楊 洋 艾 群 胡旭陽(yáng) 石露露 胡 欣△

人類醫(yī)療水平及疾病防控認(rèn)知盡管已有了極大提升,但惡性腫瘤依舊是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率和高病死率的重要因素。長(zhǎng)期以來(lái),化療在惡性腫瘤西醫(yī)的治療中發(fā)揮著核心作用[1]。但化療在提高癌癥患者生存期的同時(shí),帶來(lái)的不良反應(yīng)對(duì)患者的生理、心理都存在著短暫或長(zhǎng)久的影響。其中,由于骨髓對(duì)化療高度敏感,骨髓抑制也就成了化療中一個(gè)不可忽視的問題。化療后骨髓抑制以白細(xì)胞減少最為明顯和常見,可導(dǎo)致化療藥物減量、化療延遲甚至終止,最終影響化療效果和預(yù)后;也可能增加患者感染的風(fēng)險(xiǎn),而并發(fā)感染會(huì)導(dǎo)致額外醫(yī)療,甚至造成患者死亡。

rhG-CSF類藥物的治療效果較好,但因其使用受限于醫(yī)保政策,并且藥價(jià)較昂貴,很大程度上限制了臨床應(yīng)用[2]。該藥物維持時(shí)間短,并且在化療過(guò)程中,可能導(dǎo)致患者發(fā)生發(fā)熱或骨骼疼痛等不良反應(yīng),甚至使骨髓抑制程度加重[3]。面對(duì)這些問題,中醫(yī)藥作為中國(guó)的特色治療手段,在防治化療后白細(xì)胞減少方面被證實(shí)確臨床療效顯著且穩(wěn)定[4]。胡欣主任倡導(dǎo)零毒抗腫瘤,個(gè)體化治療的理念,在減少腫瘤治療的不良反應(yīng),充分發(fā)揮中醫(yī)藥抗腫瘤優(yōu)勢(shì)。從而以健脾益腎,補(bǔ)氣養(yǎng)血為理論基礎(chǔ),自擬升白經(jīng)驗(yàn)方:黃芪30 g,黨參15 g,茯苓15 g,知母15 g,骨碎補(bǔ)30 g,補(bǔ)骨脂30 g。具有旺生血之源、直補(bǔ)氣血的作用,能較好地升高人體白細(xì)胞。但該方的藥效機(jī)制尚不明確,因此借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[5], 通過(guò)多分子藥物協(xié)同作用于人體的機(jī)制,系統(tǒng)綜合地觀察升白方防治化療后白細(xì)胞減少這一疾病網(wǎng)絡(luò)的作用靶點(diǎn)及通路,為臨床應(yīng)用及日后的基礎(chǔ)研究奠定了一定的理論來(lái)源。

1 資料與方法

1.1 篩選活性成分和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)選用TCMSP平臺(tái)[6],分別以黃芪、茯苓、黨參、知母、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索以獲取相關(guān)化合物信息,篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18[7]。并依據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn),整理出各味中藥未檢索到的有效成分進(jìn)行補(bǔ)充。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)并利用VLOOKUP函數(shù),將篩選出的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名。

1.2 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)依據(jù)六味中藥及篩選出的相關(guān)活性成分和靶點(diǎn),制作相應(yīng)的“Network”及“Type”Excel文件,并依次錄入Cytoscape 3.7.0軟件[8]進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,以便于研究活性成分與靶點(diǎn)及其之間的關(guān)系。

1.3 白細(xì)胞減少癥靶點(diǎn)檢索Genecards疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)[9]中以“Neutropenia”“Leukopenia”“Leucopenia”“Leukocytopenia”為檢索關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選,將各結(jié)果匯總后刪去重復(fù)靶點(diǎn),并通過(guò)Uniprot對(duì)獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)獲取在Cytoscape 3.7.0的插件BisoGenet內(nèi),先后導(dǎo)入升白方活性成分靶點(diǎn)和白細(xì)胞減少癥靶點(diǎn),共生成2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò),通過(guò)提取生成1個(gè)交集網(wǎng)絡(luò),對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行CytoNCA[10]分析,篩選計(jì)算所得到的結(jié)果后得到核心靶點(diǎn)。

1.5 通路富集分析將篩選得到的核心靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)[11],分別采取GO及KEGG分析,在保存對(duì)應(yīng)結(jié)果后,通過(guò)Bioinformatics在線網(wǎng)站對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對(duì)接操作選擇升白方中活性成分排名的前3個(gè)與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證2者間的結(jié)合潛力。在RCSB[12]數(shù)據(jù)庫(kù)中保存靶點(diǎn)蛋白的三維晶體并在TCMSP中下載活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu),運(yùn)用Autodock[13]進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)操作。其中的對(duì)接分?jǐn)?shù)<-4.25 kcal/mol被認(rèn)為化合物與目標(biāo)靶點(diǎn)間有結(jié)合活性;<-5.0 kcal/mol表明2者相互作用良好;<-7.0 kcal/mol表示結(jié)合活性強(qiáng)烈[14]。

2 結(jié)果

2.1 獲取升白方活性成分及靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中,獲取升白方89個(gè)主要活性成分、207個(gè)相應(yīng)靶點(diǎn);根據(jù)查詢到的文獻(xiàn)對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行補(bǔ)充,獲得18個(gè)有效成分,174個(gè)靶點(diǎn)。將方中六味中藥合并后,刪除重復(fù)以及未找到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分,共篩選得到有效成分70個(gè)。匯總靶點(diǎn)并剔除重復(fù)項(xiàng),共獲得278個(gè)。

2.2 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行升白方活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制,并對(duì)所得的網(wǎng)絡(luò)圖形加以說(shuō)明,存在節(jié)點(diǎn)356個(gè)和關(guān)系1314條,Degree排名前3位有效成分分別是山奈酚、槲皮素和木犀草素。見圖1。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點(diǎn)檢索檢索Genecards疾病數(shù)據(jù)庫(kù),經(jīng)篩選、去除重復(fù)值后得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)589個(gè)。分別將藥物與疾病靶點(diǎn)上傳至Excel表格,利用“開始”菜單中的“格式條件”選項(xiàng)獲取2列靶點(diǎn)的重復(fù)值,從而獲知藥物與疾病交集靶點(diǎn)為49個(gè)。

2.4 PPI構(gòu)建及核心靶點(diǎn)獲取采用Cytoscape軟件分別構(gòu)建藥物與疾病的PPI網(wǎng)絡(luò),對(duì)其構(gòu)建的結(jié)果加以說(shuō)明:7363個(gè)靶點(diǎn)可與升白方中潛在靶點(diǎn)產(chǎn)生間接或直接作用,可達(dá)175250種相互關(guān)系;有7830個(gè)靶點(diǎn)可與白細(xì)胞減少癥產(chǎn)生間接或者直接的作用,可達(dá)185467種相互聯(lián)系。隨后構(gòu)建二者PPI網(wǎng)絡(luò)的交集,并計(jì)算交集PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)屬性值,分別以“連接度中心性>66”“連接度中心性>136、介度中心性>555.328、緊密度中心性>0.501”為條件,進(jìn)行2次篩選,共獲得209個(gè)核心靶點(diǎn)。

2.5 通路富集分析可視化將上述209個(gè)核心靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái),進(jìn)行基因富集分析,選擇前20條結(jié)果進(jìn)行可視化處理。使用Bioinformatics在線網(wǎng)站將生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)的結(jié)果以及KEGG通路的結(jié)果繪制成圖。見圖2、圖3。

2.6 分子對(duì)接將排名前3的潛在有效成分分別與5個(gè)核心靶點(diǎn)MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1進(jìn)行對(duì)接,得到15組配體與受體互作結(jié)果(見圖4)。研究顯示對(duì)接分?jǐn)?shù)均小于4.25 kcal·mol,這表明升白方的化合物與目標(biāo)靶點(diǎn)間均具有結(jié)合活性。其中FN1-木犀草素、TP53-木犀草素、TP53-山奈酚對(duì)接分值小于7.0 kcal·mol,提示其具有強(qiáng)烈結(jié)合能力。分子對(duì)接結(jié)果為升白方活性成分通過(guò)調(diào)節(jié)核心靶點(diǎn)以防治化療后白細(xì)胞減少提供了證據(jù),也為今后臨床用藥指導(dǎo)及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的設(shè)計(jì)提供了數(shù)據(jù)支持。

圖2 GO富集分析通路

圖3 KEGG富集分析通路

3 討論

化療藥物屬于大毒之品,其剛猛的藥性不僅會(huì)耗傷體內(nèi)氣血,還會(huì)擾亂陰陽(yáng)平衡[15]造成五臟功能失調(diào)。依據(jù)化療后所表現(xiàn)的癥狀,屬中醫(yī)學(xué)“血虛、虛勞”等病證范疇?！捌榘俸≈?腎為性命之根”,在虛勞的治療中脾、腎尤為重要,因此防治化療后白細(xì)胞減少也當(dāng)以調(diào)理脾、腎為先。升白方可補(bǔ)氣養(yǎng)血、健脾益腎,使受化療藥物所抑制的骨髓精血復(fù)生。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,探討其發(fā)揮升白作用的潛在機(jī)制,并運(yùn)用分子對(duì)接驗(yàn)證核心靶點(diǎn)與活性成分的作用關(guān)系,發(fā)現(xiàn)具有良好的活性結(jié)合能力,也側(cè)面驗(yàn)證了預(yù)測(cè)結(jié)果有一定可靠性。

排名第一的有效成分是山奈酚,存在于骨碎補(bǔ)、知母和黃芪中。該成分具有多種藥理活性,包括抗腫瘤、抗癌活性、抗炎、抗氧化等,目前正被應(yīng)用于癌癥化療中[16]。該成分既可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞周期停滯在G2/M期,從而阻止細(xì)胞遷移和侵襲,又可以激活宿主的免疫功能,抑制腫瘤血管生長(zhǎng),增加其他抗癌藥物的敏感性[16,17]。槲皮素可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT途徑來(lái)調(diào)控依賴EPO的紅細(xì)胞發(fā)育早期階段。故推測(cè)槲皮素在造血過(guò)程中發(fā)揮了作用,如白細(xì)胞的形成[18]。木犀草素在雌激素受體拮抗劑ICI182,780和ER陰性的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453存在的情況下,可以減輕阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[19]。間接對(duì)白細(xì)胞減少起到了防治的作用。

經(jīng)篩選獲得209個(gè)潛在核心靶點(diǎn),其中較為重要的有MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1。MCM2具有促凋亡作用。MDS骨髓中MCM2比例較高,且與白細(xì)胞減少程度相關(guān)[20]。TP53是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和造血干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)因子[21]。而50%的癌癥病例攜帶P53突變,另一半通常存在P53途徑缺陷[22],因此通過(guò)激活P53阻斷IL-1途徑,可成功地緩解化療導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞減少癥[23]。FN是細(xì)胞外基質(zhì)中重要的黏附分子,參與造血細(xì)胞的分化和增殖[24]。ESR1是雌激素的受體之一,參與了造血、骨骼以及免疫系統(tǒng)的表達(dá)[25]。研究表示,ESR1可調(diào)節(jié)先天免疫信號(hào)通路和免疫細(xì)胞的發(fā)育[26]。綜上所述,升白方通過(guò)多靶點(diǎn)對(duì)化療后白細(xì)胞減少起到防治作用。

升白方防治化療后白細(xì)胞減少涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞周期過(guò)程的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程等多個(gè)生物進(jìn)程。例如 mTORC1整合了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外主要的信號(hào)通路,其中包括細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。這種信號(hào)整合可以很好地調(diào)控合成代謝、分解代謝過(guò)程,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和體內(nèi)平衡[27]。但在癌癥中mTORC1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)常常發(fā)生失調(diào)[28]。由此可推測(cè),升白方通過(guò)對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)有可能通過(guò)糾正信號(hào)傳導(dǎo),從而促進(jìn)化療后白細(xì)胞的修復(fù)和生成。

從KEGG的結(jié)果得知,升白方可能通過(guò)干預(yù)病毒致癌、癌癥中的微核糖核酸、細(xì)胞周期、剪接體、HIF-1信號(hào)通路等。升白方可能通過(guò)干預(yù)病毒致癌通路受益于癌細(xì)胞的衰老,輔助抗癌,對(duì)化療起到減毒增效的作用。剪接體對(duì)前體mRNA成熟和基因表達(dá)至關(guān)重要[29]。在造血干細(xì)胞形成過(guò)程中,精心控制的RNA剪接決定了細(xì)胞的命運(yùn)[30]。剪接體的成分耗盡與DNA損傷和細(xì)胞周期缺陷的增加有關(guān),而核心剪接體成分的部分消耗導(dǎo)致細(xì)胞周期后期階段的缺陷(G2和有絲分裂),完全耗盡則會(huì)導(dǎo)致G1的早期細(xì)胞周期停滯[31]。因此,細(xì)胞周期停滯可由于剪接體和細(xì)胞周期通路的破壞所致。細(xì)胞周期涉及許多生命過(guò)程,與真核細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖以及疾病的發(fā)生密切相關(guān)[32]。故推斷可能通過(guò)干預(yù)上述2條通路,升白方對(duì)白細(xì)胞中的前體mRNA起到了調(diào)控作用。成骨細(xì)胞是骨骼造血微環(huán)境的重要組成部分,HIF信號(hào)通路對(duì)造血干細(xì)胞(HSC)的維持至關(guān)重要,有研究證明了成骨細(xì)胞中HIF信號(hào)通路傳導(dǎo)的分子作用可以靶向地升高局部造血微環(huán)境中的HSC[33]。因此,升白方能通過(guò)干預(yù)HIF信號(hào)通路恢復(fù)HSC的功能增加白細(xì)胞數(shù)量。

綜上所述,升白方主要通過(guò)70個(gè)活性成分作用于209個(gè)核心靶點(diǎn),涉及147條關(guān)鍵通路來(lái)發(fā)揮作用,印證了升白方根據(jù)多靶點(diǎn)、多通路防治化療后白細(xì)胞減少的特征。后續(xù)將著力設(shè)計(jì)完善的實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證其具體作用機(jī)制及靶點(diǎn)。