畢武，聶平，孫輝，丁野，張文娟，馬雙成

1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410001；2.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

白扁豆為我國常用中藥材，來源于豆科扁豆屬植物扁豆Dolichos lablabL.（Lablab purpureus）的種子，具有消暑除濕，健脾止瀉的功效［1］，同時(shí)也廣泛作食用，是一種藥食兩用品種。目前有參苓白術(shù)散、健脾糕片、嬰兒健脾顆粒等近20 個(gè)中成藥中含有白扁豆。研究［2-3］表明，白扁豆具有降糖、抗炎鎮(zhèn)痛、抗結(jié)石等多種活性，主要含有三萜皂苷（如Lablabosides A,B and C）、凝集素等化學(xué)成分，還含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸等氨基酸，飽和脂肪酸（24.2%），單不飽和脂肪酸（18.42%）和多不飽和脂肪酸（57.38%）等脂肪酸類成分，其中以亞油酸含量較高。此外，還有高含量的鉀，少量的鈣、鐵、鋅等微量元素。

白扁豆在世界各熱帶地區(qū)均有栽培。我國南北朝時(shí)名醫(yī)陶弘景所撰《名醫(yī)別錄》中記載扁豆已有栽培［4］。白扁豆目前在全國均有種植，尤其以云南、四川種植面積較大。市場(chǎng)供應(yīng)分為國內(nèi)、國外兩種貨源。因此，一方面白扁豆存在國外非藥用品種混用或誤用的可能；另一方面，由于中藥的有效性往往與生長(zhǎng)環(huán)境等密切相關(guān)，國外以及國內(nèi)不同地域栽培的白扁豆品種之間是否存在差異也未見相關(guān)報(bào)道。

DNA 條形碼概念是加拿大學(xué)者Paul Hebert 于2003 年首次提出［5］，之后引起各國學(xué)者們的廣泛關(guān)注，該技術(shù)利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA 片段來進(jìn)行物種鑒定，具有不受生物個(gè)體形態(tài)特征、發(fā)育階段和外界環(huán)境等因素影響的優(yōu)勢(shì)，近年來在動(dòng)植物分類鑒定尤其是在藥用植物鑒定研究方面得到廣泛應(yīng)用，取得了很大進(jìn)展［6-7］。核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列由于具有序列短，易擴(kuò)增，鑒定能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),成為目前藥用植物DNA 條形碼鑒定的常用序列之一。因此，本研究通過ITS2 條形碼序列對(duì)不同來源市售白扁豆進(jìn)行鑒別分析，了解市售白扁豆的具體狀況。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

31 批白扁豆樣品通過市場(chǎng)、網(wǎng)絡(luò)購買等方式收集。樣品信息詳見表1。

從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載已公布的57 份白扁豆和14 份混偽品的ITS2 序列信息，詳見表2。

表2 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的白扁豆及其混偽品ITS2序列信息

1.2 儀器設(shè)備

混合球磨儀（型號(hào)MM400，德國Resch 公司）；微量冷凍離心機(jī)（型號(hào)Fresco21，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；電子天平（型號(hào)JA5003，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；PCR 擴(kuò)增儀（型號(hào)Labcycler，SensQuest 公司）；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)G：BOX XT4，英國Syngene 公司）；電泳儀（型號(hào)BG-Power600，北京百晶生物技術(shù)有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號(hào)BH8104-D，杭州保恒恒溫技術(shù)有限公司）。

1.3 試藥

離心柱型植物基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq Master Mix 緩沖液均購自天根生化科技（北京）有限公司；100bp DNA ladder marker（上海捷瑞生物工程有限公司）；GeneRed Nucleic Acid Dye（19G0326，Biotium）；ITS2 擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA 的提取

取適量白扁豆樣品，用75%的酒精擦拭表面進(jìn)行消毒處理，待自然揮干后經(jīng)球磨儀研磨，取30 mg左右研磨后的細(xì)粉，加入700 μL 基因組DNA 提取試劑盒中的DNA 裂解液，56 ℃水浴2 h，期間混勻3～4次，采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取總DNA，具體提取步驟按說明書進(jìn)行。

2.2 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ITS2 引物（ITS2F ：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' ；ITS3R ：5'-GACGCTCTCCAGACTACAAT-3'）［8］各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。ITS2 序列PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，將具有單一明亮目的條帶的產(chǎn)物送往湖南大地同年生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將測(cè)序獲得的序列數(shù)據(jù)使用 CodonCode Aligner 10.0 軟件對(duì)測(cè)序峰圖校對(duì)，去除引物及低質(zhì)量區(qū)后進(jìn)行拼接。通過ITS2 注釋網(wǎng)站（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）進(jìn)行注釋，獲得不含5.8S和28S 兩端區(qū)段后的ITS2 間隔區(qū)序列。對(duì)所得序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行相似性搜索，進(jìn)行物種鑒別。利用MEGA 11.0 軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，計(jì)算不同堿基的比例，查找變異位點(diǎn)，并構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 白扁豆樣品性狀

從收集的白扁豆樣品性狀來看，不同樣品的形狀，大小以及外表面等存在較大差異，部分樣品表面存在黑色斑點(diǎn)，典型樣品見圖1。

圖1 白扁豆典型樣品性狀圖

3.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

利用通用引物對(duì)31 份市售白扁豆樣品ITS2 序列擴(kuò)增，均獲得成功，成功率為100%。測(cè)序結(jié)果顯示，ITS2 序列的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序均獲成功，獲得序列質(zhì)量高。因此，后續(xù)對(duì)ITS2 序列展開深入分析。

3.3 基于ITS2 序列的物種鑒定

將拼接好的ITS2 序列通過數(shù)據(jù)庫注釋獲得ITS2 條形碼序列。注釋得到的31 條ITS2 條形碼序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過Blast 進(jìn)行相似性搜索，完成物種鑒定。鑒定結(jié)果顯示，樣品序列與數(shù)據(jù)庫中最匹配的物種為L(zhǎng)ablab purpureus，相似度均在99%以上。由此可以說明，ITS2 序列能夠準(zhǔn)確鑒定市售白扁豆藥材。本次實(shí)驗(yàn)樣品均為正品白扁豆，可用于下一步的分析。

3.4 ITS2 序列特征分析

實(shí)驗(yàn)共得到經(jīng)注釋后的ITS2 序列88 條，其中白扁豆樣品序列31 條，從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的序列57 條。應(yīng)用MEGA 11.0 軟件將這些序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，白扁豆ITS2 序列長(zhǎng)度為216～218 bp，C+G 占比為46.8%～47.3%。種內(nèi)變異較少，經(jīng)與峰圖確認(rèn)（因部分GenBank 數(shù)據(jù)庫下載序列在這兩個(gè)位點(diǎn)未明確具體堿基），共存在2 個(gè)變異位點(diǎn)，分別為86 位點(diǎn)D 的A →G 和174 位點(diǎn)的G →C（代表性峰圖如圖2 所示）。根據(jù)對(duì)變異位點(diǎn)的分析，可將白扁豆歸納為6 種主要的單倍型（B1～B6），具體如表3 所示。

圖2 白扁豆ITS2序列雜合型變異位點(diǎn)峰圖

表3 白扁豆ITS2序列變異位點(diǎn)

3.5 白扁豆與其混偽品遺傳發(fā)育分析

基于ITS2 條形碼序列，通過鄰接法構(gòu)建白扁豆與其常見的7 種混偽品14 條序列的NJ 樹（見圖3）。由圖中可見，白扁豆與其混偽品硬皮豆、眉豆等能明顯區(qū)分。不同單倍型白扁豆聚為一支，眉豆和豇豆聚為一支（因眉豆為豇豆的亞種），鐮扁豆、硬皮豆、金甲豆、菜豆和荷包豆這些不同的種各自聚在一起。從親緣關(guān)系來看，白扁豆與眉豆、豇豆的親緣關(guān)系最近；與鐮扁豆、硬皮豆的親緣關(guān)系次之；與金甲豆、菜豆和荷包豆的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。因此，通過ITS2 條形碼能很好地區(qū)分白扁豆藥材及其常見的混偽品或近緣種。

圖3 基于ITS2的系統(tǒng)發(fā)育分析（NJ樹）

3.6 白扁豆與其混偽品二級(jí)結(jié)構(gòu)比較分析

通過ITS2 注釋網(wǎng)站對(duì)白扁豆及其常見混偽品的ITS2 序列二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖4。總體上來看，白扁豆及其常見混偽品均由一個(gè)中心環(huán)和四個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)螺旋上的莖、環(huán)存在不同程度的差異，通過這些差異可以將白扁豆與其常見混偽品明顯區(qū)分。主要區(qū)別點(diǎn)有：中心環(huán)大小，螺旋之間的夾角，螺旋上環(huán)的數(shù)量和大小，螺旋長(zhǎng)度等。

圖4 白扁豆及其混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)比較4 討論

在長(zhǎng)期栽培過程中，白扁豆在外觀形態(tài)上發(fā)生了較大的變化，比如，表面有黑色斑點(diǎn)，性狀和大小差異較大，這些變化雖不成為種的鑒別依據(jù)，但也可能會(huì)對(duì)經(jīng)驗(yàn)不足的鑒定和使用人員造成困擾。據(jù)文獻(xiàn)［9-12］報(bào)道，目前白扁豆發(fā)現(xiàn)的混偽品主要有金甲豆、眉豆、鐮扁豆以及菜豆、荷包豆等；在植物分類中，扁豆屬（Lablab）和硬皮豆屬（Macrotyloma）二者非常相似，曾一起被歸入Dolichos 屬，如白扁豆Lablab purpureus 拉丁學(xué)名原為Dolichos lablab；硬皮豆Macrotyloma uniflorum(Lam.) Verdc.拉丁學(xué)名原為Dolichos unifloraLam.［13］，因此，這些均為白扁豆易混偽或近緣品種。還有觀點(diǎn)認(rèn)為“進(jìn)口扁豆”系偽品，不可入藥［14］。此外，目前《中國藥典》2020 年版收載的白扁豆項(xiàng)目?jī)H有性狀和顯微鑒別，無化學(xué)成分鑒別指標(biāo)，不易將白扁豆與其混偽品區(qū)分。

鑒于以上原因，需要采用更多的手段或指標(biāo)對(duì)市售白扁豆進(jìn)行分析，本研究采用基于ITS2 序列的DNA 條形碼技術(shù)對(duì)白扁豆的遺傳背景情況進(jìn)行了較為深入的分析。從ITS2 序列來看，白扁豆ITS2 序列可與其近源種有效區(qū)分，但不同地域栽培的白扁豆以及國產(chǎn)和進(jìn)口白扁豆未發(fā)現(xiàn)明顯的差異，可能原因是這些均為白扁豆的不同栽培類型，遺傳背景差異很小。本研究表明，白扁豆ITS2 序列變異小，僅有兩個(gè)變異位點(diǎn)。王明芳等［15］也曾報(bào)道進(jìn)口白扁豆與國產(chǎn)白扁豆僅在外觀性狀上存在差異，但在顯微鑒別、薄層鑒別及健脾止瀉功效方面未表現(xiàn)出明顯的差異，說明進(jìn)口白扁豆與國產(chǎn)白扁豆差異很小。

雖然ITS2 序列可以作為白扁豆真?zhèn)舞b別的一個(gè)指標(biāo)，但能否作為白扁豆質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，還有待進(jìn)一步的研究。因有報(bào)道認(rèn)為，白扁豆與其變種云南、四川白扁豆在蛋白黏度、紫外吸收和薄層色譜等方面存在較大差異［16］；國產(chǎn)白扁豆星狀細(xì)胞胞腔內(nèi)有棕色內(nèi)含物，進(jìn)口品種則無此特征［15］。因此，還需要深入研究，尋找白扁豆的標(biāo)記物，對(duì)白扁豆的真?zhèn)蝺?yōu)劣進(jìn)行鑒別。