李維杰　申敬　宋立勇　周新麗　王建信　劉寶林

摘要：采用海藻糖代替具有生物毒性的二甲基亞砜，利用自行搭建的超聲植冰裝置研究了超聲植冰以及不同濃度海藻糖對 L-02 肝細(xì)胞冷凍保存的影響。結(jié)果表明，添加 0.3 mol/L 海藻糖結(jié)合超聲植冰的細(xì)胞凍存組的肝細(xì)胞存活率較高 （（87.6±2.0）%），與傳統(tǒng)植冰組 （（84.3±1.0）%） 無顯著性差異，與非植冰組 （（76.9±3.1）%） 存在顯著性差異。

關(guān)鍵詞：超聲植冰；海藻糖；肝細(xì)胞；冷凍保存

中圖分類號：R 318.52??????????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cryopreserving L-02 hepatocytes with trehalose byultrasonic ice seeding

LI Weijie1， SHEN Jing1， SONG Liyong1， ZHOU Xinli1， WANG Jianxin2， LIU Baolin1，3

（1. School of Health Science and Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China;2. Origincell Technology Group， Shanghai 201203， China; 3. Co-innovation Center for Energy Therapy of Tumors，Shanghai 200093， China）

Abstract： Effects? of? ultrasonic? ice? seeding? and? different? concentrations? of? trehalose? on? thecryopreservation? of? L-02? hepatocytes? were? studied? by? replacing? bio? toxic? dimethyl? sulfoxide? withtrehalose? in? a? self-built? ultrasonic? ice? seeding? device.? The? results? show? that? the? survival? rate? ofhepatocytes （87.6±2.0）% is higher when cryopreserving L-02 hepatocytes with 0.3 mol/L trehalose byultrasonic? ice? seeding? ，? which? is? not? significantly? different? from? the? traditional? ice? seeding? group（84.3±1.0）%， and a significantly different from the non-ice seeding group （76.9±3.1）%.

Keywords： ultrasonic ice seeding; trehalose; hepatocyte; cryopreservation

隨著人工肝臟及肝細(xì)胞移植研究的開展，肝細(xì)胞保存的臨床需求不斷增加。傳統(tǒng)的肝細(xì)胞低溫保存多使用滲透性保護(hù)劑二甲基亞砜（Me2SO），通過程序降溫或者玻璃化的方法保存肝細(xì)胞。雖然 Me2SO 作為低溫保護(hù)劑可以得到較高的細(xì)胞存活率，但是，該物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用中的副作用也很明顯。有報(bào)道顯示，使用 Me2SO 可能會(huì)出現(xiàn)一些副作用，如惡心、嘔吐、腹瀉、溶血、皮疹、腎衰竭、高血壓、心動(dòng)過緩、肺水腫等[1-5]，以及可能會(huì)對胚胎及卵母細(xì)胞的發(fā)育造成影響[6]。因此，將冷凍保存的肝細(xì)胞用于患者體內(nèi)之前，必須清除保護(hù)劑。有臨床結(jié)果表明，沒有完全清除 Me2SO 的肝細(xì)胞植入患者體內(nèi)時(shí)會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥，如血管內(nèi)溶血、血清轉(zhuǎn)氨酶升高等[7]。因此，迫切需要一種降低 Me2SO 的方法來避免臨床使用凍存肝細(xì)胞時(shí)可能出現(xiàn)的并發(fā)癥。海藻糖是具有抗氧化功能和非滲透性冷凍保護(hù)功能的非還原性二糖，具有很好的生物相容性，可以降低 Me2SO 的使用。海藻糖的非熱力學(xué)平衡相變研究顯示，海藻糖能夠消除生理鹽水中共晶的形成，抑制冰晶生成[8]。2019年，有學(xué)者在紅細(xì)胞冷凍保存時(shí)加入少量的海藻糖使得細(xì)胞冷凍存活率從69%升高至90%[9]。但是，一般需經(jīng)過復(fù)雜的孵育過程將海藻糖輸送到細(xì)胞內(nèi)[10-12]，或者和其他保護(hù)劑如 Me2SO、甘油[13]等復(fù)配以提高細(xì)胞存活率。

植冰法是一種有效提升細(xì)胞冷凍存活率的方法，這是由于在實(shí)際降溫過程中，細(xì)胞溶液中會(huì)出現(xiàn)過冷現(xiàn)象，較大的過冷度會(huì)使細(xì)胞溶液因釋放潛熱而溫度上升，潛熱釋放完全后，可能會(huì)出現(xiàn)很高的降溫速率，引起細(xì)胞不可控的結(jié)晶，造成細(xì)胞大量死亡[14]。過冷度越小，低溫保存過程中產(chǎn)生的晶核數(shù)量越少，冰晶的生長速率越慢，形成的冰晶棱角較小，對細(xì)胞產(chǎn)生的傷害越小[15]。通過植冰的方法，人為地加入冰核，可以降低過冷度，避免胞內(nèi)冰的損傷，且在細(xì)胞復(fù)溫的過程中可以避免細(xì)胞重結(jié)晶，提高細(xì)胞存活率。目前主要有6種[16]植冰技術(shù)誘導(dǎo)成核，能夠誘導(dǎo)溶液在較高的零下溫度下成核，降低溶液的過冷度，改變冰晶的形態(tài)，避免胞內(nèi)冰的損傷。一般使用冰成核誘導(dǎo)劑[17-18]或者預(yù)冷的鑷子探針等進(jìn)行人工置核，由于接觸式置核可能會(huì)對細(xì)胞造成污染，非接觸式置核在逐漸興起，如超聲波誘導(dǎo)冰晶成核。王葳等[19]發(fā)現(xiàn)超聲波能夠?qū)λ倪^冷結(jié)冰過程產(chǎn)生影響，在800 kHz 的超聲波下超聲波能夠大幅降低水的過冷度。李維杰等[20]用自行組裝的超聲植冰裝置研究了不同的超聲強(qiáng)度、不同的預(yù)凍溫度及不同濃度的 Me2SO 對肝細(xì)胞存活率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，超聲波植冰能夠顯著提高肝細(xì)胞的存活率（高達(dá)97%左右），與新鮮組無顯著性差異。目前利用超聲波誘導(dǎo)冰晶形成的研究尚不完善，主要用于食品、藥品、疫苗的冷凍濃縮和冷凍干燥等[21-23]，用于細(xì)胞凍存的研究相對較少。2005年， Chow 等[24]較早提出在超聲波存在時(shí)，即使蔗糖溶液的濃度不同，都始終在較高的溫度下成核，認(rèn)為冰成核與超聲波的功率與空化氣泡有關(guān)。超聲誘導(dǎo)晶體的形成可以分為2個(gè)過程：當(dāng)溶液初始無晶體存在時(shí)，超聲誘導(dǎo)溶液發(fā)生一次成核，在沒有固體表面和雜質(zhì)的情況下，發(fā)生均相成核[25]；有晶體存在引起的成核為二次成核，無論是初始存在的還是一次成核形成的晶體，在晶體固體界面的成核都稱為非均相成核。

本實(shí)驗(yàn)以 L-02肝細(xì)胞為研究對象，使用非滲透性的海藻糖作為冷凍保護(hù)劑，結(jié)合自行研發(fā)的超聲波植冰裝置研究去除滲透性保護(hù)劑 Me2SO 的低溫保存方案。

1材料和方法

1.1材料和試劑

實(shí)驗(yàn)所用的主要材料和試劑： L-02正常人類肝細(xì)胞系（中科院上海細(xì)胞生物研究所），98%胎牛血清（型號900108，GEMINI 公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（型號11875093， GIBCO 公司），0.25%胰蛋白酶（型號 TE2004Y，天津?yàn)蠊荆?，無水海藻糖（型號 D110019，阿拉丁公司），磷酸緩沖鹽溶液（PBS 緩沖液）（型號 PB2004Y ，天津?yàn)蠊荆叶迹ㄐ吞?E103319，麥克林公司），AO/PI 雙染試劑盒（型號 BB20071，BestBio公司）， TC 處理的 T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（型號707003，NEST 耐思公司），50 mL 離心管，15 mL 離心管，2 mL 凍存管（NEST 耐思公司）。

1.2儀器和設(shè)備

作者自行搭建的超聲波植冰裝置如圖1所示。超聲波植冰裝置主要由可放置多個(gè)凍存管的超聲容器、帶有2個(gè)熱電偶電極及數(shù)據(jù)采集模塊的溫度采集系統(tǒng)、帶有超聲波振子和超聲波發(fā)生器的超聲波誘導(dǎo)成核系統(tǒng)、加載有體積分?jǐn)?shù)為38.5%的乙二醇作為控溫相變液的冷卻循環(huán)系統(tǒng)這4個(gè)部分組成。超聲波顯微系統(tǒng)主要由帶有超聲波振子和超聲波發(fā)生器的超聲波系統(tǒng)、帶有生物顯微鏡和高速攝像的光學(xué)記錄系統(tǒng)[26-27]、由燒杯和特制載玻片組成的特制載物臺、溫度檢測系統(tǒng)、冷卻循環(huán)系統(tǒng)所組成。

其余所使用的儀器和設(shè)備為：普通光學(xué)顯微鏡（型號 YS100，日本尼康公司），熒光顯微鏡（型號 TS100，日本尼康公司），低速臺式離心機(jī)（型號 TDL-80-2B，上海安亭公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號 BC-J80S ），超低溫冰箱（型號 DW-86L828，青島海爾特種電器有限公司），程序降溫盒（型號5100?0001，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），低溫恒溫槽（型號 DC-0506，寧波天恒公司），智能多路溫度測試儀（型號 BB20071，常州安柏精密儀器有限公司）。

1.3超聲植冰裝置參數(shù)測定

為了確定超聲植冰實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)際消散在細(xì)胞溶液中的超聲波功率 Ps ，用量熱法進(jìn)行測定，選取功率為30，60，75，90，105，120，135，150 W 的超聲波測定實(shí)際消散在不同濃度 Me2SO 細(xì)胞溶液的超聲波功率 Ps。量熱法是假設(shè)釋放出的超聲波能量均能被液態(tài)傳聲媒介吸收轉(zhuǎn)化成熱能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同體積分?jǐn)?shù)（0%，3%，5%，10%）的 Me2SO 的比熱容無顯著性差異，為了便于計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)選取4種濃度 Me2SO 的比熱容的平均值作為細(xì)胞溶液的比熱容。細(xì)胞溶液比熱容為3.997 J/（g·℃）。

1.4肝細(xì)胞培養(yǎng)

在補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng) L-02肝細(xì)胞，添加體積分?jǐn)?shù)為1%的雙抗（青霉素和鏈霉素），將它們放在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的生長情況，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁約80%～90%時(shí)，輕輕吸取去除培養(yǎng)瓶中的上清液，用 PBS 緩沖液洗滌長滿肝細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，然后用胰蛋白酶消化，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中洗出，用移液槍對培養(yǎng)瓶底部反復(fù)吹打，確保全部細(xì)胞脫離底壁進(jìn)入溶液中。將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，在轉(zhuǎn)速為1000r/min 的離心機(jī)中離心4 min，然后重懸于 PBS 溶液中備用。

1.5肝細(xì)胞的冷凍保存

首先用 PBS 重懸細(xì)胞配制成細(xì)胞懸浮液備用。肝細(xì)胞的凍存采用自制的超聲植冰裝置及程序降溫盒。使用體積分?jǐn)?shù)為38.5%的乙二醇作為裝置載冷劑，將不同質(zhì)量的無水海藻糖加入重懸備用的細(xì)胞懸浮液中，配制成濃度為0.1，0.3，0.5，0.7 mol/L 的海藻糖細(xì)胞溶液。將細(xì)胞懸浮液預(yù)脫水，4種不同濃度的海藻糖細(xì)胞溶液均設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另取凍存管添加等量不含肝細(xì)胞的保護(hù)劑溶液作為對照，將對照凍存管和4個(gè)細(xì)胞凍存管同時(shí)放置在超聲植冰細(xì)胞凍存裝置的樣本槽中。另設(shè)置新鮮組、添加體積分?jǐn)?shù)為10%的 Me2SO 的慢速冷凍組[28]形成對照。選擇保存效果好的海藻糖組進(jìn)一步研究植冰對肝細(xì)胞凍存的影響，同濃度海藻糖慢速冷凍作為對照組。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，其中，*表示對照組，Δ表示實(shí)驗(yàn)組。

超聲植冰裝置凍存細(xì)胞：植冰時(shí)將搭載好的超聲容器與低溫恒溫槽連接，將載冷劑注入超聲內(nèi)盒體和低溫恒溫槽中，開啟制冷循環(huán)系統(tǒng)，待第二熱電偶檢測到超聲容器內(nèi)控溫相變液溫度達(dá)到指定需要的溫度并保持恒溫狀態(tài)，通過第一熱電偶實(shí)時(shí)監(jiān)測凍存管的溫度，當(dāng)檢測到溫度達(dá)到植冰溫度時(shí)，啟動(dòng)超聲波。植冰結(jié)束后關(guān)閉超聲波，細(xì)胞凍存管在控溫相變液中平衡5～10 min 使冰晶生長完全。平衡結(jié)束后將凍存管放入程序降溫盒轉(zhuǎn)移至?80℃冰箱進(jìn)行低溫保存過夜，第二天再將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮凍存24～48h。

程序降溫盒慢速凍存細(xì)胞：將凍存管直接裝入程序降溫盒置于?80℃的冰箱中進(jìn)行低溫保存過夜，降溫速率約為?1℃/min，第二天再將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮凍存24～48h。

1.6肝細(xì)胞存活率檢測

實(shí)驗(yàn)采取 AOPI 熒光染色法檢測細(xì)胞的存活率。為評估冷凍保存后細(xì)胞的存活率，將離心后的細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，用15μL 移液槍吸取15μL 細(xì)胞懸液到1.5 mL 離心管中，避光加入15μL AOPI 染液，輕輕混勻，4℃避光孵育10～20min，孵育完成后吸取15μL 的細(xì)胞染色液在載玻片的中央，蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡下觀察，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果代入公式β=104，計(jì)算細(xì)胞的分子濃度β，個(gè)/mL ，a 為4個(gè)大方格總數(shù)， b 為稀釋倍數(shù)。計(jì)數(shù)規(guī)則按照計(jì)上不計(jì)下、計(jì)左不計(jì)右。熒光顯微鏡激發(fā)光源波長為488 nm，接受光波長為520 nm。正常的細(xì)胞被染成綠色或者黃綠色，死細(xì)胞被染成紅色。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

獲得的熒光圖片采用 Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS Statistics 22.0軟件處理。每個(gè)樣本重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ SD ）的形式體現(xiàn)，以假設(shè)概率 p<0.05作為差異顯著評判標(biāo)準(zhǔn)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與討論

2.1超聲波植冰裝置參數(shù)的測定

使用自行組裝的超聲植冰裝置測定不同功率的超聲時(shí)，凍存管內(nèi)實(shí)驗(yàn)樣品的溫度隨超聲時(shí)間的變化關(guān)系如圖 2 所示。在不同電功率下，凍存管內(nèi)純水的溫度隨著超聲時(shí)間的增加而增加，具有非常明顯的線性關(guān)系。采用 origin?8.0 軟件擬合線性方程，如表 2 所示，對應(yīng)各電功率下擬合的溫度隨時(shí)間變化的線性方程，該線性方程可以近似地用來表示超聲植冰裝置內(nèi)純水溫度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線。根據(jù)公式 Ps= MCP 可分別求得不同超聲波電功率下實(shí)際消散在樣品中的功率 Ps。其中，M 為不同聲波電功率下保護(hù)液的質(zhì)量，Cp 為純水的比熱容，為擬合方程中超聲時(shí)間為 0?s 時(shí)，凍存管保護(hù)液溫度曲線的切線斜率。采用超聲波強(qiáng)度 Is 更好地表示超聲植冰裝置的參數(shù)對樣品的影響，超聲波強(qiáng)度 Is 可以用實(shí)際消散在單位面積上的超聲波功率表示。所得到的不同超聲波電功率下超聲作用時(shí)實(shí)際消散在凍存管中的功率 Ps 及超聲強(qiáng)度 Is 如表 3 所示。

2.2 不同濃度海藻糖對肝細(xì)胞存活率的影響

在保證植冰成功的前提下，預(yù)冷溫度應(yīng)盡可能高。依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)可知，超聲波強(qiáng)度為0.1041 W/cm2 時(shí)效果最好[20]，即功率 60?W、預(yù)冷溫度為?4?℃ 對肝細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。選用海藻糖作為冷凍保護(hù)劑，分別對濃度為 0.1，0.3，0.5，0.7?mol/L 海藻糖肝細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲植冰，陰性對照組是新鮮組，陽性對照組是添加體積分?jǐn)?shù)為 10% 的 Me2SO 組。復(fù)蘇后肝細(xì)胞存活率及細(xì)胞熒光染色圖片如圖 3 和圖 4 所示。

2.3超聲植冰與傳統(tǒng)植冰對肝細(xì)胞凍存的影響

對前面得出的肝細(xì)胞凍存后復(fù)蘇存活率較高的 0.3?mol/L 海藻糖+超聲植冰組進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，對比第?1?期李維杰，等：超聲植冰協(xié)同海藻糖冷凍保存 L-02 肝細(xì)胞研究 53 超聲植冰和傳統(tǒng)植冰凍存肝細(xì)胞的差異。圖 4 為超聲植冰與傳統(tǒng)植冰對肝細(xì)胞存活率的影響，慢速冷凍作為對照組。圖 4 為 0.3?mol/L 海藻糖+慢速冷凍組，0.3?mol/L 海藻糖+超聲植冰組和 0.3?mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組的肝細(xì)胞熒光圖像。植冰預(yù)冷溫度為?4?℃，超聲波強(qiáng)度為 0.1041 W/cm2。如圖 4所示，0.3 mol/L 海藻糖+慢速冷凍組（圖4（a1））存在大量死細(xì)胞，0.3 mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組（圖4（c1））存在較多的死細(xì)胞，而添加0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組（圖4（b1））存在較少的死細(xì)胞。結(jié)合圖5發(fā)現(xiàn)，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組與0.3 mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組細(xì)胞存活率無顯著性差異；傳統(tǒng)慢速冷凍方案，0.3 mol/L 海藻糖+慢速冷凍組細(xì)胞存活率為（76.9±3.1）%，與超聲植冰組和傳統(tǒng)植冰組存在顯著性差異；如圖6所示，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組細(xì)胞存活率為（87.6±2.0）%，略高于0.3mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組（84.3±1.0）%。利用一定濃度的海藻糖作為保護(hù)劑結(jié)合超聲植冰，可以有效地保存肝細(xì)胞，其保存效果同使用10% Me2SO 效果類似，該結(jié)果與 Huang 等[29]的結(jié)果一致。由此可見，利用超聲波進(jìn)行植冰配合非滲透性保護(hù)劑海藻糖代替?zhèn)鹘y(tǒng)滲透性保護(hù)劑Me2SO 是一種可行的方案。如果不使用超聲波，單純使用海藻糖并不能獲得較好的保存效果，側(cè)面印證了超聲波植冰作為一種新型的保存手段，在提高肝細(xì)胞保存效果時(shí)具有重要作用。

3結(jié)論

超聲波作用于過冷的溶液會(huì)誘導(dǎo)成核，本文結(jié)合自行組裝的超聲植冰裝置使用非滲透性保護(hù)劑海藻糖保存肝細(xì)胞。其中，超聲波頻率為40 kHz，超聲波強(qiáng)度為0.1041 W/cm2，預(yù)冷溫度為?4℃，研究了不同海藻糖濃度對肝細(xì)胞存活率的影響，結(jié)論如下：

a.非滲透性保護(hù)劑海藻糖的濃度對肝細(xì)胞的保存有較大的影響，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組肝細(xì)胞復(fù)蘇存活率為（87.6±2.0）%，與0.1 mol/L 海藻糖+超聲植冰組、0.5 mol/L 海藻糖+超聲植冰組和0.7mol/L 海藻糖+超聲植冰組存在顯著性差異，與傳統(tǒng)的10%Me2SO 保存肝細(xì)胞的方法無顯著性差異；

b.超聲植冰法可作為肝細(xì)胞保存的有效手段，0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰組與0.3 mol/L 海藻糖+傳統(tǒng)植冰組（（84.3±1.0）%）細(xì)胞存活率無顯著差異，添加0.3mol/L 海藻糖+慢速冷凍組細(xì)胞存活率僅為（76.9±3.1）%，添加0.3 mol/L 海藻糖+超聲植冰能提高肝細(xì)胞存活率；

c.超聲植冰與傳統(tǒng)植冰的冷凍效果一致，但操作更為簡單，且配合非滲透性海藻糖避免了臨床上的副作用及凍存后保護(hù)劑的洗脫，該冷凍方案有望推廣到其他細(xì)胞的冷凍中，為樣本庫的建設(shè)提供技術(shù)支持。

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（編輯：石瑛）