許怡冉,何玥,李冕,魯艷芹,3
(1.山東第一醫(yī)科大學(xué) 臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250117;2.山東第一醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250117;3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科,山東 濟(jì)南 250014 )
FGFR3 基因?qū)儆谑荏w酪氨酸激酶(FGFR)家族,位于人類染色體4p16.3,長約16.5 kb,是一種具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體。與配體結(jié)合后形成二聚體激活胞內(nèi)酪氨酸激酶,在細(xì)胞內(nèi)引起一系列級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致DNA 合成和細(xì)胞分裂[1],并進(jìn)一步激活下游MAPK 及PI3K/AKT 信號通路。其中細(xì)胞內(nèi)MAPK 信號通路與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移行為相關(guān);PI3K/AKT 信號通路與腫瘤細(xì)胞遷移、黏附及腫瘤血管的生成相關(guān)[2]。FGFR3 突變多發(fā)生在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(R248C,S249C),突變產(chǎn)生的新半胱氨酸殘基可與受體二聚體共價結(jié)合,導(dǎo)致受體的結(jié)構(gòu)性激活來參與腫瘤的發(fā)生。研究表明,約有35%膀胱癌及25%宮頸癌病例中發(fā)生了FGFR3 的基因突變,突變主要發(fā)生在淺表或乳頭狀低級別膀胱癌中,與良好的預(yù)后及臨床分期相關(guān)[3-5]。基于大量的文獻(xiàn)檢索與臨床數(shù)據(jù),目前仍缺乏FGFR3 與各種腫瘤關(guān)系的泛癌證據(jù)。該研究利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)中數(shù)據(jù)[6-8]分析基因表達(dá)、生存預(yù)后、免疫微環(huán)境和相關(guān)蛋白通路的分子特征,研究FGFR3 基因在不同腫瘤發(fā)病機(jī)制中臨床預(yù)后及免疫相關(guān)性,為探討潛在的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
利用TIMER2[9]數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org//)中“Gene-DE”模塊分析FGFR3 在正常組織與腫瘤組織間表達(dá)差異,評估FGFR3 具有治療靶標(biāo)的潛力。對于缺乏正常組織對比數(shù)據(jù)的腫瘤,利用GEPIA2[10]數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/index.html#index)的“Expression Analysis”模塊分析,設(shè)置“P值=0.01,log2FC=1”,獲得這些腫瘤組織與GTEx 數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的差異數(shù)據(jù)。通過GEPIA2 網(wǎng)站的“Stage Plot”模塊分析多種不同病理分期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期)腫瘤組織中FGFR3 基因表達(dá),用log2(TPM+1)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)作出“小提琴圖譜”。
利用GEPIA2“Survival Analysis”模塊獲得TCGA腫瘤中包含F(xiàn)GFR3 基因的腫瘤總體生存率(overall survival,OS)和無病生存率(disease free survival,DFS)數(shù)據(jù)圖譜,設(shè)置表達(dá)參數(shù)“cutoff-hight(50%),cutoff-low(50%)”區(qū)分高表達(dá)組和低表達(dá)組。假設(shè)檢驗(yàn)采用Mentel-Cox 檢驗(yàn),通過GEPIA2 的“Survival Analysis”模塊繪制單基因生存分析圖(Kaplan-Meier)。
利 用 cBioPortal[11]數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org/)中“Quick Search”模 塊,選擇TCGA 泛癌圖譜分析,輸入FGFR3 進(jìn)行泛癌基因突變匯總,并在“Mutation”模塊查詢FGFR3 的基因突變頻率,突變類型,拷貝數(shù)改變(CAN)、突變位點(diǎn)及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。利用“Comparison/Survival”模塊獲得FGFR3 基因在突變及未突變時,TCGA 腫瘤病例中無疾病的、無進(jìn)展的和無疾病生存差異的總體數(shù)據(jù),同時生成P值為log-rank的Kaplan-Meier 圖。利用Rstudio 中TCGAbiolinks軟件包下載突變注釋文件,利用Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)評估FGFR3 表達(dá)與TMB、MSI 間的相關(guān)性,使用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行基因共表達(dá)分析。
TIMER2 提供六種常見免疫細(xì)胞的滲透評分,包括B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。利用Immune 模塊分析TCGA 腫瘤中FGFR3 表達(dá)與免疫浸潤之間的關(guān)系,采用XCell、MCPCOUNTER 和EPIC 算法進(jìn)行免疫浸潤評估。腫瘤純度是本分析中的主要混雜因素[12],通過純度調(diào)整后的Spearman's 等級相關(guān)檢驗(yàn)得到P值及偏相關(guān)系數(shù)(partial correlation,COR)值。數(shù)據(jù)以熱圖及散點(diǎn)圖的形式展現(xiàn)。
通過 GEPIA2 數(shù)據(jù)庫的“Similar Gene Detection”模塊,得到與FGFR3 表達(dá)相關(guān)的前100 個靶向基因,應(yīng)用log2TPM 方塊圖,得到P值和相關(guān)系數(shù)R,利用以上數(shù)據(jù)制作所選基因與FGFR3 的相關(guān)性熱圖。STRING 數(shù)據(jù)庫是一個檢索已知蛋白及預(yù)測蛋白間相互作用的數(shù)據(jù)庫[13](https://string-db.org/),通過“Protein by name”模塊,輸入蛋白名稱“FGFR3”,隨后設(shè)置以下參數(shù):最低交互分?jǐn)?shù)設(shè)置為低信度0.150;最大交互對象數(shù)量設(shè)置為不超過50 個;來源設(shè)置為實(shí)驗(yàn)。篩選出50 個經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的FGFR3 結(jié)合蛋白。使用Venn[14]網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將相關(guān)性前100 基因與蛋白互作的50 個基因進(jìn)行交叉分析。結(jié)合兩組數(shù)據(jù)進(jìn)KEGG 和GO 通路分析。將基因列表上傳到David網(wǎng) 站[15](https://david.ncifcrf.gov/)并選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”和“Homo Spaiens”分別作為基因標(biāo)識符和物種,使用cnetlot 函數(shù)(Circle=F,ColorEdge=T,Node_Label=T),對生物學(xué)過程的分子功能(molecular function,MF)數(shù)據(jù)通過ggplot2 和ForestPlot 的R 包生成cnet 曲線圖[16]。其中,雙側(cè)P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
在本研究中,筆者探討人類FGFR3 基因(mRNA:NM_000142.5,蛋白質(zhì) :NP_001341738.1)的致癌作用。系統(tǒng)發(fā)育樹分析FGFR3 蛋白在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系,篩選出相似度最高的14 個物種進(jìn)行同源分析,發(fā)現(xiàn)智人與黑猩猩,白頰長臂猿關(guān)系最近。
采用TIMER2 數(shù)據(jù)庫分析TCGA 中FGFR3 mRNA 表達(dá)水平。在乳腺浸潤癌(BRCA)、膽管癌(CHOL)、肝細(xì)胞肝癌(LIHC)、肺鱗癌(LUSC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、甲狀腺癌(THCA)組織中FGFR3mRNA 表達(dá)水平明顯高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。在結(jié)腸癌(COAD)、腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)、肺腺癌(LUAD)組織中FGFR3mRNA 表達(dá)水平明顯低于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖1A。
圖1 FGFR3 基因在不同腫瘤和病理分期中的表達(dá)水平
將TCGA 與GTEx 數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析,補(bǔ)充GTEx 數(shù)據(jù)集的正常組織作為對照,進(jìn)一步分析FGFR3 在卵巢漿液性囊腺癌(OV)、胸腺癌(THYM)、子宮肉瘤(UCS)、急性髓細(xì)胞樣白血病、(LGG)、睪丸癌(TGCT)的正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異(P<0.01),見圖1B。對于腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤(DLBC)和肉瘤(SARC)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
使用GEPIA2 中“Pathological Stage Plot”模塊觀察腫瘤中FGFR3 表達(dá)與臨床分期間相關(guān)性,包括膀胱尿路上皮癌(BLCA)、腎透明細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌、肺腺癌、皮膚黑色素瘤和子宮內(nèi)膜癌(UCEC),發(fā)現(xiàn)上述腫瘤中FGFR3 表達(dá)普遍呈上升趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1C。
根據(jù)FGFR3 表達(dá)水平,將腫瘤劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。如圖2A 所示,F(xiàn)GFR3 高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌(P=0.014)總體預(yù)后不良有關(guān),低表達(dá)的FGFR3 與腎上腺皮質(zhì)癌(P=0.012)和LGG(P=0.034)總體預(yù)后不良有關(guān)。無病生存率分析數(shù)據(jù)顯示FGFR3 的高表達(dá)與頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)(P=0.0067)患者預(yù)后差有關(guān),低表達(dá)的FGFR3 與腎上腺皮質(zhì)癌(P=0.015)、葡萄膜黑色素瘤(UVM)(P=0.0067)患者預(yù)后差有關(guān)(見圖2B)。上述結(jié)果表明FGFR3 的表達(dá)高低與不同類型腫瘤的預(yù)后存在差異。
圖2 FGFR3 基因與腫瘤生存預(yù)后的關(guān)系
以FGFR3 突變?yōu)橹饕愋偷陌螂啄蚵飞掀ぐ┗颊撸現(xiàn)GFR3 基因的變異頻率最高(>18.73%),子宮肉瘤以FGFR3 擴(kuò)增為主,其變異頻率>15.79%,F(xiàn)GFR3 擴(kuò)增是腎上腺皮質(zhì)癌和膽管癌患者的唯一變異類型,其變異頻率>2%(見圖3A)。進(jìn)一步顯示FGFR3 基因變異的類型和位點(diǎn)(見圖3B),發(fā)現(xiàn)FGFR3 錯義突變是遺傳變異的主要類型,在1 例KRPCC、4 例LSCC、4 例頭頸鱗狀細(xì)胞癌、32 例LUCC 病例中檢測出I-set 結(jié)構(gòu)域中使FGFR3基因249 號位點(diǎn)發(fā)生拼接突變(見圖3C)。
圖3 TCGA 腫瘤中FGFR3 基因突變特征及基因共表達(dá)分析
評估FGFR3 表達(dá)與不同腫瘤類型的TMB 之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)FGFR3 表達(dá)與膀胱尿路上皮癌、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、結(jié)腸癌、食管癌(ESCA)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肺腺癌、間皮瘤(MESO)、皮膚黑色素瘤、胸腺癌中的TMB 相關(guān),而與其他腫瘤無顯著相關(guān)(見圖3D)。此外,評估了不同腫瘤中FGFR3 表達(dá)與MSI 狀態(tài)之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)FGFR3 表達(dá)與肺腺癌、卵巢漿液性囊腺癌、胰腺癌(PAAD)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、子宮內(nèi)膜癌、葡萄膜黑色素瘤、結(jié)腸癌、腎透明細(xì)胞癌中的MSI 相關(guān),而與其他腫瘤無明顯相關(guān)性(見圖3E)。
使用不同算法研究免疫細(xì)胞浸潤水平與FGFR3 表達(dá)間的相關(guān)性。基于全部結(jié)腸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、前列腺癌和睪丸癌各腫瘤中FGFR 的表達(dá)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的浸潤水平呈負(fù)相關(guān),F(xiàn)GFR3 表達(dá)與卵巢漿液性囊腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞呈正相關(guān)(圖4A)。在此,將上述腫瘤其中一種算法產(chǎn)生的相關(guān)性散點(diǎn)圖作為代表展現(xiàn)(圖4B,Rho=-0.391,P=1.00e-06)。
圖4 FGFR3 基因表達(dá)與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞免疫浸潤分析
為了進(jìn)一步研究FGFR3 基因在腫瘤發(fā)生中的分子機(jī)制,篩選出FGFR3 靶向結(jié)合蛋白及FGFR3表達(dá)相關(guān)基因進(jìn)行一系列富集分析。采用STRING數(shù)據(jù)庫,得到50 個基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的FGFR3結(jié)合蛋白。圖5A 為這些蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用GEPIA2 工具結(jié)合TCGA 腫瘤的表達(dá)數(shù)據(jù),得到FGFR3 表達(dá)相關(guān)的前100 個基因。圖5C 所示,F(xiàn)GFR3 表達(dá)水平與ARHGAP23(R=0.33)、LET(R=0.31)、PVRL1(R=0.34)、SDC1(R=0.32)和TACC3(R=0.4)基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.001)。相應(yīng)熱圖數(shù)據(jù)顯示FGFR3 在不同腫瘤中的表達(dá)差異性(圖5D)。將蛋白互作的50 個基因與相關(guān)性前100 基因取交叉分析篩選出共同基因PVRL1(圖5B)。
結(jié)合上述兩組數(shù)據(jù)集進(jìn)行KEGG 和GO 富集分析。KEGG 數(shù)據(jù)表明,F(xiàn)GFR3 在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用可能與腫瘤信號通路(pathways in cancer)、MAPK 信號通 路(MAPK signaling pathway)和 PI3K-Akt 信號通 路(PI3K-Akt signaling pathway)有關(guān)(圖5E)。GO 富集分析進(jìn)一步表明,這些基因大多數(shù)與細(xì)胞增殖、分化及血管形成途徑密切相關(guān)(圖5F)。
通過文獻(xiàn)檢索,筆者沒有檢索到任何從整體角度對FGFR3 進(jìn)行泛癌分析的文獻(xiàn)。本文首次系統(tǒng)地通過生信分析發(fā)現(xiàn)FGFR3 在肝癌、睪丸癌等腫瘤組織中高表達(dá),在肺腺癌、結(jié)腸癌、子宮肉瘤等組織中低表達(dá)。FGFR3 基因在肝癌中高表達(dá),且其高表達(dá)和肝癌的惡性程度密切相關(guān)[17]。數(shù)據(jù)顯示,肝癌是全球第五大癌癥相關(guān)死亡原因,在我國其死亡率位居惡性腫瘤第2 位。全球每年新發(fā)肝癌病例85.4 萬例,中國46.6 萬例,約占全球的55%[18],因而研究與開發(fā)肝癌特異性靶點(diǎn)藥物在我國更加具有重要的意義。FGFR3 通過自分泌或旁分泌機(jī)制促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長,但肝癌中信號通路間常存在廣泛的交叉,F(xiàn)GF 信號通路聯(lián)合其他途徑將是今后研究的重要方向[19]。睪丸癌是一種多發(fā)于青壯年男性的惡性泌尿系統(tǒng)腫瘤,近年來其發(fā)病呈上升的趨勢[20]。生信研究顯示FGFR3 在睪丸癌中表達(dá)顯著高于正常組織,其高表達(dá)與睪丸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。FGFR3 信號在嬰兒期和青春期前的精原細(xì)胞中活躍,并與磷酸化受體向細(xì)胞核的移位有關(guān),F(xiàn)GFR3 信號促進(jìn)精原細(xì)胞存活和增殖,在激活該途徑突變的情況下導(dǎo)致睪丸癌的發(fā)生[21]。由于睪丸腫瘤比較少見,占泌尿系統(tǒng)腫瘤的5%[20],在臨床上關(guān)于睪丸癌的研究鮮有報道,睪丸癌在診斷、治療、預(yù)后等方面缺乏敏感性與特異性的理想腫瘤標(biāo)志物,因此,利用生物信息學(xué)手段,尋找特異性較高的睪丸癌標(biāo)志物具有重要的臨床意義,F(xiàn)GFR3 可能成為睪丸癌新的預(yù)后標(biāo)志物及診療的潛在靶點(diǎn)。已有文獻(xiàn)證實(shí),F(xiàn)GFR3 基因是肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物,F(xiàn)GFR3 基因通過參與RAS/RAF/MEK/MAPK途徑及促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移[22]。中國每年預(yù)計新增肺癌病例約70 萬,新增肺癌死亡病例約40 萬[23]。近期研究表明FGFR3 基因沉
默介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶9 下調(diào)可明顯抑制肺癌細(xì)胞A549 的侵襲能力[24]。生信分析發(fā)現(xiàn)FGFR3高表達(dá)與肺癌患者OS、PPS、FP 預(yù)后不良有關(guān),表明FGFR3 可能成為肺癌新的診療靶點(diǎn)和有效分子預(yù)后標(biāo)志物。FGFR3 在結(jié)腸癌中低表達(dá),是重要的腫瘤負(fù)調(diào)節(jié)因子。結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一,調(diào)查顯示2021 年結(jié)腸癌為全球癌癥死亡的主要原因[25]。研究表明FGFR3 表達(dá)抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,通過阻斷FGFR3-IIIc 信號傳導(dǎo)促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[26]。表明FGFR3 有望成為治療結(jié)腸癌的潛在靶點(diǎn),可能是結(jié)腸癌預(yù)后的重要分子標(biāo)志物。
惡性腫瘤的最大標(biāo)志是不受控制的細(xì)胞增殖,酪氨酸激酶在增殖信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)上有重要作用,當(dāng)它由于體內(nèi)突變使得調(diào)節(jié)異常時,可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。以往人們對FGFR3 突變的研究主要圍繞骨發(fā)育相關(guān)的人類遺傳病,如FGFR3 特殊位點(diǎn)突變導(dǎo)致軟骨發(fā)育不良[27]。近年來國外研究表明,F(xiàn)GFR 作為酪氨酸家族的一員,證實(shí)與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[28],尤其在膀胱癌中。生信分析觀察到,F(xiàn)GFR3 最主要的變異類型是錯義突變,在膀胱尿路上皮癌中突變頻率最高(>18.73%),F(xiàn)GFR3 的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌患者的腫瘤突變負(fù)荷具有相關(guān)性,并且與大多數(shù)免疫點(diǎn)基因呈負(fù)相關(guān)。膀胱癌是發(fā)病率較高的癌癥類型[29],已有實(shí)驗(yàn)證實(shí),F(xiàn)GFR3 突變與膀胱癌預(yù)后差有關(guān)[30],F(xiàn)GFR3 突變能預(yù)測肌層浸潤性膀胱癌術(shù)前新輔助化療的療效[31],說明FGFR3 是膀胱癌重要的治療和預(yù)后分析輔助標(biāo)志物。分析發(fā)現(xiàn)FGFR3 在子宮肉瘤中的變異頻率同樣較高(>15.79%),F(xiàn)GFR3 在子宮肉瘤中低表達(dá),并且其擴(kuò)增與子宮肉瘤預(yù)后差有關(guān)。子宮肉瘤是一類惡性間葉組織源性腫瘤,預(yù)后較差[32],研究證實(shí),RB1、TP53 和PTEN 是子宮肉瘤的重要分子標(biāo)記物,子宮平滑肌肉瘤患者中TP53 突變的頻率為24%~30%,PTEN 突變的頻率為42%~58%[33]。因此FGFR3 也可能成為子宮肉瘤的新的診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物,這需要在前瞻性的臨床試驗(yàn)中加以評估。
阻斷免疫檢查點(diǎn)途徑是腫瘤免疫的有效措施,分析發(fā)現(xiàn),在膀胱尿路上皮癌、結(jié)腸癌和睪丸癌中FGFR3 高表達(dá)與絕大部分檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān),表明FGFR3 可能參與多種腫瘤的免疫調(diào)節(jié)。這些檢查點(diǎn)基因的上調(diào)可能與FGFR3誘導(dǎo)MAPK/ERK 通路,引起的免疫細(xì)胞分化和極化有關(guān)。在結(jié)腸癌、睪丸癌中FGFR3 表達(dá)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的免疫滲透水平呈負(fù)相關(guān)。因此,F(xiàn)GFR3 不僅是腫瘤潛在的預(yù)后預(yù)測因子,還可能是重要的腫瘤免疫調(diào)節(jié)因子。
綜上所述,F(xiàn)GFR3 的靶向免疫治療研究尚處于初級階段,很多問題仍然存在,如某些突變使得酪氨酸激酶耐藥性的出現(xiàn)及MAPK/ERK 信號網(wǎng)絡(luò)的代償性作用,均可使FGFR3 的分子靶向治療出現(xiàn)阻礙。因此,以FGFR3 為靶向的腫瘤基因治療在臨床上的應(yīng)用價值尚待探索。通過FGFR3 的泛癌分析,有助于從臨床角度理解FGFR3 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,為臨床診斷治療提供新的思路。