景贊，呂雪梅，劉超

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺（melamine）俗稱密胺、蛋白精、蜜胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物[1]，常用作化工原料。因其對人體有害，故不可用于食品加工或作為食品添加劑。

基質(zhì)效應是指檢測系統(tǒng)檢測樣品中的分析物時，處于分析物周圍的所有非分析物質(zhì)對分析物參與反應的影響。基質(zhì)效應產(chǎn)生的原因與4個主要因素的相互作用密切相關，即儀器的設計、試劑的組成成分、測試方法的原理、質(zhì)控材料的組成及處理技術(shù)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將分離性能優(yōu)異液相色譜串聯(lián)專屬、能提供相對分子量和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜法的一種快速、靈敏、準確的現(xiàn)代分離分析技術(shù)，而且被廣泛用于定量分析復雜基質(zhì)中的物質(zhì)[2-4]。串聯(lián)質(zhì)譜特異性強，同時數(shù)據(jù)表明質(zhì)譜的檢測需要避免基質(zhì)效應[5-9]，否則會影響其檢測準確性。

試驗采取內(nèi)標法[10-12]消除三聚氰胺的基質(zhì)效應，內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在測定樣品中三聚氰胺含量時，加入三聚氰胺內(nèi)標物質(zhì)以校準和消除基質(zhì)效應對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準確度。

試驗引入單因素方差分析及基質(zhì)效應的評價方法具體量化液質(zhì)聯(lián)用檢測酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺基質(zhì)效應大小，為研究和消除因檢測過程引起的基質(zhì)效應提供量化指標。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；HSC-12A氮吹儀（北京佳航博創(chuàng)科技有限公司）；VM24固相萃取儀（天津艾杰爾科技有限公司）；HT190R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（長州冠軍儀器制造頭有限公司）；KQ3200E超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]、Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL天津艾杰爾科技有限公司）、Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；液態(tài)奶（金典、特侖蘇、伊利純牛奶、蒙牛純牛奶、三元純牛奶、光明乳業(yè)、旺仔、新希望、圣牧、QQ星）和酸奶（安慕希、純甄、莫斯利安、君樂寶、光明乳業(yè)、德亞、冠益乳、新希望初心、簡愛、人養(yǎng)一頭牛），均購于超市；三聚氰胺標準品（99.4%，批號G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺-13C3（100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

1.3 樣品處理

采用GB/T 22388——2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》“4.4.1.1”提取、“4.4.2”凈化。

1.4 三聚氰胺標準儲備液

準確稱取10 mg三聚氰胺標準品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標準及內(nèi)標中間液

1.5.1 三聚氰胺標準中間液

準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5.2 三聚氰胺內(nèi)標中間液

準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件

液相色譜及質(zhì)譜條件參照GB/T 22388——2008。

1.7 基質(zhì)效應評價方法

運用定量測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應程度，通過式（1）計算二者比值評價基質(zhì)效應。

式中：A和B為基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e。A/B＜80%，對分析物的響應產(chǎn)生抑制作用；A/B＞120%，對分析物的響應產(chǎn)生增強作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質(zhì)效應。

1.8 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對基質(zhì)效應的影響

10種液態(tài)奶和10種酸奶每個樣品分別取樣品0.50 g和1.00 g（精確至0.01 g）按照1.3樣品處理，按照1.6測定并記錄峰面積。結(jié)果見表1，圖1和圖2。

圖1 取樣量對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖2 取樣量對液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表1 取樣量對三聚氰胺ME的影響

表1為取樣量對酸奶、液態(tài)奶中分析三聚氰胺ME的統(tǒng)計分析結(jié)果。結(jié)合圖1和圖2可知，取樣量對分析酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME存在顯著性差異。因此取樣量是影響液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖1進一步可以得出，取樣量0.50 g和1.00 g對酸奶中三聚氰胺的ME分別為21.4%～32.5%和10.3%～23.1%。由圖2進一步可以得出，取樣量0.50和1.00 g對液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為23.6%～39.0%和14.7%～27.4%。

2.2 溶劑種類對基質(zhì)效應的影響

10種液態(tài)奶和10種酸奶每個樣品分別取4份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每種液態(tài)奶和酸奶的每份樣品依次加入10 mL水、6 mL三氯乙酸（1%）和4 mL水、10 mL三氯乙酸（1%）、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈，每個樣品超聲提取10 min后，按照1.3處理，按照1.6測定并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果見表2，圖3和圖4。

圖3 不同溶劑對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖4 不同溶劑對液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表2 溶劑種類對ME的影響

表2為不同溶劑對酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計分析結(jié)果。結(jié)合圖3和圖4可知，溶劑種類對分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈體積比4∶1之間無顯著性差異，其余均有顯著差異。因此溶劑種類是影響液態(tài)奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖3進一步可以得出，水、乙腈-水體積比3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈體積比4∶1對酸奶中三聚氰胺的ME分別為25.9%～36.7%，19.0%～31.3%，6.5%～19.0%及10.0%～22.7%溶劑。由圖4進一步可以得出，乙腈∶水=3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸∶乙腈=4∶1對液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為34.8%～46.7%、25.5%～37.6%、12.7%～25.9%及14.3%～27.3%溶劑。提取溶劑種類對分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸∶乙腈= 4∶1無顯著性差異。其余均有顯著差異。

2.3 溶劑用量對基質(zhì)效應的影響

10種液態(tài)奶和10種酸奶每個樣品分別取3份樣品各1.00 g（精確至0.01 g），每份樣分別加入4 mL三氯乙酸（1%）和1 mL乙腈、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈、12 mL三氯乙酸（1%）和3 mL乙腈。剩余按照1.3處理，按照1.6測定并記錄數(shù)據(jù)。

表3為溶劑用量對酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計分析結(jié)果。結(jié)合圖5和圖6可知，溶劑用量對分析液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME除10 mL與15 mL無顯著性差異，其余均存在顯著性差異。因此取樣量是影響液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由圖5進一步可以得出，溶劑用量為5，10和15 mL對液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為21.5%～34.3%，10.8%～23.7%和7.5%～20.4%。由圖6進一步可以得出，溶劑用量為5，10和15 mL對液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為28.8%～41.9%，14.2%～27.5%和11.6%～24.7%。

圖5 溶劑用量對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖6 溶劑用量對液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表3 溶劑用量對ME的影響

2.4 不同濃度三聚氰胺對基質(zhì)效應的影響

分別取10種液態(tài)奶和10種酸奶各3份樣品1.00 g（精確至0.01 g），每種液態(tài)奶的每份樣品分別編號為1號（液態(tài)奶、酸奶名稱），2號（液態(tài)奶、酸奶名稱）和3號（液態(tài)奶、酸奶名稱）。按照1.3處理。處理后取0.1 μL三聚氰胺標準儲備液加入1號（液態(tài)奶、酸奶名稱）搖勻；取0.5 μL三聚氰胺標準儲備液加入2號（液態(tài)奶、酸奶名稱）搖勻；取1.0 μL三聚氰胺標準儲備液加入3號（液態(tài)奶、酸奶名稱）搖勻。按照1.6測定并記錄數(shù)據(jù)。

表4為不同濃度三聚氰胺對酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計分析結(jié)果。結(jié)合表4，圖7和圖8可知，不同濃度三聚氰胺對分析液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺ME不存在顯著性差異。由圖7進一步可以得出，10，50和100 ng/mL不同濃度三聚氰胺對酸奶中三聚氰胺的ME分別為12.5%～25.0%，14.6%～23.6%和12.2%～20.4%。由圖8進一步可以得出，0，50和100 ng/mL不同濃度三聚氰胺1對液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為14.2%～27.1%，15.5%～26.6%和15.0%～27.5%。

圖7 不同濃度三聚氰胺對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖8 不同濃度三聚氰胺對液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表4 不同濃度三聚氰胺對ME的影響

2.5 SPE小柱對基質(zhì)效應的影響

分別取10種液態(tài)奶和10種酸奶各4份平行樣品1.00 g（精確至0.01 g），每份樣品過前處理小柱時分別為待凈化液不過柱、待凈化液過WCX前處理小柱、待凈化液過Cleanert PCX前處理小柱、待凈化液過Bond Elut Plexa PCX前處理小柱。按照1.6測定并記錄數(shù)據(jù)。

表5為SPE小柱對酸奶、液態(tài)奶中三聚氰胺ME的統(tǒng)計分析結(jié)果。結(jié)合表5與圖9、圖10可知不過住與過SPE小柱之間存在顯著性差異；過SPE小柱之間不存在顯著性差異。由圖9進一步可以得出SPE小柱類型：不過柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對酸奶中三聚氰胺的ME，分別為4.3%～20.7%、10.4%～23.3%、9.9%～22.7%和9.9%～23.1%。由圖9進一步可以得出SPE小柱類型中，不過柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX對液態(tài)奶中三聚氰胺的ME分別為9.3%～22.2%、14.7%～27.6%、14.3%～27.0%和14.3%～27.4%。

圖9 SPE小柱對酸奶三聚氰胺ME的影響

圖10 SPE小柱對液態(tài)奶三聚氰胺ME的影響

表5 SPE小柱對液態(tài)奶、酸奶三聚氰胺ME的影響

表6 三聚氰胺線性方程

2.6 基質(zhì)效應的消除

繪制標準曲線。分別移取不同體積的三聚氰胺中間液及相同體積的三聚氰胺標準中間液至6個25 mL容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度，得到質(zhì)量濃度依次為10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺標準工作液，每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺內(nèi)標濃度為20 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標作圖，三聚氰胺峰面積/內(nèi)標峰面積為縱坐標得標準曲線回歸方程。

稱量9份空白樣品至9個50 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標中間溶液，分別加入25.0，50.0和100.0 μL三聚氰胺標準中間溶液，做三水平三平行回收試驗，其余步驟按1.3。

將加標三聚氰胺峰面積/內(nèi)標峰面積代入，得到三聚氰胺線性的回歸方程y=0.634x+0.185 2，得出計算濃度，數(shù)據(jù)如表7和表8。

表7 酸奶樣品三聚氰胺回收率

表8 液態(tài)奶樣品三聚氰胺回收率

從表7與表8可知酸奶、液態(tài)奶在低、中、高3個水平均很大程度上降低基質(zhì)效應，回收率在100%～110%之間。因此內(nèi)標法對三聚氰胺ME的消除具有顯著效果。

3 結(jié)論

從取樣量、溶劑種類、溶劑用量、不同濃度三聚氰胺和SPE小柱這5個因素研究對液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺的基質(zhì)效應。結(jié)果表明，對液態(tài)奶、酸奶三聚氰胺基質(zhì)效應的影響相差較為明顯?？赡苁遣煌緦σ簯B(tài)奶、酸奶的配方不同、制作工藝不同、采用的配方及牛奶原料種類不同，因此液態(tài)奶、酸奶中三聚氰胺的基質(zhì)效應起伏變化比較明顯。單因素方差分析表明：取樣量對分析的ME差異顯著，提取溶劑種類對分析物的ME差異性除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈體積比4∶1之間沒有顯著性差異，不存在基質(zhì)效應；提取溶劑用量10 mL與15 mL之間差不存基質(zhì)效應；不同濃度三聚氰胺不存在基質(zhì)效應；過SPE小柱之間不存在基質(zhì)效應；其余因素均存在明顯基質(zhì)效應。