韓帥兵，張耀中，于 淼，薛 雯，李向陽，高中華，周 力

(山東省農(nóng)藥檢定所，山東 濟南 250100)

蔥是一種常見的蔬菜或調(diào)味品，在我國各地均有種植，且種植面積及產(chǎn)量持續(xù)增長[1]，已經(jīng)成為一種比較重要的經(jīng)濟作物。蔥的生長過程中易發(fā)生紫斑病、銹病等病害，影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。氰霜唑是對卵菌門細菌具有高度活性的新型苯基咪唑類殺菌劑，廣泛用于防治霜霉病、疫霉病、晚疫病和疫病等病害[2-5]，目前我國在大白菜、番茄、黃瓜、荔枝、馬鈴薯、葡萄、西瓜等作物上對氰霜唑進行了登記。氰霜唑于田間施用后，在植物體內(nèi)會迅速分解為4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)結(jié)構(gòu)式(圖 1)，其較母體氰霜唑更易被吸收，同時與氰霜唑相比具有更高的毒性[6]。

圖1 氰霜唑及其代謝物CCIM結(jié)構(gòu)式

關(guān)于氰霜唑在番茄、葡萄、白菜、大蒜等作物上的殘留及消解行為的研究國內(nèi)外已有諸多報道[7-12]。而氰霜唑在蔥上的殘留、消解及膳食風(fēng)險評估研究至今還未見報道。本文建立了將樣品中氰霜唑及其代謝物CCIM經(jīng)乙腈提取后，用UPLC-MS/MS檢測的方法，并在山東濟南、河北定州、河南濟源、浙江紹興、云南曲靖、湖北武漢進行了100 g/L氰霜唑懸浮劑在蔥上的1年6地殘留及消解動態(tài)田間試驗，并根據(jù)所得試驗數(shù)據(jù)進行了膳食暴露風(fēng)險評估，為該藥在蔥上的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

1.1.1 供試材料 供試農(nóng)藥：100 g/L氰霜唑懸浮劑；氰霜唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.9%)；CCIM標(biāo)準(zhǔn)品：(純度99.9%)。

1.1.2 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(島津LCMS-8050配有電噴霧離子源(ESI))；

萬分之一分析天平(CPA 225D)；百分之一分析天平(CP1502)；自動勻漿機(HESTIA A437)；氮吹儀(N-EVAP112)；移液器；0.22 μm有機濾膜；量筒等。

1.1.3 試劑 乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；NaCl(分析純)。

1.2 田間試驗

1.2.1 試驗地點 山東濟南、河北定州、河南濟源、浙江紹興、云南曲靖、湖北武漢；試驗時間：2018年；小區(qū)面積15 m2，重復(fù)3次，隨機排列，小區(qū)間設(shè)保護帶。另設(shè)對照小區(qū)。100 g/L氰霜唑懸浮劑劑在蔥上防治紫斑病，推薦使用劑量：55～80 g/667m2(82.5～120 g a.i./ha)，噴霧處理，每季最多使用3次，施藥間隔7 d。

1.2.2 消解動態(tài) 按制劑量120 g/667m2(180 g a.i./ ha，推薦最高用量1.5倍)，于蔥生長中期開始施藥，小區(qū)面積50 m2，施藥次數(shù)1次，施藥后間隔2 h(原始沉積量)、1、3、5、7、14、21、28、35 d采集蔥樣品。另設(shè)清水空白對照。每次隨機采集≥2 kg生長正常的蔥樣本，用不銹鋼刀具切碎后充分混勻，縮分后留樣，于-20℃冰箱保存，待測。

1.2.3 最終殘留 設(shè)2個施藥劑量：低劑量和高劑量。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每小區(qū)15 m2。低劑量按制劑量80 g/667 m2(120 g a.i./ ha)，高劑量按制劑量120 g/667 m2(180 g a.i./ ha)，各設(shè)3次和4次施藥2個處理，在蔥生長中期開始施藥，施藥間隔為7 d。采樣時間距最后一次施藥的間隔時間為7、10、14 d。另設(shè)清水空白對照。樣品采集及處理方法同消解動態(tài)。

1.3 檢測方法

1.3.1 方法原理簡述 蔥中的氰霜唑及其代謝物CCIM經(jīng)乙腈高速勻漿提取，NaCl鹽析，上清液用甲醇稀釋后，過濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.3.2 樣品前處理 稱取蔥樣品15.00 g于具塞離心管中，加入30.0 mL乙腈，高速勻漿2 min。加入4～5 g NaCl，振蕩2 min，3 500 r/m離心5 min。移取1.0 mL上清液于玻璃離心管中，加入1.0 mL甲醇，渦旋，過0.22 μm濾膜待測。

1.3.3 分析測定條件 色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ(2.0 mm I.D.×75 mm，1.6 μm)。

流動相：A甲醇，B 0.1%甲酸水溶液

流速及梯度：(表1)

表1 流動相流速及梯度設(shè)置

離子源：ESI；檢測方式：MRM；電離電壓：4.5 kV；碰撞氣及壓力：Ar，0.23 MPa；霧化氣流速：3.0 L/min；檢測器電壓：1.74 kV；干燥氣流速：10.0 mL/min加熱氣流速：10.0 mL/min；進樣量：0.5 μL；監(jiān)測離子對及碰撞電壓(表2)。

氰霜唑、CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液及試驗樣品譜圖(圖2～4)。

表2 監(jiān)測離子對及碰撞電壓

圖2 氰霜唑、CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

圖3 空白蔥樣品譜圖

圖4 蔥樣品譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍及定量限 氰霜唑和CCIM殘留量測定采用外標(biāo)法定量。分別準(zhǔn)確稱取適量氰霜唑及CCIM標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成100 mg/L左右的氰霜唑及CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液，再移取適量兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制成4.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。為消除液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測樣品時的基質(zhì)效應(yīng)[13]，用空白蔥基質(zhì)溶液逐級稀釋成0.002、0.01、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進行測定，以氰霜唑及CCIM的質(zhì)量濃度與色譜峰面積分別作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中Y為氰霜唑或CCIM峰面積，X為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，結(jié)果表明，在0.002～1.0 mg/L范圍內(nèi)，氰霜唑、CCIM峰面積與質(zhì)量濃度間均成良好的線性關(guān)系(圖5)。

圖5 氰霜唑與CCIM標(biāo)準(zhǔn)曲線

氰霜唑在蔥基質(zhì)中線性方程為：Y= 1.727 12×106X+1 372.1R2=0.998 8

CCIM在蔥基質(zhì)中線性方程為：Y=810 216X+729.1R2=0.995 0

通過最小添加水平得到氰霜唑和CCIM在蔥中的定量限(LOQ)均為0.01 mg/kg。

2.2 添加回收率和精密度 在蔥空白樣品中，分別添加0.01、0.1、2.0 mg/kg 3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的氰霜唑、CCIM標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)5次，用上述分析方法測定回收率。CCIM在蔥中的添加回收率為84.6～92.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.9%(表3)；氰霜唑在蔥中的平均添加回收率為91.7%～94.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～2.1%(表4)，符合農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 CCIM在蔥中添加回收率試驗結(jié)果

表4 氰霜唑在蔥中添加回收率試驗結(jié)果

2.3 氰霜唑在蔥中的消解動態(tài) 山東氰霜唑在蔥中的原始沉積量為2.83 mg/kg，藥后14 d消解達85.2%，藥后21 d以后樣品中殘留量均<0.01 mg/kg；浙江氰霜唑在蔥中的原始沉積量為3.46 mg/kg，藥后14 d消解達94.4%，藥后28 d以后樣品中殘留量均<0.01 mg/kg，總的來說消解速度較快。氰霜唑的殘留量(C，mg/kg)與其施藥后的取樣時間(t，d)之間呈較明顯的負指數(shù)關(guān)系，可用一級化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)方程式：Ct=C0e-kt，(其中C0為施藥后氰霜唑的原始沉積量，Ct為取樣間隔t時間的氰霜唑的濃度，k為消解速率常數(shù)，t為取樣間隔的天數(shù))來表示。山東為：C= 2.769e-0.18t，R2=0.910，T1/2=3.9 d；浙江為：C= 2.608e-0.18t，R2=0.962，T1/2=3.9 d。具體檢測數(shù)據(jù)(表5)，擬合曲線(圖6)。

表5 氰霜唑在蔥中消解動態(tài)試驗結(jié)果

圖6 氰霜唑在蔥上的消解動態(tài)曲線

2.4 氰霜唑在蔥中的最終殘留 在蔥上的最終殘留試驗低劑量按制劑量80 g/667 m2(120 g a.i./ha)和120 g/667 m2(180 g a.i./ ha)于蔥生長中期進行第1次施藥，施藥間隔期7 d，施藥3～4次，于末次施藥后間隔7、10和14 d采集蔥樣本分析測試。試驗結(jié)果如下：

采收間隔期7 d，氰霜唑殘留量為0.029～6.15 mg/kg，CCIM殘留量為<0.01～0.056 mg/kg；采收間隔期10 d，殘留量為氰霜唑殘留量為<0.01～2.01 mg/kg，CCIM殘留量為<0.01～0.014 mg/kg；采收間隔期14 d，殘留量為氰霜唑殘留量為<0.01～1.88 mg/kg，CCIM殘留量為<0.01～0.014 mg/kg。具體數(shù)據(jù)(表6、7)。

2.5 氰霜唑在蔥上的膳食風(fēng)險評估 JMPR會議(2015 Evaluation)報告規(guī)定氰霜唑膳食攝入評估定義為氰霜唑與其代謝物CCIM之和[14]，則氰霜唑(含CCIM)殘留量按照以下公式進行計算：

公式中，X為氰霜唑(含CCIM)殘留量，C氰霜唑為氰霜唑殘留量，CCCIM為CCIM殘留量，當(dāng)CCIM殘留量

表6 氰霜唑在蔥中的最終殘留

表7 CCIM在蔥中的最終殘留

表8 氰霜唑(含CCIM)在蔥中的最終殘留

依據(jù)2004年衛(wèi)生部發(fā)布的《中國不同人群消費膳食分組食譜》，綜合試驗所得的殘留試驗中值和已制定的最大殘留限量(MRLs)，采用以下公式進行膳食風(fēng)險評估。

NEDI(mg/kg，bw)=

其中，NEDI為每日攝入量；FI為食物攝入量；STMR為試驗所得殘留中值或已制定的最大殘留限量；bw為中國居民平均體重，為63 kg；RQ為風(fēng)險商，ADI為每日允許攝入量，我國規(guī)定氰霜唑的ADI值為0.2 mg/kg bw[15]。RQ值越高表示風(fēng)險越高，RQ>1則表示對人類健康的風(fēng)險不能接受。

基于風(fēng)險最大化原則，本研究將目前氰霜唑在我國已有的登記作物均納入了膳食風(fēng)險評估范圍，包括大白菜、番茄、馬鈴薯、黃瓜、葡萄等作物，這些作物中國均規(guī)定了最大殘留限量[15]。本研究根據(jù)蔥10 d采收間隔的最終殘留數(shù)據(jù)來評估氰霜唑的長期膳食風(fēng)險，所用殘留中值、參考限量值及評估結(jié)果(表9)。結(jié)果表明，氰霜唑在所有登記作物中的膳食暴露風(fēng)險值RQ為0.12，遠低于1。因此，氰霜唑在蔥中的殘留量對我國一般人健康風(fēng)險可以接受。

表9 蔥中氰霜唑膳食風(fēng)險評估結(jié)果

3 結(jié)論

研究建立了UPLC-MS/MS測定蔥中氰霜唑及其代謝物CCIM殘留量的分析方法。結(jié)果表明：氰霜唑和CCIM在蔥中的定量限(LOQ)均為0.01 mg/kg。氰霜唑在蔥中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01～2.0 mg/kg時，平均回收率為91.7%～94.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～2.1%；CCIM在在蔥中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01～2.0 mg/kg時，平均回收率為84.6%～92.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.9%。方法的重現(xiàn)性好，回收率、精密度及檢出限均可滿足該農(nóng)藥的殘留分析要求。

氰霜唑在蔥中的殘留消解符合一級動力學(xué)方程，在山東、浙江的半衰期均為3.9 d。

我國制定氰霜唑在蔥上的最大殘留限量為5 mg/kg，氰霜唑的ADI值為0.2 mg/kg bw。最后1次施藥后10 d，六地蔥中氰霜唑的殘留量為<0.01～2.01 mg/kg，均未超過我國規(guī)定的氰霜唑在蔥中的MRL值；根據(jù)膳食風(fēng)險評估結(jié)果，氰霜唑日均攝入風(fēng)險商值為0.12，<1，不會對一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險。

試驗結(jié)果：100 g/L氰霜唑懸浮劑，防治蔥紫斑病，最高制劑用藥量80 g/667 m2(有效成分120 g a.i./ha)，最多施藥3次，施藥間隔7 d，安全間隔期為10 d。