【摘 要】

在前期建立的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋獲得高良姜黃酮醇合成酶（flavonol synthase， FLS）編碼基因序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件對(duì)該基因及其編碼蛋白進(jìn)行序列分析，探討其編碼蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、高級(jí)結(jié)構(gòu)、保守功能域以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并運(yùn)用fragments per kilobase of exon per million reads mapped （FPKM）法計(jì)算該基因在高良姜不同組織中的表達(dá)差異。獲得的高良姜FLS基因含有1005 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼含有334個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。編碼蛋白的序列分析發(fā)現(xiàn)，高良姜FLS蛋白分子量約為38.2 kDa，屬于親水性、混合結(jié)構(gòu)型蛋白，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域并定位在細(xì)胞質(zhì)；具有黃酮醇合成酶保守功能域。FLS基因在高良姜不同組織中的表達(dá)趨勢(shì)為根莖>莖>葉片。上述結(jié)果可為后續(xù)利用該基因調(diào)控高良姜黃酮醇類成分的生物合成奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 高良姜；黃酮醇合成酶；生物信息學(xué)

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）06-0027-04

Bioinformatics Analysis of Gene Encoding Flavonol Synthase from Alpinia officinarum

HUANG Qionglin

Guangdong Medical University， Zhanjiang 524023， China

Abstract：

To analyze cDNA sequence feature of FLS gene and the function of its coding protein from traditional Chinese medicine Alpinia officinarum， a FLS gene was annotated from the transcriptome of A.officinarum and then analyzed using bioinformatics approaches. The results revealed that acquired FLS gene contained an open reading frame with a length of 1005 bp and encoded 334 amino acids. The FLS protein was a hydrophilic and hybrid protein and its molecular weight was 38.2 kDa. The FLS protein did not contain transmembrane domain and locate in cytoplasm. The FLS protein also contained a flavonol synthase functional domain and belonged to flavonol synthase superfamily. The FLS gene expressed highest in rhizome， and followed by stem， and least in leaf of A.officinarum. The results would provide a firm foundation for the biosynthesis of the medicinal flavonol in A.officinarum.

Keywords：AlpiniaofficinarumHance; Flavonol Synthase; Bioinformatics

高良姜是嶺南地區(qū)道地中藥材，也是民間常用調(diào)味劑和湯料，來(lái)源于姜科多年生植物高良姜Alpiniaofficinarum Hance的干燥根莖，具有散寒止痛、溫中止嘔的功效［1］。據(jù)資源［2-3］調(diào)查，高良姜野生資源已幾乎滅絕，人工栽培的規(guī)模和產(chǎn)量也在逐年下降，部分產(chǎn)區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)供不應(yīng)求的趨勢(shì)。黃酮類是高良姜發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。高良姜含有高良姜素、高良姜素-3-O-甲醚、山萘酚、槲皮素等黃酮醇成分，這些成分具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗菌等藥理活性［4］。鑒于高良姜的藥效成分較為明確，開(kāi)展基于黃酮醇生物合成的基因調(diào)控研究，是促進(jìn)高良姜有效成分積累和資源可持續(xù)利用的可考慮途徑之一。

黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）是植物類黃酮生物合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控酶之一，能使二氫黃酮C3位發(fā)生羥基化，進(jìn)而催化成一系列黃酮醇類化合物［5-6］。FLS編碼基因的表達(dá)已被證實(shí)對(duì)黃酮醇含量具有正調(diào)控作用［7-8］。當(dāng)前，青天葵［9］、杜仲［10］、金銀花［11］等藥用植物FLS基因已得到克隆。

本研究從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中挖掘和鑒定高良姜FLS基因，使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行該基因及其編碼蛋白的序列特點(diǎn)分析和功能預(yù)測(cè)，并采用fragments per kilobase of exon per million reads mapped （FPKM）法探討其在高良姜中的表達(dá)模式，以期為利用基于FLS基因的基因工程途徑調(diào)控高良姜黃酮醇的生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因序列 在前期研究中，作者分別以高良姜葉片、莖和根莖為材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組高通測(cè)序，并通對(duì)序列組裝獲得了147652條非冗余基因（unigene）［12］。本研究以“flavonol synthase”為檢索詞，在上述獲得的unigene中搜索編碼高良姜FLS的基因序列。

1.2 生物信息學(xué)分析 采用公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（見(jiàn)表1）進(jìn)行高良姜FLS結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)和分析。

1.3 高良姜FLS基因的表達(dá)分析 采用FPKM法計(jì)算FLS基因在高良姜葉片、莖和根莖中的表達(dá)量，其計(jì)算公式為：高良姜FLS基因表達(dá)量=（FLS基因的fragment數(shù)×109）/（FLS基因序列長(zhǎng)度×樣品fragment總數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列 在高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢索到一條長(zhǎng)度為1050 bp的高良姜FLS基因cDNA序列，將其命名為AoFLS，其中包含1002 bp編碼區(qū)、35 bp 5端非編碼區(qū)和10 bp 3端非編碼區(qū)。AoFLS開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF）長(zhǎng)度為1005 bp，編碼334個(gè)氨基酸。

2.2 編碼蛋白AoFLS的功能域分析 如圖2所示，AoFLS含有3個(gè)功能域，分別是1個(gè)特異性功能域——α-同戊二酸依賴性雙加氧酶（α-oxoglutarate-dependent dioxygenase，2OG-FeII_Oxy）、2個(gè)非特異性功能域——黃酮醇合成酶（flavonol synthase）和異青霉素N合成酶及相關(guān)雙加氧酶（Isopenicillin N synthase and related dioxygeneases），說(shuō)明AoFLS具有黃酮醇合成酶的功能。因此，AoFLS確定為高良姜黃酮醇合成酶基因，其編碼蛋白即高良姜黃酮醇合成酶。

2.3 編碼蛋白AoFLS的理化性質(zhì)分析 AoFLS的分子量為38.2 kDa，等電點(diǎn)為6.15，屬于酸性蛋白質(zhì)。在氨基酸組成上，含量較為豐富的是賴氨酸（Lys）和谷氨酸（Glu），所占比例均為9.0%。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為39.94，小于40，說(shuō)明其為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.4 編碼蛋白AoFLS的親/疏水性分析 如圖3所示，AoFLS多肽鏈第175位的絲氨酸具有最高的分值0.820，此處表現(xiàn)出最強(qiáng)的疏水性；位于第316位的苯丙氨酸顯現(xiàn)最低分值-2.653，此處為親水性最強(qiáng)。從整條多肽鏈來(lái)看，AoFLS整體表現(xiàn)為親水性，而且不存在明顯的疏水區(qū)域，說(shuō)明其為親水性蛋白質(zhì)。

2.5 編碼蛋白AoFLS的跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析 從圖4所示的跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果可知，AoFLS的整條多肽鏈位于細(xì)胞膜外的概率均高于整條多肽鏈位于細(xì)胞膜內(nèi)或部分氨基酸存在跨膜結(jié)構(gòu)的概率，說(shuō)明該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)。另外，亞細(xì)胞定位分析顯示，AoFLS蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的積分值為10.00，位于細(xì)胞核、細(xì)胞外、葉綠體等位置的積分值均為0，表明AoFLS蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)上。

2.6 編碼蛋白AoFLS的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 如圖5所示，組成AoFLS二級(jí)結(jié)構(gòu)的元件有α-螺旋、隨意卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角等四種，各自的比例分別是34.73%、42.51%、17.37%和5.39%，說(shuō)明AoFLS蛋白具有以α-螺旋和隨意卷曲為主要組成元件的混合型結(jié)構(gòu)。

2.7 AoFLS基因表達(dá)分析 基于FRKM法計(jì)算AoFLS在高良姜不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖6所示，該基因在根莖中的表達(dá)最高，其次是莖，在葉片中的表達(dá)則最少。

3 討論

黃酮醇合成酶不僅決定植物黃酮醇類物質(zhì)的合成與積累，還影響植物花色的形成、種子數(shù)量等生理過(guò)程，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)［13-14］。因此，開(kāi)展FLS基因及其編碼蛋白功能和調(diào)控研究對(duì)高良姜黃酮醇成分的合成及其品種優(yōu)育有著重要的促進(jìn)作用。

本研究在高良姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上鑒定出了AoFLS基因，獲得了其1002 bp的編碼區(qū)序列及編碼334個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列。AoFLS蛋白含有黃酮醇合成酶的典型功能域并歸屬于黃酮醇合成酶超級(jí)家族，說(shuō)明其具有催化黃酮醇化合物合成的功能。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)AoFLS為親水性混合結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域并且定位在細(xì)胞質(zhì)。這些結(jié)論為后續(xù)高良姜FLS蛋白的分離、功能鑒定和調(diào)控研究提供了參考依據(jù)。

FRKM法是在分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)常用的一種基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法，它對(duì)測(cè)序長(zhǎng)度和基因長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化處理，使得不同長(zhǎng)度的基因在不同測(cè)序深度下得到的基因表達(dá)水平具有可比性［15-16］。FRKM法分析顯示，AoFLS在高良姜不同組織中均有表達(dá)，并且在根莖中表達(dá)最高，提示高良姜黃酮醇的合成可能在根莖中更為活躍，這也與高良姜以根莖入藥的事實(shí)相符。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定出高良姜FLS基因，進(jìn)行了其編碼蛋白的序列分析和功能預(yù)測(cè)，明確該基因在高良姜的表達(dá)模式，為后續(xù)利用FLS基因調(diào)控高良姜黃酮醇類藥效成分的合成，促進(jìn)其資源可持續(xù)利用奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-07-27 編輯：陶希睿）