張紅瑞，李 鑫, ，陳振夏，胡文斌，李 偉，黃 梅*，于福來*，楊林立

基于SSR分子標(biāo)記的裸花紫珠種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建

張紅瑞1，李 鑫1, 2，陳振夏2，胡文斌2，李 偉3，黃 梅2*，于福來2*，楊林立4

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中藥材生物學(xué)與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶藥用植物工程研究中心，海南 ?？?571101 3. 海南九芝堂藥業(yè)有限公司，海南 ?？?570311 4. 河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450053

研究裸花紫珠種質(zhì)資源遺傳多樣性，為其種質(zhì)資源鑒定及優(yōu)異種質(zhì)篩選提供依據(jù)。采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，探究103份裸花紫珠種質(zhì)遺傳多樣性，基于遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，以SSR擴(kuò)增條帶為基礎(chǔ)建立供試材料擴(kuò)增條帶DNA指紋圖譜。14對(duì)引物共擴(kuò)增出92個(gè)等位基因（number of alleles，a），有效等位基因（effective number of alleles，e）占比39.37%。平均多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）為0.468 2，6對(duì)引物具有高度多態(tài)性（PIC＞0.5），6對(duì)具有中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5）。平均Nei多樣性指數(shù)（Nei's gene diversity index，）和Shannon指數(shù)（Shannon’s information index，）分別為1.039 0、0.505 1，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。聚類分析將材料分為2大類：類群I包括2份種質(zhì)；類群II包含101份種質(zhì)，并分為2個(gè)亞類。主坐標(biāo)分析將材料分為3個(gè)類群，與聚類結(jié)果基本一致。構(gòu)建的指紋圖譜通過引物組合能較好地將種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。103份裸花紫珠種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性，并成功利用14對(duì)SSR引物構(gòu)建裸花紫珠種質(zhì)DNA指紋圖譜，可為裸花紫珠種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系以及分子輔助育種提供科學(xué)依據(jù)。

裸花紫珠；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；遺傳距離；聚類分析；主坐標(biāo)分析；DNA指紋圖譜

裸花紫珠Hook. et Arn為馬鞭草科紫珠屬植物，干燥葉入藥，主產(chǎn)于海南、廣東、廣西等省份，是海南省道地藥材和黎藥大品種，為《中國藥典》2020年版唯一新增收載藥材，具有消炎、解腫毒、化濕濁、止血等功效[1]。課題組前期對(duì)海南島裸花紫珠種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)上尚無優(yōu)勢(shì)品種，人工栽培種苗大部分來源于自留種，長期以來會(huì)導(dǎo)致種質(zhì)混雜，藥材產(chǎn)量與質(zhì)量參差不齊[2]，因此對(duì)現(xiàn)有種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定、厘清種質(zhì)種源親緣關(guān)系，對(duì)于后續(xù)指導(dǎo)裸花紫珠藥材新品種選育顯得尤為重要。

DNA分子標(biāo)記是研究種質(zhì)資源遺傳多樣性及分子輔助育種的重要手段，主要包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）等[3]。早期的RAPD、AFLP等傳統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)由于多態(tài)性信息含量低、分型不穩(wěn)定、重復(fù)性差不適合做種質(zhì)資源鑒定，而SSR分子標(biāo)記因其多態(tài)性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定等[4]。近年來，SSR分子標(biāo)記逐步應(yīng)用于裸花紫珠研究當(dāng)中，于福來等[5]對(duì)裸花紫珠進(jìn)行基因組調(diào)研及SSR特征分析，發(fā)現(xiàn)其單、雙、三核苷酸重復(fù)序列占比較高。彭云露[6]利用MISA軟件對(duì)6份裸花紫珠進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，篩選出22對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)在分子水平上的變異較小，因使用的樣本數(shù)量較少，難以全面反映出裸花紫珠基因型差異。

鑒于此，本研究擴(kuò)大樣本數(shù)量，基于基因組和轉(zhuǎn)錄組信息，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)來自我國3省23縣（市）共計(jì)103份裸花紫珠種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，建立了裸花紫珠DNA指紋圖譜，為裸花紫珠種質(zhì)鑒定、優(yōu)異種質(zhì)篩選以及分子輔助育種等提供理論依據(jù)，并為后續(xù)充分發(fā)掘利用裸花紫珠種質(zhì)資源、選配育種親本等工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 藥材 實(shí)驗(yàn)樣品為來自3省23縣（市）的103份裸花紫珠野生種或半野生種，集中種植于農(nóng)業(yè)部儋州熱帶藥用植物種質(zhì)資源圃，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所于福來副研究員鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠Hook. et Arn，其中93份來自于海南，5份來自于廣東，5份來自于廣西，具體信息見表1，103份種質(zhì)中不同編號(hào)代表來自不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村落的裸花紫珠種質(zhì)。

1.1.2 試劑 2×Taq PCR Master Mix（美國基因泰克公司），DL 2000 DNA Marker（美國基因泰克公司），瓊脂糖（美國基因泰克公司），10 μL/200 μL移液吸頭（愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司），96孔PCR板（愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司），磁珠法基因組DNA提取試劑盒（天根生化有限公司），普通引物/熒光標(biāo)記引物（天一輝遠(yuǎn)有限公司），GeneScan 500 LIZ Size Standard（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），POP-7 Polymer（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），Hi-Di Formamide（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 儀器

Mikro 120型臺(tái)式離心機(jī)（MIKRO公司），Veriti 96型PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），Gel Doc TM XR+型紫外分析儀（美國伯樂公司），King Fisher? Flex型核酸提取儀（賽默飛有限公司），3730XL型基因分析儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

2 方法

2.1 總DNA提取與檢測(cè)

采集供試材料的幼嫩葉片，液氮冷凍保存，使用磁珠法基因組DNA提取試劑盒（天根生化）提取103份裸花紫珠嫩葉樣品的總DNA，使用Nano DROP 8000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)核酸濃度和純度，260280均在1.8～2.0，表明DNA提取純度較高，最終調(diào)整DNA濃度為50～200 ng/L用于進(jìn)一步研究。

2.2 SSR引物的合成、篩選與PCR擴(kuò)增

依據(jù)課題組前期測(cè)序結(jié)果，由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成384對(duì)SSR引物。選擇編號(hào)分別為1、2、8、12、50、54、61、77、81、86的10份遺傳背景差異較大的裸花紫珠種質(zhì)的混合DNA樣本，對(duì)合成的SSR引物進(jìn)行初步篩選，并對(duì)初篩引物進(jìn)行復(fù)篩和驗(yàn)證，最終篩選出14對(duì)條帶清晰、多態(tài)性高及穩(wěn)定性好的核心引物（表2）。

SSR的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（10 μL）為：2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL，基因組DNA（～20 ng）1 μL，上游引物（濃度10 pmol/μL）0.5 μL，下游引物（濃度10 pmol/μL）0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。PCR反應(yīng)在Veriti 96 PCR儀（Applied Biosystem）上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62～52 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)下降1 ℃；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸20 min，4 ℃保存。

2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

熒光PCR擴(kuò)增完成后，取3 μL熒光PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)PCR條帶是否單一、片段大小是否與預(yù)期一致。條帶單一且大小相符的，對(duì)照DNA Marker的濃度進(jìn)行定量，將所有產(chǎn)物稀釋至相同的濃度范圍。取10 μL甲酰胺和0.5 μL內(nèi)標(biāo)混勻，加入1 μL PCR稀釋產(chǎn)物，上ABI 3730xl儀器進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

表2 14對(duì)SSR引物序列信息

2.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

將電泳結(jié)果導(dǎo)入GeneMarker分析軟件中，進(jìn)行基因型數(shù)據(jù)的讀取，并按位點(diǎn)名稱分別導(dǎo)出Excel基因型原始數(shù)據(jù)和PDF分型峰圖文件。利用GenALEx 6.502將SSR分子標(biāo)記的結(jié)果轉(zhuǎn)化為txt文本格式。Popgene 32[7]計(jì)算各SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)（number of alleles，a）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，e）、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，o）、期望雜合度（expected heterozygosity，e）、Shannon's信息指數(shù)（shannon's information index，）以及基因多樣性指數(shù)（nei's gene diversity index，），PowerMarker 3.25[8]計(jì)算PIC值。NTSYS-version 2.10e[9]計(jì)算遺傳距離，并繪制遺傳距離三維圖。MEGA 6.06[10]繪制環(huán)形遺傳聚類圖譜。GenAlEx 6.502[11]繪制主坐標(biāo)分析圖。

3 結(jié)果

3.1 SSR引物遺傳多樣性分析

對(duì)所篩選出的14對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過DNA分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，準(zhǔn)確獲得裸花紫珠不同種質(zhì)在各位點(diǎn)等位基因的片段大小及相應(yīng)的電泳圖，部分檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。14對(duì)核心SSR引物參數(shù)見表3，103份樣品中共擴(kuò)增92個(gè)a，平均每對(duì)引物擴(kuò)增6.571 4個(gè)，變化范圍3～13個(gè)；e變化范圍在1.081 8～4.947 2，e變異占比39.37%；范圍在0.211 3～1.808 5，其中4對(duì)引物達(dá)到1.5以上；e變化范圍在0.076～0.801 8，平均為0.507 5（e＞0.5），提示供試材料遺傳多樣性較高[12]；o變化范圍在0.009 7～0.87，平均為0.357 0，僅1個(gè)引物的e小于o外，其余引物e均大于o，這說明供試種質(zhì)內(nèi)雜合子過剩現(xiàn)象少[13]；平均多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）值變化范圍在0.074 7～0.768 4，平均為0.468 2，具有中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5），其中6對(duì)引物具有高度多態(tài)性（PIC＞0.5），6對(duì)引物為中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5）。本研究中，高PIC值的引物占42.9%，表明這些SSR位點(diǎn)可從分子水平解釋基因型差異，具有豐富的遺傳差異性，可作為有效標(biāo)記來構(gòu)建裸花紫珠種質(zhì)DNA指紋圖譜。

部分裸花紫珠種質(zhì)用CnH220引物擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)圖示例，CnH220引物在所有樣品中共擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)7個(gè)，分別是164、167、170、173、176、179、182 bp

表3 14對(duì)核心SSR引物遺傳多樣性分析

3.2 裸花紫珠種質(zhì)資源遺傳距離分析

基于NTSYS-pc 2.10軟件計(jì)算103份裸花紫珠種質(zhì)間遺傳距離及構(gòu)建遺傳距離矩陣，繪制三維曲面圖（圖2），103份供試材料間遺傳距離范圍在0～2.791 7，大多數(shù)種質(zhì)遺傳距離在0.5～1.0，平均遺傳距離為0.634 2，遺傳距離較大，表明各供試材料間具有豐富的遺傳多樣性。其中編號(hào)為93（海南昌江縣）的種質(zhì)和編號(hào)為2（海南五指山市）的種質(zhì)遺傳距離最大（2.791 7），表明2個(gè)種質(zhì)間遺傳背景差異大，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。另外，來自廣東的種質(zhì)平均遺傳距離為0.644 3，來自廣西的種質(zhì)平均遺傳距離為0.661 3，來自海南的種質(zhì)平均遺傳距離為0.616 5，3個(gè)省份供試材料間平均遺傳距離差異較小，表明遺傳距離分析準(zhǔn)確性強(qiáng)，可信度高。

圖2 裸花紫珠種質(zhì)資源的遺傳距離三維圖

3.3 裸花紫珠種質(zhì)資源的聚類分析

根據(jù)種質(zhì)間遺傳距離，利用UPGMA法對(duì)供試材料進(jìn)行分類并得到聚類圖（圖3）。結(jié)果表明，101份裸花紫珠種質(zhì)被有效區(qū)分，編號(hào)4和編號(hào)8的種質(zhì)（均來自海南白沙）未被區(qū)分開，聚類在可信度0.3515處將103份種質(zhì)分為2大類（類群I、類群II）。類群I包括2份裸花紫珠種質(zhì)，分別是編號(hào)11和編號(hào)12（均來自海南五指山）；類群II被分為2個(gè)亞類群（II-1和II-2）：亞類群II-1包括編號(hào)2（海南白沙）與編號(hào)64（海南東方）的種質(zhì)，亞類群II-2包括其他99份種質(zhì)，在可信度0.093 7處再次將亞類群II-2分為3個(gè)小類群，小類群II-2-1包括編號(hào)為68和編號(hào)69的種質(zhì)（均來自海南東方），小類群II-2-2包括編號(hào)為54（海南樂東）、66（海南萬寧）、57（海南海口）、82（廣西南寧）的種質(zhì)，小類群II-2-3含括其他93份種質(zhì)，包括來自廣西北海和廣西欽州的4份、廣東省5份以及海南省18市（縣）的84份種質(zhì)。從聚類分析中可以看出，有些位于同一地區(qū)的種質(zhì)并未完全聚在一起，而一些不同地區(qū)的則被聚為一類，這可能是由于不同地區(qū)種質(zhì)進(jìn)化來源相同，也有可能是不同種質(zhì)在長期自然選擇過程中存在基因交流的現(xiàn)象。

圖3 103份裸花紫珠種質(zhì)資源的聚類分析

3.4 裸花紫珠種質(zhì)資源的主成分分析

為了更好地驗(yàn)證裸花紫珠種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，利用GenAlEx 6.502對(duì)供試材料進(jìn)行主成分分析，以第1主成分和第2主成分為二維坐標(biāo)圖的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，構(gòu)建二維主成分分析圖（圖4），其中主成分1解釋率為12.33%，主成分2解釋率為8.96%。主成分分析將103份種質(zhì)劃分為3個(gè)類群，每一類群均分布在不同象限內(nèi)。

第1類包括24份種質(zhì)，主要分布在第2象限，其中包含聚類分析中類群I的2份種質(zhì)、亞類群II-1的2份種質(zhì)、小類群II-2-1的2份種質(zhì)、小類群II-2-2的4份種質(zhì)以及小類群II-2-3中的16份種質(zhì)。第2類主要分布在第3象限，共聚集18份種質(zhì)，包含小類群II-2-2中的1份種質(zhì)以及II-2-3中的17份種質(zhì)。第3類材料最為豐富，共61份種質(zhì)，在4個(gè)象限中均有分布，但在第1、4象限分布較為集中，包括聚類分析小類群II-2-2中的3份種質(zhì)以及II-2-3中的58份種質(zhì)，其中來自廣東、廣西的10份種質(zhì)被聚集在一起。主成分分析從不同角度直觀反映出供試材料間的親緣關(guān)系，且種質(zhì)在主坐標(biāo)二維圖中分布均勻，表明其遺傳多樣性較為豐富[15-16]，聚集在一起的裸花紫珠材料代表種質(zhì)間遺傳背景相似，親緣關(guān)系較近。本研究將PCoA主成分分析與UPGMA聚類分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)類群內(nèi)對(duì)具體種質(zhì)的分布高度一致，兩者分析結(jié)果可以相互佐證。

圖4 103份裸花紫珠種質(zhì)SSR標(biāo)記主成分分析的二維點(diǎn)散圖

3.5 構(gòu)建裸花紫珠DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜表現(xiàn)形式采用閔學(xué)陽等[17]的方法，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果將有條帶、無條帶分別記為“1”和“0”，根據(jù)Botstein[18]提出的理論，指紋分析無法僅用1對(duì)引物將某個(gè)種質(zhì)與其他種質(zhì)區(qū)分開，因此需要利用引物組合的方式進(jìn)行區(qū)分。對(duì)14對(duì)引物進(jìn)行多樣性分析后，選取具高度多態(tài)性的引物區(qū)分所有種質(zhì)，如不能全部鑒別，增加一個(gè)引物進(jìn)行區(qū)分，直到將所有種質(zhì)區(qū)分開。從表3可以看出，CnH080、CnH107、CnH156、CnH182、CnH220、CnH304引物多態(tài)性信息含量高（PIC＞0.5），引用上述6對(duì)引物組合共區(qū)分出99個(gè)種質(zhì)，還有4份種質(zhì)未被區(qū)分。因此，綜合PIC值和等位基因數(shù)等因素，增加CnH078引物進(jìn)行鑒別，共區(qū)分出101個(gè)種質(zhì)，將14對(duì)引物全部轉(zhuǎn)換成指紋圖譜（表4），仍有2個(gè)種質(zhì)（編號(hào)4和編號(hào)8）無法完全區(qū)分開，這與聚類分析結(jié)果一致，這表明該2份材料可能為同一種質(zhì)，也可能與供試種質(zhì)較多，引物鑒別力下降有關(guān)[19]。本研究首次利用14對(duì)引物構(gòu)建出101份裸花紫珠種質(zhì)資源DNA指紋圖譜代碼，使每份種質(zhì)都有各自唯一的一套DNA指紋，可在分子水平上輔助解決裸花紫珠同名異種或者同種異名等種質(zhì)混亂現(xiàn)象[20]，也使裸花紫珠種質(zhì)鑒定更加準(zhǔn)確高效。

表4 103份裸花紫珠DNA指紋圖譜

續(xù)表4

續(xù)表4

4 討論

4.1 SSR引物有效性評(píng)價(jià)

SSR標(biāo)記是用來鑒定品種真實(shí)性和遺傳多樣性的有力工具[21]，遺傳多樣性水平高可代表物種群體健康、適應(yīng)性強(qiáng)[22]，而SSR引物有效性高則可以更好地評(píng)價(jià)物種遺傳多樣性。本研究利用14對(duì)SSR引物對(duì)來自不同省份的103個(gè)裸花紫珠種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，較前人研究[6]極大的擴(kuò)增了樣本數(shù)量，且來源幾乎涵蓋所有裸花紫珠的主產(chǎn)區(qū)，樣本具有較好的代表性。分析獲得的a平均值（6.571 4）和PIC平均值（0.468 2）較高，說明引物多態(tài)性高、有效性強(qiáng)，有利于不同遺傳背景供試種質(zhì)的區(qū)分，在種質(zhì)遺傳多樣性分析中表現(xiàn)出較大潛力。研究檢測(cè)到的a值較高（92個(gè)），e占比較大（39.37%），這可能與供試種質(zhì)來源廣、類型豐富有關(guān)，且采用的方法精確、靈敏，能夠有效評(píng)價(jià)裸花紫珠遺傳多樣性?；谝陨戏治?，本研究所篩選的引物有效性強(qiáng)，區(qū)分效果好，使得裸花紫珠種質(zhì)鑒別更加準(zhǔn)確，為后續(xù)裸花紫珠遺傳變異檢測(cè)及雜交育種奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

4.2 裸花紫珠遺傳關(guān)系

供試材料間的遺傳距離可以直觀反應(yīng)種質(zhì)的遺傳多樣性，間接體現(xiàn)出種質(zhì)間遺傳背景相似度。趙雅楠等[23]利用10對(duì)多態(tài)性引物對(duì)92份內(nèi)蒙古綠豆進(jìn)行遺傳距離分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古綠豆遺傳多樣性豐富，個(gè)體差異水平較高。鄭濤等[24]利用12對(duì)SSR引物對(duì)12份血葉蘭進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)間遺傳距離最大為0.74，研究有效驗(yàn)證了種質(zhì)間親緣關(guān)系與遺傳距離密切相關(guān)。本研究供試材料的遺傳距離在0～2.791 7，遺傳距離變異幅度大，遺傳背景差異明顯。少部分來源相同的種質(zhì)遺傳距離較近，如來自海南三亞的102號(hào)和103號(hào)種質(zhì)遺傳距離為0.052 7，來自廣西欽州的83號(hào)和84號(hào)種質(zhì)遺傳距離僅為0.032 3，原因可能是一些地理來源較近的種質(zhì)經(jīng)過長時(shí)間自然馴化，導(dǎo)致遺傳變異下降?？梢奡SR分子標(biāo)記能夠在一定程度上反應(yīng)種質(zhì)地理來源情況。從遺傳距離分析，有些來源不同的種質(zhì)遺傳距離卻比較接近，如來自海南臨高的13號(hào)種質(zhì)與來自海南儋州的89號(hào)種質(zhì)遺傳距離僅為0.160 2，這可能與種質(zhì)具有相似的環(huán)境背景或常年引種有關(guān)，導(dǎo)致個(gè)別種質(zhì)在進(jìn)化過程中出現(xiàn)DNA分子差異水平下降的情況。因此，在今后的育種工作中一方面要結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)開展各地方種質(zhì)遺傳多樣性研究，發(fā)掘親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的種質(zhì)；另一方面要加大種質(zhì)資源的收集及保存，拓寬裸花紫珠育種的遺傳背景。

4.3 裸花紫珠類群結(jié)構(gòu)

物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)與物種的起源進(jìn)化、自然分布等有很大關(guān)系，對(duì)研究物種之間的進(jìn)化關(guān)系有很大幫助[25]。Feng等[26]運(yùn)用SSR技術(shù)對(duì)40份野生黃精進(jìn)行聚類分析，認(rèn)為野生黃精群體間遺傳差異小，主坐標(biāo)分析有效地驗(yàn)證了聚類分析的結(jié)果。Iqbal等[27]運(yùn)用SSR技術(shù)對(duì)13個(gè)橄欖品種進(jìn)行聚類分析及主坐標(biāo)分析，明確了13份材料間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，證明橄欖品種間遺傳變異在一定程度上收到地理環(huán)境的影響。本研究將UPGMA聚類分析及主坐標(biāo)分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)各類群呈現(xiàn)一定地域相關(guān)性，即相近地區(qū)材料間遺傳關(guān)系較近，來自同一地區(qū)的種質(zhì)聚集在一起的幾率較大，如圖3中類群II-2-3將來自廣東省的所有種質(zhì)以及廣西省的4份種質(zhì)均聚集在了一起，圖4的主成分分析將廣東的5份種質(zhì)聚為一類。不同地區(qū)來源種質(zhì)也存在相互聚集的情況，如類群II-2-2中聚集了海南島的3份種質(zhì)和廣西的1份種質(zhì)，主成分將廣東的5份種質(zhì)和廣西的5份種質(zhì)聚集在一起，這體現(xiàn)出該種質(zhì)可能來源于相同（相似）的祖先，或在發(fā)展種植過程中不同地理來源的種質(zhì)為適應(yīng)環(huán)境從而發(fā)生基因交流的現(xiàn)象。未被聚集在一起的種質(zhì)代表種質(zhì)間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳背景差異大，因此，在今后對(duì)裸花紫珠進(jìn)行種質(zhì)改良時(shí)，可以利用親緣關(guān)系遠(yuǎn)、品質(zhì)性狀優(yōu)的種質(zhì)進(jìn)行雜交選育，既可獲得遺傳差異豐富的后代，又能在一定程度上提高裸花紫珠種質(zhì)遺傳多樣性。

4.4 裸花紫珠DNA指紋圖譜構(gòu)建

目前，構(gòu)建植物分子指紋圖譜主要有特征譜帶法、引物組合法和單引物法3種方式[28]。其中，引物組合法一般用于種質(zhì)數(shù)量多的指紋圖譜構(gòu)建，該方法不僅可以高效、快速地鑒別種質(zhì)，而且極大地提高引物的鑒別能力。目前，SSR標(biāo)記在裸花紫珠指紋圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用尚未見報(bào)道，鑒于此，本次研究運(yùn)用SSR標(biāo)記技術(shù)，利用14對(duì)高多態(tài)性引物，采用引物組合法，首次構(gòu)建了103份裸花紫珠種質(zhì)DNA指紋譜圖，并精準(zhǔn)鑒別出101份裸花紫珠種質(zhì)。然而研究中選用的14對(duì)引物并未將103個(gè)種質(zhì)全部區(qū)分，4號(hào)種質(zhì)與8號(hào)種質(zhì)的指紋圖譜不具備唯一性（表4）。究其原因，一方面可能是由于多態(tài)性引物的開發(fā)還不夠全面，另一方面可能與所收集的該種質(zhì)地理來源相近、種質(zhì)間遺傳背景相似有關(guān)。

未來隨著裸花紫珠種質(zhì)收集范圍的逐漸擴(kuò)大與種質(zhì)信息的不斷更新，本研究中的SSR引物可能會(huì)無法全部鑒別，因此應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化SSR引物或采用更多的多態(tài)性引物組合，為DNA指紋圖譜應(yīng)用于裸花紫珠種質(zhì)鑒別提供方便快捷的記錄方式的同時(shí)，擴(kuò)展更加完善的指紋圖譜。

本研究利用14對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)裸花紫珠種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，每個(gè)SSR標(biāo)記平均6.571 4個(gè)a，PIC平均為0.468 2，說明引物多態(tài)性較高，鑒別能力強(qiáng)，能夠精準(zhǔn)評(píng)價(jià)所有種質(zhì)的遺傳多樣性。對(duì)供試材料進(jìn)行遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，遺傳距離在0～2.791 7，遺傳變異幅度大，遺傳背景差異明顯。聚類分析將供試材料分為2大類群，類群II又分為2個(gè)亞類，與主成分分類結(jié)果基本一致，兩者有效驗(yàn)證了種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。利用14對(duì)引物組合首次建立103份裸花紫珠DNA指紋圖譜，能夠精準(zhǔn)鑒定101份種質(zhì)，區(qū)分全面并具代表性，對(duì)裸花紫珠種質(zhì)溯源管理及原產(chǎn)地保護(hù)具有重要意義。

綜上所述，本研究印證了SSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于裸花紫珠遺傳多樣性分析的可行性，這些SSR標(biāo)記不僅為裸花紫珠遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建提供有價(jià)值的候選標(biāo)記，也為后續(xù)裸花紫珠種質(zhì)分子鑒別、優(yōu)良種質(zhì)的分子輔助育種提供分子技術(shù)手段。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Genetic diversity analysis and DNA fingerprints construction ofgermplasm resources based on SSR markers

ZHANG Hong-rui1, LI Xin1, 2, CHEN Zhen-xia2, HU Wen-bin2, LI Wei3, HUANG Mei2, YU Fu-lai2, YANG Lin-li4

1. College of Agriculture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine (Haikou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical medicinal plants, Haikou 571101, China 3. Hainan Jiuzhitang Pharmaceutical Co., Ltd., Haikou 570311, China 4. Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450053, China

To study the genetic diversity and genetic relationship of Luohuazizhu (Hook. et Arn.) germplasm resources, provide the basis for identification of germplasm resources and screening of excellent germplasm resources.Genetic diversity of 103 germplasm resources was explored by SSR molecular marker technique, UPGMA cluster analysis was carried out based on genetic distance, and DNA fingerprints of amplified bands of tested materials were established based on SSR amplified bands.A total of 92 alleles (a) were amplified by 14 pairs of primers, effective number of alleles (e) accounted for 39.37%. The average polymorphism information content (PIC) was 0.468 2, six pairs of primers were highly polymorphic (PIC＞0.5) and six pairs were moderately polymorphic (0.25＜PIC＜0.5). The average Nei’s gene diversity index () and Shannon’s information index () were 1.0390 and 0.5051, showing a high level of genetic diversity. Cluster analysis divided the materials into two categories: Group I included two germplasm; Group II contains 101 germplasm resources and is divided into two subclasses. Principal coordinate analysis divided the materials into three groups, which were basically consistent with the clustering results. The constructed fingerprint can distinguish germplasm by primer combination.A total of 103 germplasms have rich genetic diversity. The DNA fingerprint ofgermplasms was successfully constructed by 14 pairs of SSR primers. The results can provide scientific basis for germplasm identification, genetic relationship and molecular assisted breeding ofgermplasms.

Hook.et Arn.; SSR molecular marker; genetic diversity; genetic distance; cluster analysis; principal coordinate analysis; DNA fingerprinting

R286.12

A

0253 - 2670(2023)12 - 3971 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.023

2022-12-06

海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目（ZDKJ2021001）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（322QN393）

張紅瑞，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與栽培。E-mail: zhanghongrui2003@126.com

通信作者：于福來，博士，研究員，主要從事中藥（南藥）資源定向培育研究。E-mail: fulai.yu@163.com

黃 梅，碩士，助理研究員，主要從事南藥種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及規(guī)范化栽培。E-mail: huangmei122@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]