代表性的4個差異表達基因片段（表5）進行相對表達量驗證，相對表達量的表達趨勢與轉(zhuǎn)錄本的FPKM值趨勢一致（圖9），說明轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)可靠。

3 討論與結(jié)論

以KEGG所標注的代謝通路為參考，在試驗所測得的3種代謝物的含量變化中可知，3種代謝物的含量總體均呈先增加后降低的趨勢，結(jié)合該變化趨勢可從961個初篩的差異基因片段中篩選出11個與葛根素生物合成呈正向相關(guān)的差異基因片段，經(jīng)過注釋后共編碼3個基因，分別為I2′H、IFS1、IF7GT。IF7GT的主要作用為在大豆苷的7號氧原子位添加一個糖苷［21］，負責控制大豆苷元向大豆苷的合成，試驗數(shù)據(jù)表明，IF7GT與3種代謝物均呈現(xiàn)正向調(diào)控的趨勢，由此推斷當該控制基因表達量增加時，控制8號碳原子位糖苷轉(zhuǎn)移的控制基因的表達量也會相應增加或降低， 最終呈現(xiàn)正向或負向調(diào)控葛根素的生物合成，而目前關(guān)于8號碳原子位的糖苷轉(zhuǎn)移酶的控制基因有研究表明是PIUGT43基因［22］；前人的研究表明，I2′H可正向調(diào)控丙二酰糖苷的積累與苯丙素類物質(zhì)的合成［23］，且在異黃酮代謝通路中，I2′H主要作用在大豆苷元向2-羥基芒柄花素的生物合成中［24］，屬于大豆苷元向下游代謝物合成的關(guān)鍵控制酶的編碼基因，結(jié)合I2′H在粉葛各個生長期內(nèi)的表達量變化規(guī)律和大豆苷元與大豆苷的含量變化規(guī)律可從側(cè)面證明伴隨大豆苷元含量上下起伏，其下游代謝物的合成關(guān)鍵控制酶的活性也相應發(fā)生變化，由此可推測控制葛根素合成的糖苷轉(zhuǎn)移基因的表達量也會相應增加或降低，因而I2′H的表達量可從側(cè)面反映葛根素含量的變化，且兩者呈正相關(guān)；同理，作為大豆苷元向下代謝的支鏈產(chǎn)物大豆苷，其關(guān)鍵控制酶的編碼基因IF7GT也呈現(xiàn)出了相同的正向調(diào)控規(guī)律，因此IF7GT也可從側(cè)面反映出葛根素含量的變化，且兩者呈現(xiàn)正相關(guān)性；IFS1則可通過葛根素合成的2種通路正向調(diào)控葛根素的生物合成，分別為控制其上游代謝物甘草素向2，7，4′-3-羥基異黃酮的轉(zhuǎn)化［25］和控制異甘草素代謝合成為葛根素，以最終正向調(diào)控葛根素的合成。

試驗結(jié)果（圖10）表明，在粉葛中6個基因片段編碼了I2′H，并正向調(diào)控了大豆苷元向支鏈代謝物芒柄花素的生物合成而與葛根素的生物合成存在正向相關(guān)；2個基因片段編碼了IF7GT，并正向調(diào)控了大豆苷元向大豆苷的生物合成進程而與同為支鏈產(chǎn)物的葛根素的生物合成存在正向相關(guān)；3個基因片段編碼了IFS1，正向調(diào)控了2，7，4′-3-羥基異黃酮的生物合成與異甘草素向葛根素的直接合成而最終表現(xiàn)為調(diào)控葛根素的生物合成。

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收稿日期：2022-06-16

基金項目：江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-葛栽培崗資助項目（編號：050014-9021107274）。

作者簡介：周豪楠（1997—），男，江蘇南通人，碩士研究生，主要從事粉葛栽培及代謝機理研究。E-mail：zhnsrm@126.com。

通信作者：范淑英，教授，主要從事蔬菜栽培生態(tài)與環(huán)境調(diào)控研究。E-mail：fansy12@126.com。