陳雨，盧業(yè)才

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院胃腸外科，安徽 巢湖 238000）

惡性腫瘤是困擾全人類健康的重要疾病之一，結(jié)直腸癌（colorectal cancer）是胃腸道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)以41～65 歲人群發(fā)病率較高。近20 年來(lái)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率明顯上升[2]。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，人們暴露于各種致癌因素的機(jī)會(huì)較前大大增加。針對(duì)結(jié)腸癌的治療方法包括手術(shù)、化療[1，2]等多方法。本研究通過(guò)信息生物學(xué)的方法，挖掘透明質(zhì)酸介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)因子受體基因（HMMR 基因）表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，分析HMMR 基因表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后生存的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的診斷及治療提供新的思路和方向。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）下載（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE140973）結(jié)直腸癌基因表達(dá)譜，使用數(shù)據(jù)集GSE140973 篩選差異表達(dá)基因（DEGs），該基因樣本包含114 個(gè)樣本，共檢測(cè)44 495 個(gè)基因數(shù)據(jù)，使用R 軟件的“l(fā)imma”軟件包預(yù)設(shè)篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇P＜0.05和|Log2fold change（FC）|＞1 作為截止標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行DEGs 的篩選。通過(guò)上述方法篩選兩組樣本之間的差異表達(dá)基因。

1.2 功能和途徑富集分析 使用DAVID 據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）[3]對(duì)DEGs 進(jìn)行富集分析，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)FDR＜0.05 進(jìn)行GO 分析和KEGG 分析，通過(guò)GO 分析和KEGG 通路分析進(jìn)行可視化研究。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用搜索工具檢索交互基因數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.string-db.org/）評(píng)估PPI 信息。此外，為了評(píng)估DEGs 之間的相互關(guān)系，使用字符串?dāng)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，并使用Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化[4]。

1.4 獲取Hub 基因并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證 使用插件cytoHubba 在Cytoscape 中選擇PPI 網(wǎng)絡(luò)的中心模塊[5]。設(shè)置參數(shù)：Hubba nodes:Top 10 nodes ranked by DMNC，獲取具有高度連通性的前10 個(gè)DEGs，將其作為結(jié)直腸癌的Hub 基因。GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基于TCGA 的在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置參數(shù)：P≤0.01，癌癥組織為結(jié)腸癌，|Log2FC| Cutoff=1，Jitter Size＝0.4，進(jìn)行差異表達(dá)分析；生存分析設(shè)置參數(shù)：Group Cutoff=Median，95% Confidence Interval=yes，Cutoff-High（%）=50，Cutoff-Low（%）=50，組織為結(jié)腸癌組織，獲得的Hub 基因通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析和基因差異表達(dá)分析驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中 DEGs 的鑒定 通過(guò)GSE140973 數(shù)據(jù)集確定了807 個(gè)DEGs，其中653個(gè)上調(diào)，154 個(gè)下調(diào)，見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織的DEGs

2.2 DEGs 的GO 分析和KEGG 分析 GO 分析結(jié)果顯示，DEGs 的生物過(guò)程（BP）主要富集在糖酵解過(guò)程、典型糖酵解、細(xì)胞分裂、有絲分裂核分裂、姐妹染色單體粘連、染色體分離、染色體組織、有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S 轉(zhuǎn)換及對(duì)藥物的反應(yīng)方面，見(jiàn)圖2A。DEGs 的分子功能（MF）主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP 結(jié)合血小板衍化等方面，見(jiàn)圖2B。DEGs 的細(xì)胞成分（CC）主要富集在染色體著絲粒區(qū)、胞漿、濃縮染色體動(dòng)粒、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)部位，見(jiàn)圖2C。KEGG 分析顯示，DEGs 主要富集在糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、細(xì)胞周期、HIF-1 信號(hào)通路、碳代謝、癌癥的中樞碳代謝、抗生素的生物合成、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、半乳糖代謝中，見(jiàn)圖2D。

圖2 DEGs 的GO 分析和KEGG 分析（續(xù)）

圖2 DEGs 的GO 分析和KEGG 分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及Hub 基因獲取 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)由354 個(gè)節(jié)點(diǎn)和5662 個(gè)邊緣組成，包括653 個(gè)上調(diào)基因和154 個(gè)下調(diào)基因。具有高度連通性的前10個(gè)DEGs 是結(jié)直腸癌的Hub 基因（HMMR、SHCBP1、ERCC6L、ZWINT、FAM83D、CDCA2、SPC25、SKA1、KIAA0101、MND1），它們可能在腫瘤發(fā)生和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見(jiàn)圖3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.4 生存分析和差異表達(dá)分析 根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果基因，將其上傳至GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其進(jìn)行生存分析和預(yù)后分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得HMMR 基因在差異分析和生存分析中均有意義，見(jiàn)圖4。

圖4 生存和差異表達(dá)分析

3 討論

結(jié)直腸癌是一種生物學(xué)異質(zhì)性疾病，大約70%的結(jié)直腸癌是由腺瘤性息肉演變而來(lái)，從形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)到增生、腺瘤及癌變各階段以及相應(yīng)的染色體改變，耗時(shí)10～15 年，但也有約30%的癌不經(jīng)腺瘤演變直接以癌巢的形式出現(xiàn)[6]。隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)直腸癌癌變過(guò)程中的基因改變逐漸被認(rèn)識(shí)，已知結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段及多基因參與的細(xì)胞遺傳性疾病。因此，了解其分子機(jī)制對(duì)于更好地診斷和治療結(jié)直腸癌至關(guān)重要。

本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中有807 個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了改變。在807 個(gè)DEGs 中，653 個(gè)上調(diào)，154 個(gè)下調(diào)。進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，以確定與結(jié)直腸癌臨床特征相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和基因共表達(dá)模塊。此外，還進(jìn)行了功能和途徑分析，以發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌相關(guān)的生物過(guò)程和途徑。通過(guò)對(duì)DEGs 的GO 分析、KEGG 分析，并對(duì)DEGs 進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析獲取Hub 基因，并對(duì)Hub 基因進(jìn)行生存分析和差異分析，得知HMMR 基因在結(jié)腸癌中高表達(dá)，HMMR 基因的高表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者的生存具有影響。

HMMR 基因位于人類五號(hào)染色體，HMMR 首先被確定為從鼠細(xì)胞上清液中純化的新型透明質(zhì)酸受體復(fù)合物的成分，HMMR 基因編碼的透明質(zhì)酸介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)因子受體蛋白參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，其在乳腺組織中表達(dá)，并與其他蛋白質(zhì)一起與BRCA1 和BRCA2 形成復(fù)合物。目前已經(jīng)證實(shí)HMMR 基因的表達(dá)與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[7]。同時(shí)有研究表明HMMR 基因表達(dá)與肺癌和肝癌相關(guān)[8，9]。透明質(zhì)酸是一種細(xì)胞外基質(zhì)成分，可吸收組織中的水分并與細(xì)胞表面受體[如分化簇44（CD44）]結(jié)合以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)[10]。HMMR 可定位蛋白質(zhì)復(fù)合物以增強(qiáng)有絲分裂激酶（如Polo 樣激酶1 和極光激酶A）的活性，并控制動(dòng)力蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，HMMR 的結(jié)構(gòu)是一種卷曲螺旋微管相關(guān)蛋白，它可以通過(guò)其N 端直接與微管結(jié)合，并通過(guò)其C 端BZIP 序列定位到中心體[11]。HMMR 作為紡錘體組裝因子（如TPX2、DYNLL1 和CHICA/FAM83D）的結(jié)合伙伴，在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中調(diào)節(jié)紡錘體微管的組裝、穩(wěn)定性和定位。在有絲分裂之前和期間，細(xì)胞中HMMR 的表達(dá)升高，而可檢測(cè)到HMMR 表達(dá)的組織往往高度增殖。目前已經(jīng)證實(shí)HMMR 基因是乳腺癌的易感基因。HMMR 在結(jié)構(gòu)上與C 端BZIP 序列非常相似在Xklp2 中，它可以與TPX2 進(jìn)行交互[12]。TPX2 是一種微管相關(guān)蛋白，由位于人類染色體帶20q11.1 的基因編碼。它是哺乳動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)粒處微管形成所必需的，TPX2 位于Ran-GTP 的下游，在紡錘體形成中起著核心作用[13，14]。在有絲分裂的早期階段，TPX2 以依賴Ran-GTP 的方式釋放，TPX2表達(dá)在細(xì)胞周期階段受到嚴(yán)格調(diào)控，在G1～S 轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)可檢測(cè)到，并在胞質(zhì)分裂完成時(shí)消失，TPX2 在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中的高表達(dá)[15]，抑制TPX2 表達(dá)會(huì)使PI3K/AKT 信號(hào)通路失活并降低結(jié)腸癌細(xì)胞的致瘤性[16]。PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路控制多種細(xì)胞過(guò)程，包括代謝、運(yùn)動(dòng)、增殖、生長(zhǎng)和存活，是人類癌癥中最常見(jiàn)的失調(diào)通路之一[17，18]。

在HMMR 沉默的細(xì)胞中，抑制性TPX2-Eg5 復(fù)合物降低，目前已知這些復(fù)合物會(huì)抑制Eg5 活性，干擾TPX2 和Eg5 附近紡錘極之間的共定位[19]。HMMR 能夠調(diào)節(jié)非有絲分裂細(xì)胞中的TPX2 的定位[20]。其中HMMR 通過(guò)BZIP 序列將TPX2 定位在微管負(fù)端附近，這使得TPX2-Eg5 復(fù)合物形成。需要HMMR 介導(dǎo)的Eg5 活性調(diào)節(jié)來(lái)穩(wěn)定雙極紡錘體并促進(jìn)動(dòng)粒-微管附著，這是細(xì)胞分裂進(jìn)入后期和染色體分離所必需的，這也突出了非運(yùn)動(dòng)銜接蛋白在調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和維持基因組穩(wěn)定性方面的重要性。已知TPX2 在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[21，22]，而本次研究發(fā)現(xiàn)HMMR 在結(jié)腸癌的診斷和預(yù)后分析方面有重要作用，TPX2 和HMMR 可在細(xì)胞內(nèi)形成交互作用，而TPX2 表達(dá)會(huì)影響PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的致瘤性，因此預(yù)測(cè)HMMR 基因的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌的影響是通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)發(fā)揮作用的。

綜上所述，HMMR 基因在結(jié)腸癌中表達(dá)上升，且HMMR 基因的高表達(dá)和結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，HMMR 基因表達(dá)能夠延長(zhǎng)結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間。