張 丹,馬紅榮,段勛軍,喬維范,耶芳芳,馬 強,冶貴生,馬玉花

(1.青海大學 農(nóng)牧學院,西寧 810016; 2.海東市樂都區(qū)下北山林場,青海海東 810699;3.西寧市西山林場,西寧 810016)

干旱脅迫是影響全球作物產(chǎn)量最重要的環(huán)境因子。在過去的10 a,全球變暖顯著增加干旱發(fā)生的頻率[1-2]。目前,世界上大約三分之一的國家面臨不同程度的水資源短缺,但預計水資源可獲得性將進一步下降20%～70%[3],這不僅增加了干旱的頻率,同時也提高了植物高效利用水資源的需求,還會引發(fā)糧食短缺、木材的有效供給降低、農(nóng)民種植業(yè)經(jīng)濟效益受損等一系列社會問題。因此,研究植物的抗旱機理,提高植物的耐旱性從而節(jié)約水資源尤為重要。在長期進化過程中,為了響應干旱脅迫以確保在缺水環(huán)境中生存,植物在分子、生化、生理和發(fā)育水平上形成一系列復雜的應激反應機制[4-5]?；虮磉_的轉錄調(diào)控是最重要的調(diào)控機制之一,轉錄因子(Transcription Factors TFs)與特定順式作用調(diào)控元件(Cis-Acting Regulatory Elements CAREs)上的DNA結合,從而決定轉錄的起始,激活或抑制應激誘導基因的表達[6],是調(diào)控基因表達的關鍵調(diào)控因子之一[7]。

NAC(NAM-ATAF-CUC)是最大的植物特異性轉錄因子家族之一[8]。NAC轉錄因子廣泛存在于植物中,在模式植物水稻和擬南芥中分別鑒定出了151和117個NAC轉錄因子[9],在沙棘(Hippophaerhamnoides)中鑒定出177個NAC家族基因[10]。研究表明NAC家族基因參與調(diào)控植物細胞內(nèi)各種生理生化過程,包括頂端分生組織、細胞分裂、次生壁的形成、葉片衰老、開花和種子的形成。此外,NAC家族基因在植物響應非生物脅迫過程中也起著至關重要的作用,大多數(shù)NAC轉錄因子被各種非生物脅迫和生物脅迫誘導[11]。研究表明,干旱脅迫下,小麥(Triticumaestivum)葉片和小麥籽粒中23個TaNAC基因中,7個具有葉片特異性表達,5個具有籽粒特異性表達[12];對遼寧堿蓬(Suaedaliaotungensis)的SlNAC1基因進行功能驗證,結果顯示轉基因擬南芥的成活率較高,水分損失率低于野生型和對照組,表明SlNAC1能增強轉基因植物的耐旱性[13]。綜上可知,NAC轉錄因子在植物抵抗干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。在植物響應干旱脅迫的過程中起著重要的調(diào)控作用。

中國沙棘(Hippophaerhamnoides)是胡頹子科沙棘屬的一種旱生且耐低溫的落葉灌木[14],又名沙棘、醋柳、黑刺等。沙棘雌雄異株,是典型的風媒授粉樹種。沙棘根系發(fā)達,萌蘗能力強,根系能與放線菌形成根瘤共生體,具有很強的固氮能力[15],且中國沙棘抗旱抗寒性強,是理想的改良生態(tài)環(huán)境的人工林造林樹種;此外,沙棘作為一種藥食同源植物,含有豐富的營養(yǎng)物質和生物活性成分,在沙棘屬植物的葉子和果實等器官中,含有上百種生物活性物質,富含維生素類、胡蘿卜素類、黃酮類、甾醇類、氨基酸類、脂肪酸類等多類天然化合物約12類近300種[16]。目前,國內(nèi)對沙棘營養(yǎng)成分的研究很多,據(jù)測定,沙棘原汁的維生素C含量是西紅柿的95.4倍,黃瓜的78.8倍,蘋果的105.5倍[17]。吳帥[18]以10個中國沙棘種源1 a生幼苗為研究對象,從生長特性、生理生化特征和形態(tài)解剖結構等方面研究種源的耐旱性,并采用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對不同種源進行抗旱性綜合評價;馬玉花等[19]以青海中國沙棘盆栽苗為材料,研究不同程度干旱脅迫處理對葉片生理指標以及保護酶活性的影響;Zhang等[20]對不同濃度CO2處理的兩個沙棘品種進行轉錄分析,在沙棘對CO2濃度升高的反應中發(fā)現(xiàn)4 740個差異表達基因,兩個沙棘品種的轉錄因子WRKY、MYB和NAC的表達水平有顯著差異;Ye等[10]基于RNA-seq技術,對干旱脅迫下沙棘的轉錄組進行分析顯示,在沙棘中有4 438個轉錄因子,并且有100個基因在脅迫組和對照組差異表達。本試驗選擇干旱脅迫下中國沙棘差異表達的8個HrNAC基因,分析其核苷酸序列特征、編碼蛋白氨基酸數(shù)量及分子質量、等電點等理化性質,預測蛋白的親水性、亞細胞定位。此外,通過實時熒光定量PCR研究上述8個基因在干旱脅迫下的時空表達模式,從而探究沙棘HrNAC轉錄因子在響應干旱脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料采用青海省湟源縣野生沙棘(Hippophaerhamnoides)種子,采種后去漿、晾曬、除雜、消毒并播于直徑35 cm的塑料花盆中(每盆均勻撒播30粒種子),盆土用育苗基質、蛭石、珍珠巖、壤土混合配制,播種后在花盆上覆膜,以維持土壤溫度和濕度,提高沙棘種子的發(fā)芽率,待苗木發(fā)芽后去掉塑料膜,幼苗長至3～5 cm時間苗,撫育期每4 d澆1次水,15 d施1次hoagland營養(yǎng)液。

1.2 試驗方法

1.2.1 NAC轉錄因子的選擇及熒光定量引物的設計與合成 通過干旱脅迫下沙棘轉錄組測序結果[10],對比干旱脅迫下沙棘中177個NAC轉錄因子的表達差異性,篩選其中差異表達的8個基因,設計熒光定量引物,基因ID及引物序列見表1。

表1 沙棘NAC家族基因及內(nèi)參定量引物Table 1 Quantitative primers of seabuckthorn NAC family and reference genes

1.2.2 脅迫處理及樣本采集 沙棘幼苗長至 20～30 cm開始進行干旱脅迫處理。選取生長健壯、長勢一致的沙棘幼苗,分為對照組(CK)6盆和脅迫組(XP)30盆。對照組正常澆水,脅迫組停止?jié)菜?。在?天(CK)、第4天(XP1)、第10天(XP2)、第19天(XP3)、第27天(XP4)的8:00-10:00分別采集對照組和脅迫組沙棘的根、莖、葉樣本,沙棘盆栽苗在干旱脅迫第10天葉片出現(xiàn)輕度萎蔫,干旱脅迫第27天出現(xiàn)重度萎蔫,葉片發(fā)黃,葉緣失水變干。持續(xù)干旱脅迫直至沙棘苗萎蔫后(干旱脅迫第28天)早晨復水,并在復水后48 h采樣(FS);每次采樣同一個處理梯度至少采集3盆重復樣本,所有樣品放置于-80 ℃冰箱中保存,備用。

1.2.3 沙棘NAC家族基因的生物信息學分析 使用DNASTAR軟件進行沙棘HrNAC家族轉錄因子的分子質量、等電點、核苷酸序列和蛋白質親水性分析;使用在線預測軟件(https://psort.hgc.jp/form2.html)預測NAC蛋白的亞細胞定位。

1.2.5 實時熒光定量PCR擴增 以沙棘各個樣本的cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR擴增,擴增體系均為 20 μL: 上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、 cDNA 2 μL、RNase-free Water 6.8 μL、SYBR Premix(TAKARA) 10 μL;擴增程序為:95 ℃ 50 s, 60 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

HrNAC轉錄因子的相對熒光定量分析方法為2-ΔΔCt法,采用Excel 2021、SPSS 22對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 NAC轉錄因子的序列分析

利用DNASTAR軟件分析8個沙棘HrNAC轉錄因子的核苷酸和氨基酸序列,圖1是HrNAC1的核苷酸序列及對應的氨基酸序列,分析統(tǒng)計結果見表2,8個HrNAC轉錄因子的核苷酸序列中A+T的含量均大于C+G的含量。長度最長的HrNAC蛋白(HrNAC6編碼)361個氨基酸,最短的蛋白(HrNAC3編碼)103個氨基酸;其等電點為4.910(HrNAC6編碼)～ 9.264(HrNAC1編碼);此外,8個NAC轉錄因子蛋白的亞細胞定位于細胞核、細胞質、線粒體上,HrNAC3轉錄因子蛋白還定位于內(nèi)質網(wǎng)中。

圖1 HrNAC1的核苷酸和氨基酸序列比對圖Fig.1 Comparison of nucleotide and amino acid sequences of HrNAC1

表2 沙棘HrNAC基因的生物學信息Table 2 Related information of sea buckthorn HrNAC gene

2.2 NAC轉錄因子蛋白親水性分析

通過DNASTAR軟件預測分析沙棘HrNAC蛋白的親水性,由圖2可見,8個HrNAC蛋白都呈現(xiàn)出疏水區(qū)域較少,連續(xù)分布多個親水區(qū)域的特點,整體屬于穩(wěn)定親水蛋白,該性質符合胞內(nèi)蛋白的代謝環(huán)境。

圖2 HrNAC家族蛋白親水性Fig.2 Hydrophilicity of HrNAC family proteins

2.3 沙棘不同組織總RNA濃度

測定結果表明,中國沙棘各組織總RNA的質量濃度均大于100 ng/μL,且OD260/OD280值為1.8～2.2,為了進一步驗證中國沙棘各組織總RNA的質量,對提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳。由圖3可見,3個組織的RNA凝膠電泳圖中 28 S、18 S、5 S條帶清晰,無明顯拖尾現(xiàn)象,且28 S與18 S電泳條帶的亮度約為2∶1,說明提取的沙棘總RNA完整性良好、無降解,可用于后續(xù)熒光定量PCR擴增試驗。

M為DL 2000 DNA Marker條帶,1～21為部分中國沙棘總RNA電泳圖

2.4 干旱脅迫下NAC轉錄因子的時空表達模式

2.4.1 在根中的表達模式 為了研究干旱脅迫下,沙棘根、莖、葉中的NAC轉錄因子表達模式,對不同脅迫程度下沙棘根、莖、葉樣本進行實時熒光定量PCR擴增,結果見圖4。8個HrNAC轉錄因子中,7個均顯示差異表達,HrNAC1在根中未表達。干旱脅迫下,沙棘根中的7個HrNAC轉錄因子的相對表達量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,不同的基因在不同的干旱脅迫下達到最大值,其中HrNAC5在脅迫第4天(XP1)時相對表達量達到峰值;HrNAC1、HrNAC2、HrNAC3、HrNAC4、HrNAC7、HrNAC8在脅迫第19天相對表達量最大;HrNAC6在脅迫第27天相對表達量達到最大值,此外,8個HrNAC轉錄因子復水后的相對表達量均急劇下降。

2.4.2 在莖中的表達模式 在沙棘莖中,8個HrNAC轉錄因子均差異表達。干旱脅迫下,沙棘莖中的8個HrNAC轉錄因子中,6個HrNAC轉錄因子(HrNAC2、HrNAC3、HrNAC4、HrNAC6、HrNAC7、HrNAC8)的相對表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,HrNAC5的表達下調(diào);HrNAC1、HrNAC2、HrNAC3、HrNAC4、HrNAC6、HrNAC8在脅迫第19天(XP3)時相對表達量達到峰值;HrNAC7在脅迫第27天(XP4)達到峰值;此外,8個HrNAC轉錄因子復水后的相對表達量均急劇下降。

2.4.3 在葉中的表達模式 在沙棘葉中,8個HrNAC轉錄因子均差異表達。干旱脅迫下,大部分HrNAC家族轉錄因子呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在脅迫初期(XP1),HrNAC1、HrNAC5的相對表達量出現(xiàn)小幅下降趨勢,但隨著干旱脅迫的進一步加深,其表達量逐漸上升且高于CK。HrNAC7和HrNAC8的變化極為相似,均表現(xiàn)出緩慢上升-大幅上升(XP4)-快速下降(FS)的趨勢,可能存在兩個轉錄因子互作調(diào)控。HrNAC2在XP3達到峰值,其余7個轉錄因子均在重度干旱脅迫(脅迫第27天)達到最大值,且8個轉錄因子復水后相對表達量均快速降低。

3 討 論

沙棘是西北地區(qū)重要的造林樹種,生長適應性極強,尤其在高海拔等生境惡劣地區(qū)。本研究以沙棘實生苗為材料進行結構預測,結果表明:沙棘HrNAC家族轉錄因子大部分位于細胞核、細胞質、線粒體上,轉錄的主要場所在細胞核,這與NAC轉錄因子控制脅迫應答相關基因表達的功能一致,同時表明沙棘HrNAC轉錄因子可能控制某些蛋白質的加工和修飾。8個HrNAC轉錄因子均屬于穩(wěn)定的親水性蛋白,這與蕎麥、蘋果和冰草中NAC轉錄因子的親水性結果一致[21]。

NAC轉錄因子是植物異性轉錄調(diào)控因子的最大家族之一[22],首次報道的NAC基因(NAM)與牽?；?Pharbitisnil)頂端分生組織和原基的形成有關[23]。有研究[24]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下大豆中有22種NAC轉錄因子受干旱脅迫誘導差異表達;番茄的NAC轉錄因子JUB1(SlJUB1)在干旱等多種非生物脅迫下表達增強,基因沉默抑制SlJUB1的表達顯著降低了耐旱性,并且各種抗旱相關基因表達減少[25];擬南芥中的基因表達分析表明,SlNAC8由干旱脅迫誘導表達,過表達SlNAC8的擬南芥對干旱耐受性增強[26];干旱脅迫下,剛毛檉柳過表達ThNAC24基因會導致POD(過氧化物酶)和SOD(超氧化物歧化酶)的活性增強,減緩細胞損傷或死亡,提高剛毛檉柳的抗旱能力[27]。由此可見NAC轉錄因子受干旱脅迫誘導表達,且與植物抗旱性密切相關。NAC轉錄因子受上游轉錄因子,如DREBs(脫水反應元件結合蛋白質)、ABREs(ABA反應元件結合蛋白)的調(diào)控,DRE/CAT是ABA獨立通道信號傳導的順式作用元件,ABRE是依賴ABA信號傳導的順式作用元件[28]。由此可見,NAC轉錄因子即參與ABA獨立通道的脅迫響應調(diào)控,也參與ABA依賴通道的脅迫響應過程。在ABA依賴途徑中,NAC受ABA累積的刺激,干旱脅迫會造成ABA的累積,激活下游相關的脅迫應答基因;在ABA獨立通道中,NAC接收干旱脅迫信號刺激后可直接激活干旱脅迫應答基因啟動子,從而激活脅迫應答基因的表達[11]。

沙棘作為中國西北地區(qū)的一種先鋒樹種,具有抗旱、耐寒等優(yōu)良的遺傳特性,是干旱區(qū)、山地等自然環(huán)境惡劣區(qū)域較為理想的人工造林樹種[29],具有很大的生態(tài)效益和經(jīng)濟價值,在基因資源開發(fā)上有極大的潛力。本研究在轉錄組測序基礎上篩選出8個顯著差異表達的沙棘HrNAC轉錄因子進行干旱脅迫下的表達模式研究,結果顯示其中7個具有根特異性表達,8個具有莖和葉片特異性表達。在干旱脅迫過程中,沙棘的葉片最為敏感,干旱脅迫對葉片的正常生長影響最大,脅迫下葉片通過減少蒸騰失水和增強吸水來維持組織的正常生命活動,因此,在本研究中,重度干旱脅迫時(XP4),沙棘HrNAC轉錄因子的相對表達量大幅上升,從而可能激活下游的干旱脅迫應答基因,以增強植物在干旱脅迫下的成活率。植物遭遇干旱脅迫時主要通過增強根部吸水來維持細胞內(nèi)外水勢平衡,當處于輕度脅迫時,沙棘根部HrNAC基因的表達量顯著上升,可能激活根部脅迫應答基因的表達,提高根毛吸水能力,當處于重度缺水時,土壤中的自由水含量極低,沙棘根系吸水很困難,即將永久萎焉時,HrNAC的表達逐漸下降,可能是沙棘根部的HrNAC累積導致的負反饋調(diào)節(jié)[30]。在莖中,HrNAC的相對表達量較少,植物莖中的維管系統(tǒng)將根系吸收的水分和養(yǎng)分輸送到葉片來維持沙棘的水分平衡,HrNAC的表達會激活傳輸過程中維持細胞水分和滲透平衡相關基因(如AQP、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等)的表達,以保持葉片中水分和養(yǎng)分的有效供給。復水后,3個組織的NAC基因相對表達量都迅速下降,這是由于復水后沙棘根系快速吸水,恢復胞內(nèi)水勢平衡,反饋抑制NAC基因的表達。在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下沙棘的葉片相對含水量、葉綠素含量以及脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律,同時P5CS和ProDH基因的表達模式也很好地解釋了脯氨酸含量為何會呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢[31];此外,干旱脅迫也誘導AQP基因表達量的上調(diào)[32],但是這些生理指標的變化與NAC轉錄因子之間存在著什么樣的關系以及其下游的調(diào)控基因還需要進一步探索驗證。綜上可知,NAC轉錄因子是沙棘抗旱的重要調(diào)控基因。

植物NAC轉錄因子通過結合響應干旱脅迫的關鍵轉錄因子的順式作用元件、增加植物保護酶等方面增強植物的抗旱性,在后期的試驗中,通過這些抗旱相關基因(如:BADH、AQP、CMO、SOD、POD等)的表達來進一步探究NAC轉錄因子調(diào)控干旱脅迫響應的復雜網(wǎng)絡機制,同時也可以通過酵母雜交技術,篩選NAC轉錄因子上下游的基因,以及特異識別序列,來驗證沙棘中的HrNAC轉錄因子參與植物抗旱的調(diào)控網(wǎng)絡。

4 結 論

本研究通過軟件預測表明沙棘HrNAC家族轉錄因子大部分位于細胞核、細胞質、線粒體上;8個HrNAC轉錄因子均屬于穩(wěn)定的親水性蛋白;熒光定量PCR分析結果表明,干旱脅迫誘導沙棘HrNAC轉錄因子的差異表達,且呈現(xiàn)出組織特異性,此外,隨著干旱脅迫程度的加深,大部分沙棘HrNAC基因的相對表達量都逐漸升高,復水后急劇下降,說明干旱脅迫下HrNAC轉錄因子通過表達量的升高激活抗旱相關基因的表達,從而提高沙棘的抗旱性。