吳銳華，譚素嫻，盧國(guó)揚(yáng)，杜藹媚

國(guó)藥集團(tuán)德眾（佛山）藥業(yè)有限公司，廣東 佛山 528000

三棱為黑三棱科植物黑三棱Sparganium stoloniferumBuch.-Ham.的干燥塊莖。三棱性平，味辛、苦，歸肝、脾經(jīng)，具消積止痛、行氣破血的功效，臨床上可用于治療食積脹痛、癥瘕痞塊、瘀血經(jīng)閉、痛經(jīng)等病癥［1］。

三棱所含有的化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要有黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類、有機(jī)酸類、苯丙素類，對(duì)人體有不同藥物功效。除此之外，還含有少量蒽醌、甾體等化學(xué)成分［2-8］。三棱在抑制血小板聚集所導(dǎo)致的血栓、對(duì)抗炎癥、緩解疼痛、抗擊腫瘤等方面均可發(fā)揮一定藥理作用［2-8］。

為促進(jìn)中藥研究標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究顯得至關(guān)重要，其不僅有助于制劑工藝進(jìn)步，而且還可以提升藥物質(zhì)量，為中藥配方顆粒制備、研發(fā)和質(zhì)量控制提供相關(guān)的理論依據(jù)［9］。

本研究是在前人對(duì)三棱藥材研究的基礎(chǔ)上，鑒于三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑為水煎煮而得，脂溶性成分較難轉(zhuǎn)移，建立一套基于超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜和指標(biāo)成分含量測(cè)定的三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)方法［10-12］。

1 實(shí)驗(yàn)材料

電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，SQP 型，精度分別為0.1 mg 和0.01 mg］；超聲儀（東莞市大朗速潔超聲設(shè)備制造廠，DC400）；電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司，DK-98-Ⅱ）；臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，KA-1000）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義予華儀器有限公司，YRE-301）；超高速液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司，UPLC Vanquish）。

甲醇（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；乙醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；冰醋酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；香草酸（批號(hào)：110776-201503，含量99.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；阿魏酸（批號(hào)：110773-201614，含量99.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；對(duì)香豆酸（批號(hào)18011605，含量99.97%，成都普菲德生物科技有限公司）；香草醛（批號(hào)20120820，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

15 批三棱飲片，購(gòu)自浙江、江西、安徽和湖南等地，根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 版三棱標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，全部符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表1。

表1 15批三棱飲片的產(chǎn)地信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 三棱飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

依照2016 年國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見(jiàn)稿）》制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑。取150 g 三棱飲片，置電加熱陶瓷壺中，加適量水分兩次煎煮，首次煎煮加入藥材重量9 倍量的水，浸泡30 min 后，先用武火（500 W）將藥液煮沸，再用文火（200 W）使其微沸，時(shí)間為30 min，之后使用200 目篩網(wǎng)過(guò)濾煎液，濾液置于密閉容器中保存并用冷水冷卻。第二次煎煮加入藥材重量7 倍量的水，先用武火（500 W）將藥液煮沸，再用文火（200 W）使之維持微沸25 min，用200 目篩網(wǎng)，趁熱過(guò)濾煎液，濾液轉(zhuǎn)移至密閉容器中并用冷水冷卻。合并兩次煎液并將其轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在低溫條件下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮（真空度為-0.08 MPa～-0.1 MPa；溫度為60 ℃），轉(zhuǎn)速50～90 r/min，濃縮至約150 mL。濃縮液在磁力攪拌下，吸取2 mL 均勻分裝于10 mL棕色西林瓶中，置冷凍真空干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，取出，軋上鋁蓋，即得。

2.2 指紋圖譜的研究

2.2.1色譜條件色譜柱：Waters CORTECS T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，93% B；2～10 min，93% →87% B；10～17 min，87% →67% B；17～25 min，67%→60% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：35 ℃，每次運(yùn)行完后預(yù)平衡5 min。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取香草酸、香草醛、對(duì)香豆酸和阿魏酸對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，研至細(xì)粉狀，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇15 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率400 W，頻率40 kHz），放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4精密度試驗(yàn)將同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)行6 次，所得數(shù)據(jù)顯示標(biāo)準(zhǔn)湯劑各色譜峰以對(duì)香豆酸為參照的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值均在0.2%以內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD 值均在3.0%以下，表明儀器精密度良好。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn)按“2.2.3”項(xiàng)下的操作方法，同時(shí)制備六份供試品溶液并進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算，數(shù)據(jù)顯示各色譜峰以對(duì)香豆酸為參照的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均不超過(guò)0.2%，相對(duì)峰面積的RSD 值均在3.0%以下，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，計(jì)算結(jié)果顯示以對(duì)香豆酸為參照的相對(duì)保留時(shí)間RSD 值在0.2%以內(nèi)，相對(duì)峰面積的RSD 值則均在2.0%以下，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7指紋圖譜的建立依照“2.2.3”項(xiàng)下方法，制備15 批三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液并使用UPLC 色譜儀測(cè)定其液相圖譜，利用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》軟件，導(dǎo)入色譜數(shù)據(jù)，并通過(guò)比較圖譜相似度來(lái)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。見(jiàn)圖1。

圖1 15批三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜共有峰

2.2.8共有峰的確認(rèn)使用中位數(shù)計(jì)算方法，對(duì)圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配色譜峰，生成對(duì)照指紋圖譜，其中共有峰有8 個(gè)。峰1 為香草酸，峰2 為香草醛，峰3 為對(duì)香豆酸；峰5 為阿魏酸。參照峰設(shè)定為對(duì)香豆酸，算出8 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果分別為0.57、0.86、1.00、1.16、1.25、2.29、2.61、2.75。見(jiàn)圖2。

圖2 三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照特征圖

2.2.9相似度評(píng)價(jià)經(jīng)過(guò)相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)測(cè)后，算出相似度，結(jié)果顯示均高于0.98，見(jiàn)表2，說(shuō)明15批三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品比較一致。

表2 15批三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度

2.3 含量測(cè)定方法的建立

2.3.1色譜條件同“2.2.1”項(xiàng)下。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)香豆酸對(duì)照品17.49 mg 置100 mL 棕色量瓶中，加乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密移取10 mL 置100 mL棕色量瓶中，加乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為17.48 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.3供試品溶液的制備同“2.2.3”項(xiàng)下。

2.3.4專屬性試驗(yàn)取空白溶液、對(duì)香豆酸對(duì)照品溶液、三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示空白溶液對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，色譜峰分離度大于1.5，且供試品與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，說(shuō)明專屬性良好。見(jiàn)圖3。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖：A.空白溶液；B.對(duì)香豆酸對(duì)照品溶液；C.三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液

2.3.5精密度試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)樣同一個(gè)對(duì)照品溶液6次，結(jié)果RSD 值小于0.8%，表明儀器具備良好的精密度。

2.3.6重復(fù)性試驗(yàn)按“2.2.3”項(xiàng)下的操作方法，同時(shí)制備六份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算對(duì)香豆酸含量及RSD 值。結(jié)果顯示其含量均值為0.021 7%，RSD 值為0.7%，表明實(shí)驗(yàn)具有較好的重復(fù)性。

2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)香豆酸峰面積RSD 值為0.7%，表明三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.8線性試驗(yàn)取17.48 μg/mL 對(duì)香豆酸對(duì)照品溶液,分別稀釋成濃度為0.874、1.748、3.496、4.370、6.992、8.740 μg/mL 的對(duì)照品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)其在不同濃度下的峰面積，然后將對(duì)香豆酸濃度（X）設(shè)置為橫坐標(biāo)，其色譜峰面積（Y）設(shè)置為縱坐標(biāo)，通過(guò)線性回歸分析得到其回歸方程為Y=0.432 6X-0.044 7（r=0.999 9），表明在0.874～17.480 μg/mL 范圍里，對(duì)香豆酸濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.9加樣回收試驗(yàn)取已知含量三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品6 份，按100%加入量分別加入適量的對(duì)香豆酸對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下操作方法制備，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)湯劑中對(duì)香豆酸平均回收率為94.47%，RSD 值為1.0%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3.10不同批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測(cè)定結(jié)果依照“2.2.3”項(xiàng)的操作步驟，對(duì)15 批三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液進(jìn)行制備，檢測(cè)其對(duì)香豆酸含量，所得數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 15批三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)香豆酸含量 %

3 討論

分別在254、300、360 nm 下對(duì)三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行檢測(cè)。在254 nm 時(shí)圖譜中脂溶性成分色譜峰響應(yīng)值低，色譜峰數(shù)量較少；在360 nm 時(shí)圖譜中水溶性成分色譜峰響應(yīng)值低，色譜峰數(shù)量較少；將波長(zhǎng)設(shè)置為300 nm 時(shí)，相應(yīng)的水溶性色譜峰以及脂溶性色譜峰都出現(xiàn)了比較高的響應(yīng)值，各峰分離狀態(tài)情況好，基線比較穩(wěn)定，所以將波長(zhǎng)參數(shù)設(shè)置為300 nm。因?yàn)橹鶞貢?huì)影響色譜峰的保留時(shí)間，故分別對(duì)比各色譜峰在柱溫為30、35、40 ℃時(shí)的分離度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí)，各峰分離效果較好。

對(duì)三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑的提取方式、提取溶劑及提取時(shí)間進(jìn)行考察，通過(guò)比較峰面積大小來(lái)確定三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的樣品前處理方法。提取所使用的方式主要對(duì)比了超聲以及回流提取，提取溶劑對(duì)比70%甲醇、70%乙醇以及水三種溶劑，提取時(shí)間比較了15、30、45 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同時(shí)間下超聲和回流對(duì)于指紋圖譜和對(duì)香豆酸含量結(jié)果影響不大。提取溶劑對(duì)比試驗(yàn)中，70%甲醇、70%乙醇提取的情況比較好，考慮到乙醇毒性較低，所以本研究使用了70%乙醇。超聲時(shí)間對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明超聲提取30 min，各成分的提取程度已經(jīng)達(dá)到了峰值。

UPLC 指紋圖譜有助于對(duì)配方顆粒、標(biāo)準(zhǔn)湯劑等中藥制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。通過(guò)計(jì)算，對(duì)照指紋圖譜和15 批三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC 指紋圖譜相似度范圍在0.985～0.998 之間，可見(jiàn)不同產(chǎn)地來(lái)源和批次的三棱飲片制備所得的三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有良好的一致性，但對(duì)香豆酸含量RSD 值為25.3%，差異較大，說(shuō)明三棱標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量受三棱飲片產(chǎn)地來(lái)源影響較明顯。