張崢，孫雨晨，范闊海，孫娜，孫盼盼，孫耀貴，李宏全，尹偉*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，山西 晉中 030801）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引起的一種以呼吸道癥狀和高死亡率為特征的動(dòng)物病毒性傳染病，對(duì)世界范圍的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。山西省2016 年9 月-2019 年1 月流行病學(xué)調(diào)查顯示已免疫PRRS 滅活疫苗的8 個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的6518份血清的PRRSV 抗體檢測(cè)結(jié)果中，陽性率為82.62%，說明山西省PRRS 總體免疫效果并不理想，存在PRRSV 的反復(fù)感染［2］。PRRSV 疫苗無法對(duì)高遺傳多樣性的毒株提供完全的保護(hù)，PRRS 仍是持續(xù)威脅我省乃至全國養(yǎng)豬業(yè)的重要豬病毒性疾病之一［3-6］。

豬感染PRRSV 后以出現(xiàn)免疫抑制為特點(diǎn)，常與其他豬病混合感染或者繼發(fā)感染，給養(yǎng)殖戶造成較大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也給豬病的治療增加了難度。疫苗免疫仍是預(yù)防PRRS 的最重要措施之一。用于預(yù)防PRRS 的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗，滅活疫苗的主要劣勢(shì)是免疫效果差，而弱毒疫苗免疫效果雖然優(yōu)于滅活疫苗，但其安全性差，存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)［7-8］。此外，由于PRRSV 變異快、易發(fā)生基因重組等原因，傳統(tǒng)的疫苗仍不能有效控制PRRSV的感染［9］。PRRSV 感染初期也會(huì)誘發(fā)機(jī)體很強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，一般于感染后7～9 d 可檢測(cè)到特異性抗體，但這些抗體對(duì)PRRSV 都沒有中和能力甚至能加強(qiáng)感染，而有效的中和抗體一般出現(xiàn)于28 d以后［10］。Yoon 等［11］學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PRRSV 感染早期產(chǎn)生的抗體不僅不能有效阻止病毒感染，反而導(dǎo)致PRRSV 在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增強(qiáng)，即PRRSV 的抗體依賴性增強(qiáng)（Antibody-dependent enhancement，ADE）現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低中和抗PRRSV 血清與病毒形成PRRSV-抗體復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步與借助宿主細(xì)胞PAMs 表面的Fc 受體（Fc receptor， FcR）與PAMs 結(jié)合，從而促進(jìn)病毒更容易進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)行有效復(fù)制并引起感染，病毒抗體在亞中和滴度水平增強(qiáng)了病毒感染［12］。

補(bǔ)體受體廣泛分布于紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表面，能夠與補(bǔ)體中的活性成分發(fā)生結(jié)合，是機(jī)體重要的先天免疫功能分子［13］，其中研究較多的是I 型補(bǔ)體受體，其可以結(jié)合補(bǔ)體C3 活化產(chǎn)生的片段C3b。外源性病原進(jìn)入血液后，血清補(bǔ)體被活化產(chǎn)生多種活性片段。其中，C3b 能夠結(jié)合在病原體表面使病原致敏，補(bǔ)體受體通過結(jié)合C3b 將致敏病原或其抗原抗體復(fù)合物發(fā)生免疫粘附，并進(jìn)一步促進(jìn)病毒［14-16］、細(xì)菌［17-18］和寄生蟲［19-20］的清除。但是，某些病原體也能利用補(bǔ)體受體來逃避識(shí)別和清除。Cardosa 等［21］研究證實(shí)補(bǔ)體受體-3（Complement receptor 3， CR3）可以介導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞中西尼羅河病毒（West nile virus， WNV）的補(bǔ)體依賴性感染增強(qiáng)。人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）也被證實(shí)能夠通過補(bǔ)體受體進(jìn)行補(bǔ)體介導(dǎo)的抗體依賴性感染增強(qiáng)［22］。研究發(fā)現(xiàn)，利什曼原蟲（Leishmania spp.）同樣能夠以CR3 介導(dǎo)的方式進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞并生存下來，并且由CR3 介導(dǎo)的信號(hào)可以降低巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素12（Interleukin-12， IL-12）的產(chǎn)生［23］。本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophages， PAMs）膜表面存在豬I 型補(bǔ)體受體（Porcine complement receptor 1-like， CR1-like）基因，在FcR、CR1-like 共同介導(dǎo)下，PAMs能夠移除豬紅細(xì)胞免疫粘附的免疫復(fù)合物［24-25］。且豬紅細(xì)胞類Ⅰ型補(bǔ)體受體（Erythrocyte complement receptor type 1-like， ECR1-like）通過其免疫粘附功能促進(jìn)了PAMs 對(duì)致敏基因工程菌（GFP-Escherichia coli，GFP-E. coli）的捕獲［26］。然而，機(jī)體針對(duì)PRRSV的免疫應(yīng)答中，PAMs 免疫粘附受體CR1-like 的功能尚不明確。因此，本研究通過對(duì)PAMs 捕獲病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行分析，深入探究豬新鮮血清和CR1-like對(duì)PRRSV 感染PAMs的影響，以期為CR1-like在PRRSV 免疫應(yīng)答中的生物學(xué)功能研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

30 日齡臨床健康斷奶長(zhǎng)白仔豬（PRRSV 抗體檢測(cè)為陰性），購自太谷區(qū)吳家堡養(yǎng)豬場(chǎng)；TCID50為10-5.55的PRRSV 分離株（JS-1 株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院饋贈(zèng)），本實(shí)驗(yàn)室凍存。鼠抗豬CR1-like 單克隆 抗 體 由 本 實(shí) 驗(yàn) 室 自 制 ，專 利 號(hào) ：ZL201410308534.0，CD16、CD64、CD32 單克隆抗體均購自賽默飛有限公司，TRIzol 和Primer-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，PRRSV 抗體檢測(cè)試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司，2×SYBR Green Low ROX qRT-PCR Master Mix 購自上海Bimake 有限公司，豬補(bǔ)體片段3b（C3b）、豬補(bǔ)體片段4b（C4b）ELISA 試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司，豬血清總補(bǔ)體（CH50）ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

本研究中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及涉及的試驗(yàn)方法已獲得山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：SXAU-ASVM-16019）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗PRRSV 血清制備及中和抗體效價(jià)檢測(cè)

（1） 豬新鮮血清和抗PRRSV 血清的制備

豬新鮮血清制備：長(zhǎng)白仔豬前腔靜脈采血2000 r·min-1離心5 min，收集血清，備用。抗PRRSV 血清制備：于豬耳后部肌肉注射1 mL 高致病性藍(lán)耳病弱毒活疫苗，接種后20～28 d 前腔靜脈采血，2000 r·min-1離心5 min，取上清備用。

（2） 抗PRRSV 血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定

PAMs的分離與原代培養(yǎng)等操作參照課題組前期的試驗(yàn)方法進(jìn)行，采用固定病毒稀釋血清法測(cè)定中和抗體效價(jià)［27-28］?？筆RRSV 血清800 μL 于56 ℃水浴中作用30 min，3000 r·min-1離心5 min 離心去除雜質(zhì)，倍比稀釋抗PRRSV 血清，稀釋度依次為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。取各稀釋度抗PRRSV 血清與病毒混合懸液100 μL，37 ℃水浴1 h，作為待檢血清組，依次接種于96 孔板中。取濃度為200 TCID50/100 μL 的PRRSV 懸液接種孔板中，作為病毒對(duì)照組。取抗PRRSV 血清400 μL，以400 μL 培養(yǎng)基進(jìn)行1∶2 稀釋。將1∶2 稀釋的抗PRRSV 血清接種孔板中，作為抗PRRSV 血清毒性對(duì)照組。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察病變，根據(jù)Reed-Muench 公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 抗PRRSV 血清影響PRRSV 感染PAMs的檢測(cè)

根據(jù)上述測(cè)定的中和效價(jià)結(jié)果，將抗PRRSV血清稀釋為1∶2、1∶5.37、1∶10、1∶20、1∶40 等5 個(gè)梯度。將PAMs 接種于6 孔板中，培養(yǎng)12 h，PRRSV懸液1000 倍稀釋后進(jìn)行接種，每孔50 μL。感染9 h后，將5 個(gè)稀釋度的抗血清依次加入，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于12、24、36 和48 h 收集細(xì)胞樣品。使用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，以合成的cDNA 為模板，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定各組PRRSVN基因拷貝數(shù)。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列及PCR 產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences and the size of PCR products

1.2.3 豬新鮮血清影響PRRSV 感染 PAMs的檢測(cè)

（1） 豬新鮮血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 總活性ELISA 測(cè)定

采集豬新鮮血清置于金屬浴56 ℃，30 min 作滅活處理。將PAMs 復(fù)蘇至6 孔板中，每孔加入PRRSV 懸液50 μL 感染9 h。各孔加入1∶20 稀釋抗血清220 μL 和豬新鮮血清128.7 μL，分別于0、1、3、

5、36、72 h 收集各孔培養(yǎng)上清40 μL，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清中各指標(biāo)活性。

主要步驟如下：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品加樣50 μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10μL。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育1 h。靜置30 s 棄去，洗滌液洗5 次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，混勻，37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度。

（2） qRT-PCR 檢測(cè)PRRSV N 基因拷貝數(shù)

試驗(yàn)分為6 組，分別記為A、B、C、D、E、F 組，各組處理如下：

A 組，PAMs 接種6 孔板中，PRRSV 懸液50 μL感染9 h 后，加入1∶20 稀釋抗血清220 μL 和豬新鮮血清128.7 μL，豬新鮮血清初濃度為5%［23］，間隔3 h重復(fù)加入豬新鮮血清128.7 μL；B 組中以PBS 代替1∶20 稀釋抗血清，C 組中以滅活血清代替豬新鮮血清，D 組中以PBS 代替豬新鮮血清，E 組中僅加入1∶20 稀釋抗血清，F(xiàn) 組中僅加入PBS，B～F 組其余操作同A 組，各組處理見表2所示。

表2 試驗(yàn)分組及處理Table 2 Experimental groups and treatments

本試驗(yàn)中以加入抗PRRSV 血清和豬新鮮血清3 h 后開始計(jì)算時(shí)間，分別于0、12、24、36、48、60、72 h 后收集各組細(xì)胞樣品與細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別提取胞內(nèi)和上清中的RNA，以qRT-PCR 檢測(cè)胞內(nèi)與上清中PRRSV 的拷貝數(shù)。

1.2.4 CR1-like 影響PRRSV 感染PAMs 的檢測(cè)

試驗(yàn)分為6 組，分別記為a、b、c、d、e、f 組，各組處理見表3。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及組別Table 3 Experimental design and groups

其中，CD16、CD32、CD64 單抗（終濃度均為1∶1000），CR1-like 單抗（終濃度1∶50）處理需37 ℃孵育2 h，接種PRRSV 懸液，添加各類血清操作方法同1.2.3 中（2）。以加入抗PRRSV 血清和豬新鮮血清3 h 后開始計(jì)算時(shí)間，分別于0、12、24、36、48、60、72 h 后收集a 組～f 組細(xì)胞樣品，提取樣品中RNA，qRT-PCR 檢測(cè)PAMs中病毒的拷貝數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以Mean±SD 表示，運(yùn)用Graph-Pad PrismTM 8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA、Two-way ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 表示有顯著差異性，P＜0.01表示有極顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗PRRSV 血清中和抗體效價(jià)在PAMs 上的檢測(cè)

將倍比稀釋的抗PRRSV 血清與PRRSV 的混合液作用于PAMs 48 h 后每組細(xì)胞病變情況記錄如表4所示，按公式計(jì)算得出抗PRRSV 血清中和抗體效價(jià)為1∶5.37。

表4 抗PRRSV 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of neutralizing antibody titer in anti-PRRSV serum

2.2 抗PRRSV 血清對(duì)PRRSV 感染PAMs 的影響

分別于12、24、36、48 h 時(shí)間點(diǎn)收集單獨(dú)PRRSV 組、1∶2 稀釋度抗血清組、1∶5.37 稀釋抗血清組、1∶10 稀釋度抗血清組、1∶20 稀釋度抗血清組和1∶40 稀釋度抗血清組的細(xì)胞樣品，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)PRRSVN基因拷貝數(shù)，檢測(cè)結(jié)果顯示：各時(shí)間點(diǎn)下，不同倍比稀釋的抗PRRSV 血清組分別與單獨(dú)PRRSV 組相比，1∶5.37 稀釋度的抗血清組PRRSV 拷貝數(shù)顯著低于PRRSV 組（P＜0.01），表明1∶5.37 稀釋度的抗血清能夠明顯抑制病毒復(fù)制；12 h 與48 h 時(shí)，1∶20 稀釋度的抗血清組與單獨(dú)病毒組相比，其基因拷貝數(shù)高于單獨(dú)病毒組，差異極顯著（P＜0.01）；1∶20 稀釋度的抗血清組與1∶2、1∶10、1∶40 稀釋度的抗PRRSV 血清組相比，其病毒拷貝數(shù)高于各組，差異極顯著（P＜0.01）。根據(jù)上述結(jié)果并結(jié)合時(shí)間動(dòng)態(tài)趨勢(shì)，1∶20 稀釋度的抗血清對(duì)PRRSV 感染PAMs 的促進(jìn)作用明顯，因此選擇1∶20 稀釋度的抗PRRSV 血清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（圖1）。

圖1 不同稀釋度抗PRRSV 血清對(duì)PRRSV 感染PAMs 的影響Fig.1 Effects of different dilutions of anti-PRRSV serum on PRRSV infection in PAMs

2.3 ELISA 檢測(cè)豬新鮮血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 總活性變化

按照方法1.2.3 中（1）將PRRSV 懸液感染PAMs 9 h 后加入豬新鮮血清128.7 μL，由圖2 可見，豬新鮮血清C3b、C4b 和CH50 濃度隨PRRSV感染時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)。根據(jù)各血清補(bǔ)體活性片段濃度的變化，本試驗(yàn)確定每3 h 補(bǔ)充豬新鮮血清128.7 μL。

圖2 PRRSV 對(duì)豬新鮮血清C3b 活性、C4b 活性、CH50 總活性的影響Fig.2 Effects of PRRSV on the activity of C3b， C4b， and total CH50 of fresh porcine serum

2.4 豬新鮮血清對(duì)PRRSV 增殖的影響

胞內(nèi)樣品經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)PRRSVN基因拷貝數(shù)，如圖3A 所示，經(jīng)抗血清、新鮮血清處理后，除PRRSV 感染PAMs 12、24 h 時(shí)，A 組和B 組PRRSV 拷貝數(shù)均極顯著高于F 組（P＜0.01）；C組、D 組和E 組在0、36、48、60、72 h 時(shí)，病毒拷貝數(shù)均低于A 組、B 組，差異極顯著（P＜0.01），由此表明豬新鮮血清促進(jìn)了PRRSV 的胞內(nèi)增殖。

圖3 豬新鮮血清對(duì)PRRSV 增殖的影響Fig.3 Effects of fresh porcine serum on PRRSV proliferation

上清樣品經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)PRRSVN基因拷貝數(shù)，結(jié)果顯示：在12、48、60 h 時(shí)，加有新鮮血清的B 組其病毒拷貝數(shù)均高于F 組，差異性極顯著（P＜0.01）；24、48 h 時(shí)，加有新鮮血清的A 組其病毒拷貝數(shù)均高于F 組，差異極顯著（P＜0.01）。12、24、48、60 h 時(shí)無新鮮血清的C、D、E 組病毒拷貝數(shù)均低于A、B 組，差異極顯著（P＜0.01）；結(jié)合上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明經(jīng)新鮮血清處理后，上清液中PRRSV 拷貝數(shù)水平呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)（圖3B）。

將細(xì)胞內(nèi)、培養(yǎng)上清的PRRSVN基因拷貝數(shù)作總和處理，結(jié)果顯示：在0、36、48、60 h 時(shí)，加有新鮮血清的A、B 組其病毒拷貝數(shù)均高于F 組，差異極顯著（P＜0.01）；12、72 h 時(shí)，B 組病毒拷貝數(shù)高于F組，差異極顯著（P＜0.01）；24 h時(shí)，A 組病毒拷貝數(shù)高于F 組，差異極顯著（P＜0.01）；經(jīng)抗血清、新鮮血清處理后，除PRRSV 感染PAMs 12 、24 h 時(shí)，A組和B 組PRRSV 拷貝數(shù)均極顯著高于F 組（P＜0.01）；C 組、D 組和E 組在動(dòng)態(tài)時(shí)間點(diǎn)中，平均拷貝數(shù)均極顯著低于A 組、B 組（P＜0.01）。結(jié)合上述結(jié)果，表明經(jīng)豬新鮮血清處理，PRRSV 的增殖水平升高（圖3C）。

2.5 免疫粘附受體CR1-like 促進(jìn)PRRSV 感染PAMs

胞內(nèi)樣品經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)PRRSVN基因拷貝數(shù)，結(jié)果顯示（圖4）：在0、12、36、72 h 時(shí)，經(jīng)抗PRRSV 血清處理后的d 組其病毒拷貝數(shù)高于f 組，36 h 差異顯著（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)差異極顯著（P＜0.01）；在0、12、24、72 h 時(shí)，經(jīng)CR1-like 單抗、FcR 單抗處理的e 組其拷貝數(shù)低于d 組，其中12、24 h 差異極顯著（P＜0.01），0、72 h 差異顯著（P＜0.05）；在0、12、60 h 時(shí)，e 組拷貝數(shù)低于僅以FcR 單抗處理的a 組，差異極顯著（P＜0.01）；0、12、48 h時(shí)，a 組其病毒拷貝數(shù)高于f 組，差異極顯著（P＜0.01），24、36、60、72 h 時(shí)，a 組病毒拷貝數(shù)顯著低于f組（P＜0.05）；0、36、48 h 時(shí)，僅以CR1-like 單抗處理的b 組其病毒拷貝數(shù)高于f組，其中36 h 差異顯著（P＜0.05），0、48 h差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 CR1-like 免疫粘附功能對(duì)PRRSV 增殖的影響Fig.4 Effects of CR1-like immune adhesion function on PRRSV proliferation

3 討論

本研究選擇PRRSV 抗體檢測(cè)為陰性的30 日健康齡斷奶長(zhǎng)白仔豬為試驗(yàn)對(duì)象，通過疫苗免疫獲得抗PRRSV 血清。為了最大程度地模擬臨床PRRSV 感染的實(shí)際情況，試驗(yàn)中先以病毒感染PAMs再加入抗血清的模式設(shè)計(jì)試驗(yàn)。試驗(yàn)首先對(duì)所收集的抗血清中和效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，并通過倍比稀釋試驗(yàn)確定了亞中和抗體滴度（1∶20 稀釋度抗血清），以保證試驗(yàn)檢測(cè)的科學(xué)性。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)將抗PRRSV 血清進(jìn)行5 個(gè)梯度稀釋，分別為1∶2、1∶5、1∶10、1∶20 和1∶40，通過qRT-PCR 檢測(cè)12、24、36、48 h 的PRRSVN基因拷貝數(shù)變化分析亞中和抗體滴度對(duì)PRRSV-ADE 效應(yīng)的影響。從結(jié)果來看，體外條件下1∶20 稀釋度抗血清組的病毒拷貝數(shù)高于其它組，即該滴度下抗體與PRRSV 形成的抗原抗體復(fù)合物明顯促進(jìn)了PRRSV 胞內(nèi)增殖；此外，除了其它亞中和滴度的抗血清也表現(xiàn)出了PRRSV-ADE 效應(yīng)，這與已知的FcR 介導(dǎo)PRRSV 感染增強(qiáng)結(jié)果相一致［29-30］。上述結(jié)果說明本試驗(yàn)所建立的研究體系表現(xiàn)出了PRRSV-ADE現(xiàn)象，符合后續(xù)試驗(yàn)研究的要求。

CR1-like 是補(bǔ)體活性成分C3b 的受體，兩者的結(jié)合是CR1-like 功能發(fā)揮的分子基礎(chǔ)［31］，因此在討論CR1-like 是否為ADE 介導(dǎo)因素時(shí)，首先應(yīng)考慮豬新鮮血清對(duì)PRRSV-ADE 效應(yīng)的影響。本試驗(yàn)以豬新鮮血清為C3b 來源，但是鑒于體外條件下豬新鮮血清中C3b 消耗對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，所以首先對(duì)豬血清活性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了檢測(cè)，以確定試驗(yàn)體系中新鮮血清補(bǔ)充的時(shí)間點(diǎn)（3 h）及劑量（128.7 μL），以保證試驗(yàn)的精確性。PRRSV 體內(nèi)感染可以局限于某些組織，易感巨噬細(xì)胞沒有以較高的速度死亡，那么感染細(xì)胞的數(shù)量就會(huì)穩(wěn)步下降，最終免疫反應(yīng)能夠清除感染。為保證體外感染條件更接近于體內(nèi)感染狀態(tài)，本試驗(yàn)選擇PRRSV 感染PAMs 9 h 后，同時(shí)加入1∶20 倍稀釋抗PRRSV 血清和豬新鮮血清進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)，qRT-PCR 檢測(cè)0、12、36、48、60 和72 h PRRSVN基因拷貝數(shù)變化。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，0～72 h 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)期間，加入豬新鮮血清后，PRRSV 增殖表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)；而加入滅活血清或PBS 后，PRRSV 增殖的促進(jìn)作用表現(xiàn)得并不明顯。相比同行研究結(jié)果，本試驗(yàn)結(jié)果表明豬新鮮血清、1∶20 稀釋度抗PRRSV 血清的存在對(duì)PRRSV 的增殖具有協(xié)同促進(jìn)的作用。

在確定豬新鮮血清能夠促進(jìn)PRRSV 增殖的基礎(chǔ)上，圍繞“CR1-like 活性對(duì)PRRSV-ADE 效應(yīng)的影響”這一問題進(jìn)行試驗(yàn)。通過CR1-like McAb、FcR McAb（CD64、CD32、CD16）分別實(shí)現(xiàn)PAMs表面CR1-like、FcR 阻斷以及兩者的共阻斷，經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)PAMs 胞內(nèi)PRRSVN基因拷貝數(shù)的變化來定量分析PAMs 表面免疫粘附受體CR1-like 對(duì)PRRSV 感染的影響。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，PAMs 表面CR1-like、FcR 未被單抗阻斷時(shí)（d 組），PRRSV 胞內(nèi)增殖水平顯著高于單獨(dú)病毒感染對(duì)照組，且PRRSVN基因拷貝高峰出現(xiàn)時(shí)間早于對(duì)照組（f組），與前文結(jié)果趨勢(shì)一致；同時(shí)阻斷CR1-like、FcR 兩類受體的活性后（e 組），PRRSV 胞內(nèi)增殖水平降低，由此可推測(cè)FcR 活性、CR1-like 活性均與PRRSV 胞內(nèi)增殖有關(guān)。前期已有試驗(yàn)表明PRRSV 通過FcR 途徑促進(jìn)病毒復(fù)制導(dǎo)致感染增強(qiáng)［32］，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。有研究表明，HIV、WNV、埃博拉病毒（Ebola virus， EBOV）、登革熱病毒（Dengue virus， DENV）等病毒的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)亦具有ADE 特點(diǎn)，且病毒ADE 介導(dǎo)途徑除了FcR介導(dǎo)外，還能通過補(bǔ)體受體途徑介導(dǎo)［33-34］。然而PRRSV 能否通過補(bǔ)體受體途徑促進(jìn)病毒增殖未有報(bào)道。為此，本試驗(yàn)先將FcR 阻斷，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)封閉FcR 且保留CR1-like 活性時(shí)，PRRSVN基因增殖水平呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。然后再將CR1-like 以單抗封閉僅保留FcR 活性時(shí)，PRRSVN基因增殖水平也呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，即CR1-like、FcR 的活性均與PRRSV-ADE 效應(yīng)具有相關(guān)性。本研究認(rèn)為，體系中加入抗PRRSV 血清后與PRRSV 形成抗原抗體復(fù)合物，豬新鮮血清在抗原抗體復(fù)合物的刺激下活化產(chǎn)生C3b 片段［35］，體系中抗原抗體復(fù)合物被C3b 致敏，PAMs 表面的CR1-like 通過C3b 與PRRSV 抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，從而促進(jìn)了PRRSV-ADE 效應(yīng)的產(chǎn)生；當(dāng)豬新鮮血清被滅活或PAMs 表面的CR1-like 被阻斷后，PRRSV 抗原抗體復(fù)合物無法與PAMs 表面的CR1-like 結(jié)合，從而降低了PRRSV-ADE 效應(yīng)，PRRSV 胞內(nèi)拷貝數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

此外，一方面由于試驗(yàn)材料抗PRRSV 血清量的有限性，因此本試驗(yàn)尚不能確定抗血清與豬新鮮血清對(duì)PRRSV 增殖的作用兩者之間的差別；第二，目前由于尚無商品化的豬補(bǔ)體成分缺省血清，因此具體是哪一類補(bǔ)體成分影響PRRSV 的增殖尚未鑒定；第三，補(bǔ)體活化過程是正向不可逆，試驗(yàn)體系中需要不斷加入豬新鮮血清以補(bǔ)充C3b，由此導(dǎo)致培養(yǎng)板需要反復(fù)移動(dòng)以及后期培養(yǎng)基體積過多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)存在不穩(wěn)定性，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果也可能造成影響。更重要的是，雖然本研究發(fā)現(xiàn)PAMs 表面的CR1-like 具有協(xié)同促進(jìn)PRRSV-ADE 效應(yīng)的生理作用，但是其具體的分子機(jī)理尚未明確，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究結(jié)果表明在體外條件下，亞中和水平的抗PRRSV 血清能與PRRSV 形成抗原抗體復(fù)合物。該復(fù)合物經(jīng)豬新鮮血清致敏，可與PAMs 膜表面的CR1-like 分子相互結(jié)合。在CR1-like 的介導(dǎo)下，PRRSV 抗原抗體復(fù)合物進(jìn)入PAMs胞內(nèi)并出現(xiàn)PRRSV 的增殖，表現(xiàn)出PRRSV-ADE效應(yīng)。本研究為進(jìn)一步闡明CR1-like在PRRSV 感染免疫應(yīng)答中的生物學(xué)功能提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，拓展了對(duì)PRRSV-ADE 效應(yīng)機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為臨床上PRRSV 持續(xù)性感染的有效防治提供了新的靶點(diǎn)策略。