付玉潔,于海龍

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院,山東 青島 266042)

基于預(yù)處理、酶水解等過(guò)程的糖平臺(tái)轉(zhuǎn)化技術(shù)可將農(nóng)林生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為各種燃料、化學(xué)品和材料,是我國(guó)能源發(fā)展戰(zhàn)略的重要內(nèi)容,對(duì)國(guó)家“鄉(xiāng)村振興”“碳中和”等重大戰(zhàn)略的成功實(shí)施有積極推動(dòng)作用[1-3]。然而,傳統(tǒng)纖維素酶水解反應(yīng)是在p H=4.8的酸性緩沖液體系中進(jìn)行的,這并不是酶發(fā)揮催化活性的最佳反應(yīng)溶劑,并且酶在緩沖體系中存在穩(wěn)定性低、易失活、難回收等問(wèn)題。尋找新型綠色溶劑體系改善酶的活性、穩(wěn)定性和可回收性,是突破農(nóng)林生物質(zhì)資源糖平臺(tái)轉(zhuǎn)化技術(shù)瓶頸,加速其工業(yè)化生產(chǎn)的根本舉措。

相比于傳統(tǒng)溶劑和離子液體,低共熔溶劑(DES)具有易制備、非揮發(fā)、低毒性、可再生、可設(shè)計(jì)、可生物降解、可循環(huán)使用等眾多優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是綠色和可持續(xù)工業(yè)中最有應(yīng)用潛力的新型溶劑[4-5]。DES酶促反應(yīng)技術(shù)是繼常規(guī)水溶液酶促反應(yīng)和有機(jī)相酶促反應(yīng)發(fā)展起來(lái)的新型酶促反應(yīng)技術(shù),具有生物相容性好、酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特性,有助于解決目前酶催化工業(yè)上因環(huán)境不匹配帶來(lái)的應(yīng)用瓶頸,為酶催化反應(yīng)提供一個(gè)真正合適的介質(zhì)環(huán)境[6-7]。研究表明,DES強(qiáng)大的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象,提高酶的催化活性和穩(wěn)定性[8-9],常見(jiàn)酶系如脂肪酶、蛋白酶和水解酶在DES中均表現(xiàn)出較好的反應(yīng)活性[10-12],在纖維素酶水解糖化方面具有巨大的應(yīng)用潛力,但相關(guān)技術(shù)亟需開(kāi)發(fā)。并且利用DES作為成相劑所構(gòu)建的DES雙水相體系有效地結(jié)合了DES和雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),在纖維素酶回收再利用方面擁有巨大潛力。因此設(shè)計(jì)DES水解體系,是解決酶水解效率低、穩(wěn)定性差和酶回收難的有效措施。

本工作制備了不同的氯化膽堿基低共熔溶劑,通過(guò)對(duì)DES體系下纖維素酶活性進(jìn)行測(cè)定,篩選出能夠增強(qiáng)纖維素酶活性的DES 體系,并構(gòu)建DES雙水相系統(tǒng)對(duì)纖維素酶進(jìn)行回收,并通過(guò)紫外光譜、熒光光譜、電導(dǎo)率儀和動(dòng)態(tài)激光散射儀揭示萃取機(jī)理。研究結(jié)果可為尋找改善酶的活性和可回收性的新型綠色溶劑體系提供重要的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

纖維素酶1.5L,青島吉寶生物科技有限公司;氯化膽堿(Ch Cl),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;聚乙二醇200(PEG200),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)G250,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水磷酸氫二鉀,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,DHG-9146A 型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;智能磁力攪拌器,ZNCL-TS型,鄭州予科儀器設(shè)備有限公司;電導(dǎo)率儀,DDS-307A 型,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 低共熔溶劑的制備

將甘油、乙二醇、聚乙二醇200、乳酸、草酸或冰乙酸與氯化膽堿按一定的物質(zhì)的量的比(2∶1、1∶1、1∶2、1∶3或1∶4)混合,在80℃下加熱并不斷攪拌,直至形成無(wú)色透明液體;并通過(guò)測(cè)定DES水溶液中纖維素酶活性篩選合適的溶劑。

1.3 DES體系下水解玉米秸稈

準(zhǔn)確稱量1 g過(guò)孔徑0.4 mm 篩的玉米秸稈粉末(絕干),將其加入到含有50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%DES水溶液或0.01 mol·-1醋酸緩沖液(p H4.8)的錐形瓶中,放入恒溫震蕩搖床中在50℃和150 r·min-1下水解96 h。水解中纖維素酶用量為9 FPU·g-1,纖維二糖酶用量50 U·g-1。分別在0、3、6、9、12、24、36、48、72、96 h 時(shí)定時(shí)取樣,經(jīng)5 000 r·min-1離心5 min后用0.22μm 針式過(guò)濾器過(guò)濾后通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)葡萄糖含量。

1.4 纖維素酶的回收

取適量DES、纖維素酶和一定濃度的K2HPO4水溶液混合,混合物在500 r·min-1下攪拌使其充分混合后,在25℃下萃取30 min。記錄上下兩相的體積,并用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上下兩相中的蛋白含量。萃取率計(jì)算公式如下:

其中,F代表上相萃取效率;ρt和ρb代表上下兩相中的纖維素酶濃度;Vt和Vb分別代表上下兩相的體積。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

1.5.1 DES體系下纖維素酶的構(gòu)象研究

使用日立F-4600型熒光光譜儀對(duì)樣品掃描,采用1 cm 石英比色皿,狹縫寬度為10 nm,激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,波長(zhǎng)掃描速度為1 200 nm·min-1,掃描波長(zhǎng)為300～540 nm;采用英國(guó)應(yīng)用光物理Chirascan Plus型圓二色譜儀掃描樣品,狹縫寬度為1 nm,掃描速度為50 nm·min-1,掃描光程為0.2 cm,掃描波長(zhǎng)為近紫外區(qū)190～250 nm。

1.5.2 雙水相萃取纖維素酶的機(jī)理研究

通過(guò)紫外光譜及熒光光譜測(cè)試探究萃取前后纖維素酶構(gòu)象的變化;并為了進(jìn)一步研究纖維素酶的萃取機(jī)理,利用電導(dǎo)率儀和動(dòng)態(tài)激光散射儀(DLS)考察低共熔溶劑富集相的微觀結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DES體系下纖維素酶活性

為試驗(yàn)方便,選取在室溫下仍能保持液體狀態(tài)的DES進(jìn)行研究,并考慮到DES黏度較高的缺陷,將其配置成10%的DES水溶液(V/V,p H=4.8)使用。考察了不同DES水溶液體系對(duì)于纖維素酶活性的影響,見(jiàn)圖1。從圖1可以看出,n(ChCl)/n(G)=1/4和n(ChCl)/n(PEG200)=1/3對(duì)纖維素酶的活性有增強(qiáng)作用,分別提高了11.27%和4.64%;而其他低共熔溶劑對(duì)纖維素酶活性幾乎沒(méi)有增強(qiáng)作用,甚至?xí)估w維素酶活性明顯下降。因此,選擇n(ChCl)/n(G)=1/4和n(ChCl)/n(PEG200)=1/3進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 DES體系下纖維素酶的活性Fig. 1 Activity of cellulase in DES system

為進(jìn)一步尋找合適的DES水溶液體系,考察了DES濃度對(duì)于纖維素酶活性的影響見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出,隨著DES含量的不斷增加,纖維素酶活性先增強(qiáng)后減弱。其原因可能是DES體積分?jǐn)?shù)在10%以下時(shí),低共熔溶劑的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定纖維素酶分子構(gòu)象,使纖維素酶的催化活性增強(qiáng);而當(dāng)DES體積分?jǐn)?shù)超過(guò)10%以后,DES含量的增多使得體系的黏度增大,阻礙了纖維素酶與底物的接觸,從而使其活性減弱。

圖2 DES濃度對(duì)纖維素酶活性的影響Fig. 2 Effect of DES concentration on cellulase activity

DES體系下纖維素酶的水解糖化性能研究見(jiàn)圖3。以玉米秸稈作為底物,探究DES體系下纖維素酶水解玉米秸稈的葡萄糖產(chǎn)率。其中纖維素酶用量為9 FPU·g-1,纖維二糖酶用量為50 U·g-1。從圖3中可以看出,纖維素酶對(duì)玉米秸稈顯示非常低的水解糖化效率,水解96 h后葡萄糖水解得率為35.39%,說(shuō)明纖維素酶的活性低,極大地抑制了酶解。DES體系下,由于DES 的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象,提高酶的催化活性和穩(wěn)定性,酶解得到了明顯的改善。10%n(ChCl)/n(G)=1/4水溶液體系下,纖維素酶的水解葡萄糖得率最高,水解96 h達(dá)到41.14%;10%n(ChCl)/n(PEG200)=1/3水溶液體系下,水解96 h葡萄糖得率次之,為37.76%。上述結(jié)果表明,DES 水溶液體系可以有效的提高玉米秸稈的水解葡萄糖得率。

圖3 纖維素酶水解玉米秸稈的水解葡萄糖得率Fig. 3 Glucose yield from cellulase hydrolysis of corn stover

2.2 雙水相萃取條件優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)纖維素酶的回收使用,利用DES 與K2HPO4構(gòu)建雙水相體系對(duì)纖維素酶進(jìn)行萃取。由實(shí)驗(yàn)得知,與n(ChCl)/n(G)=1/4 相比,n(Ch Cl)/n(PEG200)=1/3更易與K2HPO4溶液形成雙水相。由于萃取條件對(duì)雙水相萃取有顯著影響,從而影響雙水相體系對(duì)于纖維素酶的萃取。因此本實(shí)驗(yàn)考察了鹽濃度、DES用量、纖維素酶質(zhì)量、萃取時(shí)間和溫度等因素對(duì)雙水相體系萃取纖維素酶的影響。

圖4考察了K2HPO4濃度對(duì)纖維素酶萃取率的而影響。如圖4所示,隨著K2HPO4濃度的繼續(xù)增加,纖維素酶的回收率逐漸增加,在K2HPO4濃度為0.25 g·m L-1時(shí)回收率達(dá)到最大值69.53%;這主要是由于鹽析作用,下相中的鹽離子與纖維素酶之間存在結(jié)合水分子的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,因此無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量的增加會(huì)導(dǎo)致纖維素酶在下相的溶解度降低,使其回收率增大。但是當(dāng)體系中K2HPO4的濃度超過(guò)0.25 g·L-1時(shí),纖維素酶的回收率隨著鹽濃度的增加而迅速降低;這是因?yàn)槔w維素酶表面存在水化層,且水分子與纖維素酶表面氨基酸殘基之間的氫鍵作用是蛋白質(zhì)分子保持形貌和活性的重要作用力,而鹽濃度的進(jìn)一步增加會(huì)引起上相含水量的降低,從而使上相中的纖維素酶含量降低,回收率下降。因此體系中K2HPO4的最佳濃度為0.25 g·m L-1,它將在后續(xù)工作中繼續(xù)使用。

圖4 K2 HPO4 濃度對(duì)纖維素酶萃取率的影響Fig. 4 Effect of K2 HPO4 concentration on extraction rate of cellulase

圖5考察了DES濃度對(duì)纖維素酶萃取率的影響。從圖5可以看出,當(dāng)體系中DES的體積分?jǐn)?shù)從30%增加到35%時(shí),纖維素酶的回收率持續(xù)增加并達(dá)到最大值73.89%;這主要是隨著DES體積分?jǐn)?shù)的增加,更多的DES膠束在上相中形成,有利于結(jié)合更多的纖維素酶。而當(dāng)DES 的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)35%時(shí),纖維素酶的回收率表現(xiàn)出下降趨勢(shì);這是由于隨著DES的進(jìn)一步增加,上相的黏度逐漸增加,阻礙了纖維素酶進(jìn)入上相。因此在后續(xù)試驗(yàn)中DES的體積分?jǐn)?shù)為35%。

圖5 DES濃度對(duì)纖維素酶萃取率的影響Fig. 5 Effect of DES concentration on extraction rate of cellulase

溫度是纖維素酶萃取過(guò)程中一個(gè)重要的影響因素?？疾炝溯腿囟葘?duì)于纖維素酶萃取率的影響見(jiàn)圖6。從圖6可以看出,溫度低于25℃時(shí),纖維素酶的回收率逐漸升高;這是由于隨著溫度的升高,DES富集相的黏度逐漸降低,并且兩相之間的界面阻力下降,從而能夠使纖維素酶快速進(jìn)入上相。當(dāng)溫度超過(guò)25℃時(shí),纖維素酶的回收率急劇下降;這是因?yàn)闇囟瘸^(guò)某一特定值時(shí),纖維素酶表面氨基酸基團(tuán)和水分子之間作用力減弱,不利于其結(jié)合DES進(jìn)入上相。由此,確定最佳萃取溫度為25℃。

圖6 溫度對(duì)纖維素酶萃取率的影響Fig. 6 Effect of temperature on extraction rate of cellulase

圖7和圖8分別考察了萃取時(shí)間和纖維素酶濃度對(duì)于纖維素酶萃取率的影響。如圖7所示,纖維素酶的回收率隨著萃取時(shí)間的增加而逐漸增加,當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)30 min后,回收率增加緩慢并且基本保持不變。并且隨著纖維素酶用量的不斷增加,回收率逐漸降低(圖8)。這都表明了雙水相體系萃取的容量有限,隨著纖維素酶用量的持續(xù)增加或者萃取時(shí)間的延長(zhǎng),上相基本達(dá)到飽和狀態(tài)后,以至于沒(méi)有更多的空間容納纖維素酶,導(dǎo)致其進(jìn)入下相,從而使回收率下降。

圖7 時(shí)間對(duì)纖維素酶萃取率的影響Fig. 7 Effect of time on extraction rate of cellulase

圖8 酶濃度對(duì)纖維素酶萃取率的影響Fig. 8 Effect of enzyme concentration on extraction rate of cellulase

總之,當(dāng)雙水相體系中的K2HPO4濃度為0.25 g·m L-1、DES體積分?jǐn)?shù)為35%,在25℃下對(duì)較少纖維素酶萃取30 min時(shí),可以對(duì)纖維素酶獲得良好的萃取效果。

為了實(shí)現(xiàn)纖維素酶水解后的重復(fù)使用,利用DES雙水相體系對(duì)水解液中的纖維素酶進(jìn)行回收。最優(yōu)條件下對(duì)水解液中纖維素酶的回收效果見(jiàn)表1。從表1中可以看出,水解液中94.24%的纖維素酶被萃取上相,而僅有27.82%的葡萄糖隨之進(jìn)入。這表明雙水相體系可以有效的將纖維素酶與葡萄糖分離,實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶的回收利用;并且回收后纖維素酶的活性仍能保持90%以上,這也表明了雙水相體系萃取能夠?yàn)槔w維素酶提供一個(gè)溫和的環(huán)境。

表1 雙水相萃取結(jié)果Table 1 Aqueous two-phase extraction results

2.3 結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 DES體系下纖維素酶構(gòu)象的測(cè)定

為探究DES體系為何有利于纖維素酶活性的增強(qiáng),通過(guò)熒光光譜和圓二色譜對(duì)纖維素酶構(gòu)象進(jìn)行表征。

在天然蛋白質(zhì)中,能產(chǎn)生熒光的芳香氨基酸殘基包括色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。它們通常位于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)內(nèi),被各種非極性氨基酸殘基所包圍。因此,它們所處的局部環(huán)境比蛋白質(zhì)分子外的水溶液的極性小。如果將它們移到蛋白質(zhì)的外部,暴露在外部極性很強(qiáng)的水溶液中,就會(huì)發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象。色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸相對(duì)熒光強(qiáng)度之比為100∶9∶0.5。色氨酸的熒光強(qiáng)度最高,在熒光光譜中會(huì)覆蓋其他氨基酸殘基的吸收峰,表現(xiàn)為一寬峰。圖9所示為DES體系下纖維素酶的熒光光譜。在340 nm 處的熒光峰為3種芳香族氨基酸殘基的復(fù)合峰。酶在DES水溶液中產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)(熒光強(qiáng)度降低),并發(fā)生藍(lán)移。表明Trp、Tyr和phe向纖維素酶表面移動(dòng),有利于其與底物的接觸,從而使得其水解糖化能力增強(qiáng)。

圖9 DES體系下纖維素酶的熒光光譜Fig. 9 Fluorescence spectra of cellulase in DES system

圓二色譜(CD)被廣泛應(yīng)用于測(cè)量蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和推測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。天然纖維素酶和修飾纖維素酶的CD 光譜如圖10所示。天然纖維素酶在210 nm 處有一個(gè)寬峰,表明其三級(jí)結(jié)構(gòu)符合“α+β”型[13]。處于DES水溶液環(huán)境中的纖維素酶樣品的CD 峰吸收強(qiáng)度增加并發(fā)生紅移,說(shuō)明DES水溶液體系改變了二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)濃度,從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)CD 光譜,通過(guò)CRDATA 和SELCON3 計(jì)算α-螺 旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量,見(jiàn)表2。傳統(tǒng)緩沖溶劑中纖維素酶的α-螺旋和β-折疊相對(duì)含量分別為26.00%和27.30%,再次證實(shí)了天然纖維素酶具有“α+β”型的三級(jí)結(jié)構(gòu)特征。DES 水溶液體系提高了α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量,降低了β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。特別是,α-螺旋含量的增加意味著纖維素酶的空間結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性。

表2 DES體系下纖維素酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure contents of cellulase in DES system

圖10 DES體系下纖維素酶的圓二色譜Fig. 10 Circular dichroism of cellulase in DES system

總的來(lái)說(shuō),DES強(qiáng)大的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象,并使得纖維素酶的活性氨基酸殘基向纖維素酶表面移動(dòng),從而使得纖維素酶的活性和穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.3.2 DES雙水相萃取機(jī)理研究

紫外光譜可以通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的紫外吸收峰,進(jìn)而分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。圖11為萃取前后纖維素酶的紫外光譜。從圖11可以看出萃取前后纖維素酶的紫外光譜相似,并且其最大吸收峰的位置沒(méi)有變化。這表明DES與纖維素酶之間沒(méi)有化學(xué)鍵的形成,即DES雙水相體系可以為纖維素酶的萃取提供一個(gè)溫和的環(huán)境,不會(huì)改變纖維素酶的構(gòu)象。

圖11 回收前后纖維素酶的紫外光譜Fig. 11 UV spectra of cellulase before and after recovery

熒光光譜可以通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)以及反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度,從而研究蛋白質(zhì)在變性或復(fù)性過(guò)程中整體空間構(gòu)象的變化。圖12為萃取前后纖維素酶的熒光光譜。從圖12可以看出,萃取前后的纖維素酶的激發(fā)波長(zhǎng)位置沒(méi)有發(fā)生改變,進(jìn)一步證實(shí)了DES與纖維素酶之間沒(méi)有化學(xué)鍵的形成,與紫外光譜分析結(jié)果保持一致。

圖12 回收前后纖維素酶的熒光光譜Fig. 12 Fluorescence spectra of cellulase before and after recovery

為了進(jìn)一步研究纖維素酶的萃取機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)利用電導(dǎo)率、動(dòng)態(tài)光散射分析儀考察了DES富集相的微觀結(jié)構(gòu)。

不同濃度DES水溶液的電導(dǎo)率測(cè)定,見(jiàn)圖13。從圖13可以看到,根據(jù)電導(dǎo)率的變化曲線繪制了兩條線性片段,與這兩條線性片段的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度為臨界聚集濃度(CAC)。DES 的CAC 值為14%(體積分?jǐn)?shù)),在雙水相體系中使用的DES濃度均高于此值,因此在DES富集相中均有DES聚集體生成,這也可能是DES雙水相體系萃取纖維素酶的主要作用力。

圖13 不同濃度DES水溶液的電導(dǎo)率Fig. 13 Conductivity of aqueous solutions of DES with different concentrations

圖14為動(dòng)態(tài)光散射分析儀測(cè)定的纖維素酶溶液、無(wú)酶的DES富集相和含酶的DES富集相中粒子的尺寸分布圖。從圖14可以看出纖維素酶的粒徑在230.1 nm 左右,無(wú)酶的DES富集相的粒徑在956.3 nm 左右,而含有纖維素酶的DES富集相的粒徑在1 233.0 nm 左右,較之以前尺寸明顯增大。這證明了在萃取過(guò)程中,DES聚集體可能將纖維素酶包裹,形成了新的簇集體。

圖14 粒子大小分布圖Fig. 14 Size distribution of porticles

萃取機(jī)理研究表明:DES的簇集作用是DES雙水相體系萃取纖維素酶的主要作用力。在萃取過(guò)程中,DES通過(guò)簇集作用將纖維素酶包裹,形成新的聚集體,進(jìn)而將纖維素酶攜帶進(jìn)入上相,實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶的回收。并且DES雙水相體系為纖維素酶的萃取提供了溫和的環(huán)境,不會(huì)導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

3 結(jié)論

研究了低共熔溶劑體系下纖維素酶的活性,并以此構(gòu)建雙水相體系對(duì)纖維素酶進(jìn)行回收。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了最佳萃取條件,并指出DES的簇集作用是雙水相體系萃取纖維素酶的主要作用力。纖維素酶的紫外光譜以及熒光光譜證實(shí),雙水相體系為纖維素酶提供了一個(gè)溫和的環(huán)境,不會(huì)導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。電導(dǎo)率和DLS研究表明,纖維素酶的提取可能是因?yàn)镈ES聚集體將其包裹,形成了新的聚集體。本工作首次將DES雙水相體系應(yīng)用于纖維素酶的回收利用,當(dāng)雙水相體系中K2HPO4濃度為0.25 g·m L-1,DES體積分?jǐn)?shù)35%,在25℃下對(duì)較少纖維素酶萃取30 min時(shí),達(dá)到了94.29%的回收率。此實(shí)驗(yàn)可為尋找改善纖維素酶的活性和可回收性的新型綠色溶劑體系提供重要的理論依據(jù)。遺憾的是,DES雙水相萃取仍不能完全將纖維素酶與糖類分開(kāi)。但在未來(lái)的研究中,將考慮到纖維素酶的構(gòu)象,并努力設(shè)計(jì)出具有特定蛋白質(zhì)鑒定能力的低共熔溶劑。