張涵雪，張 達(dá)，胡建明，湯開磊，杜光輝

(云南大學(xué) 資源植物研究院，云南 昆明 650500)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）是一種高效的、可用于檢測(cè)基因在植物體內(nèi)表達(dá)量的生物技術(shù)，具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[1].理想的內(nèi)參基因在不同植物體的各細(xì)胞、組織、器官以及生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段表達(dá)都是穩(wěn)定的，但試驗(yàn)證明qRT-PCR 的結(jié)果受到許多因素的影響，如RNA 的濃度、RNA 的質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)的效率以及參考基因的選擇等[1-2].許多研究結(jié)果表明不同樣品、組織、處理?xiàng)l件等都會(huì)影響基因的表達(dá)[3-6]，因此，為了使qRT-PCR 分析結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，在對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析時(shí)，需要根據(jù)具體的試驗(yàn)條件，篩選適宜的內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以減少實(shí)驗(yàn)誤差.

大麻(Cannabis sativaL.)是一年生草本植物，隸屬大麻科(Cannabaceae)大麻屬(Cannabis)，又稱火麻、漢麻等.工業(yè)大麻是指植株群體花期頂部葉片及花穗干物質(zhì)中四氫大麻酚(THC)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3%的大麻品種類型[7].工業(yè)大麻具有多方面的利用價(jià)值，包括傳統(tǒng)的纖維和種子的加工利用[8-9]，對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)[10-13]，以及對(duì)含有的許多酚類、萜類和黃酮類等藥用成分的開發(fā)[14-16].為了不與糧食爭(zhēng)地，工業(yè)大麻一般種植在鹽堿地、山坡地、冬閑地等非主要良地，易受到鹽堿、干旱、低溫等非生物脅迫的影響.干旱、鹽堿等因素會(huì)使植物細(xì)胞水分虧缺造成滲透脅迫，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育尤其是種子萌發(fā)產(chǎn)生不利影響[17-18].為了解決以上非生物脅迫對(duì)工業(yè)大麻種植造成的限制，本課題組一直致力于滲透脅迫下工業(yè)大麻種子萌發(fā)的機(jī)制研究，發(fā)掘工業(yè)大麻中抗逆相關(guān)的基因.以上工作的前提，需要對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析，而穩(wěn)定可靠的內(nèi)參基因的選擇是前期條件.前人對(duì)大麻內(nèi)參基因的篩選研究，主要集中在纖維用大麻莖中木質(zhì)素的生物合成內(nèi)參基因的篩選[19]，野生和栽培大麻不同發(fā)育階段和不同器官中的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性的確定[20].對(duì)于工業(yè)大麻種子萌發(fā)及滲透脅迫下內(nèi)參基因篩選的研究還存在空白，因此，開展工業(yè)大麻種子萌發(fā)與滲透脅迫下的內(nèi)參基因篩選研究，對(duì)后期相關(guān)的基礎(chǔ)研究具有重要意義.

本研究以‘云麻7 號(hào)’為試驗(yàn)材料，通過設(shè)置正常萌發(fā)處理和滲透脅迫下萌發(fā)處理，利用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)候選內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)量，篩選出在本研究中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因.研究結(jié)果將為后續(xù)開展工業(yè)大麻種子萌發(fā)及其響應(yīng)滲透脅迫相關(guān)的分子機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)所用的‘云麻7 號(hào)’種子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供.挑選顆粒飽滿、大小一致的種子，70%酒精進(jìn)行表面消毒，蒸餾水沖洗干凈晾干備用.在洗凈、烘干、鋪好濾紙的9 cm 培養(yǎng)皿中，分別加入8 mL 的蒸餾水和20% PEG[21]模擬正常萌發(fā)和滲透脅迫.每個(gè)培養(yǎng)皿30 粒種子，均勻擺放在充分浸潤(rùn)的濾紙上，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).首先暗培養(yǎng)3 d，然后在光照12 h、溫度為25 ℃，黑暗12 h、溫度為20 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d.分別于培養(yǎng)3、5 d 和7 d 后取樣，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗.取樣后，迅速放入液氮中，取出后保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用.

1.2 RNA 提取和cDNA 合成稱取50～100 g 樣品，用液氮將其研磨至粉末狀，使用TransZol Up Plus RNA Kit 試劑盒(全式金生物有限公司)進(jìn)行RNA 提取.RNA 的完整性在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，其濃度及質(zhì)量則利用NanoReady F-1100 進(jìn)行測(cè)定.cDNA 反轉(zhuǎn)錄使用MonScript? RTIII Super Mix with dsDNase(Two-Step)試劑盒(莫納生物科技有限公司)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，于-20 ℃冰箱保存.

1.3 引物合成根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的大麻內(nèi)參基因研究的結(jié)果[19-20,22]，選取鈣依賴蛋白激酶基因(calcium-dependent protein kinase,CDPK)、肌動(dòng)蛋白基因(actin,ACT)、網(wǎng)格蛋白基因(Clathrin)、真核生物翻譯起始因子基因4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(elongation factor 1-α,EF1α)、蛋白磷酸酶2A 基因(protein phosphatase 2A,PP2A)、液泡膜內(nèi)在蛋白基因(tonoplast intrinsic protein 41,TIP41)、微管蛋白基因(β-tubulin,TUB)、多聚泛素酶基因(ubiquitinprotein ligase,UBQ)、DAHP 合成酶同工酶基因(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase isoenzyme 2,DHS2)10 個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因(表1)，引物合成交由昆明擎科生物科技有限公司完成.

表1 工業(yè)大麻10 個(gè)候選內(nèi)參基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of 10 candidate reference genes in industrial hemp

1.4 qRT-PCR 反應(yīng)條件使用MonAmpTMSYBR?Greeb qPCR Mix(Low Rox)試劑盒(莫納生物科技有限公司)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex)上對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè).反應(yīng)體系20 μL，包括MonAmpTMSYBR?Greeb qPCR Mix10 μL，cDNA 溶液1 μL，正向引物和反向引物各0.4 μL 以及Nuclease-Free Water 8.2 μL.擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 秒，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 次重復(fù).溶解曲線使用儀器默認(rèn)采集程序.

1.5 引物特異性鑒定與擴(kuò)增效率計(jì)算將‘云麻7 號(hào)’種子正常萌發(fā)與滲透脅迫處理下萌發(fā)的樣品cDNA 進(jìn)行等量混合，混合后的原液再稀釋51、52、53、54倍，加上不稀釋共設(shè)置5 個(gè)梯度，進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng).標(biāo)準(zhǔn)曲線是以已知的連續(xù)稀釋濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度的Ct（cycle threshold）值作為縱坐標(biāo)，從而獲得對(duì)應(yīng)的斜率(k)及其線性相關(guān)系數(shù)(R2)，擴(kuò)增效率(E)則由公式E(%)=10-1/k-1 計(jì)算得出.

利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)10 個(gè)內(nèi)參基因qRT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行初步檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合溶解曲線來確定引物的特異性.對(duì)特異性較好的內(nèi)參基因引物進(jìn)行后續(xù)qRT-PCR 反應(yīng)，條件同1.4 節(jié).

1.6 數(shù)據(jù)處理與內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)相關(guān)數(shù)據(jù)利用Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和整理.分別使用3 種不同軟件[23]（geNorm、NorFinder 和BestKeeper）對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，得到在正常萌發(fā)與滲透脅迫處理下萌發(fā)各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性.最后，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性通過在線軟件RefFinder進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).通過geNorm 和NorFinder 軟件進(jìn)行分析時(shí)，先找到該基因在所有樣品中最小的Ct 值，再用其他樣品的Ct 值減去最低Ct 值，從而得到ΔCt 值，利用Excel 中的函數(shù)計(jì)算出相應(yīng)樣品和基因的2-ΔCt值即為相對(duì)表達(dá)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 質(zhì)量檢測(cè)使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)提取的6 組不同處理與時(shí)間工業(yè)大麻萌發(fā)幼苗的總RNA(圖1)，28S 和18S 條帶清晰明亮，且28S 的亮度約等于18S 兩倍，結(jié)果說明RNA 未出現(xiàn)降解，完整性較好.使用NanoReady 2000 進(jìn)行純度檢測(cè)，A260/A280值在1.9～2.2 之間，表示RNA 純度較高，無明顯蛋白質(zhì)、多糖等污染，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

圖1 不同萌發(fā)時(shí)間工業(yè)大麻幼苗總RNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection of total RNA in industrial hemp seedling at different germination times

2.2 內(nèi)參基因引物篩選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果表明，候選內(nèi)參基因中除了EF1α擴(kuò)增效率為114.88%，高于110%，其余都在90%～110%之間.所有候選內(nèi)參基因線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.995 9～0.999 9，表明以上引物具有很強(qiáng)的特異性和良好的擴(kuò)增效率(表2).其中，DHS2基因qRT-PCR 結(jié)果不具有線性關(guān)系，剔除此候選內(nèi)參基因.內(nèi)參基因引物特異性的電泳檢測(cè)結(jié)果表明，CDPK基因在500 bp 附近還出現(xiàn)1 條條帶，特異性不好，剔除此內(nèi)參基因.其余8 個(gè)內(nèi)參基因的目標(biāo)擴(kuò)增條帶大小正確，無其它非特異性條帶(圖2)，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

圖2 工業(yè)大麻9 個(gè)候選內(nèi)參基因熒光定量PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoresis detection of qRT-PCR amplification products of 9 candidate reference genes in industrial hemp

表2 候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)Tab.2 The amplification efficiency and correlation coefficient of candidate reference genes

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)分析根據(jù)qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果，對(duì)8 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì).從整體上看，所有內(nèi)參基因的Ct 值介于19～29 之間(圖3)，范圍較廣.其中，表達(dá)水平受處理?xiàng)l件與時(shí)間影響較大的為Actin基因，最大和最小值之間相差3.64.Clathrin和TUB的Ct 值最大值和最小值差值分別為2.52 和2.21.eIF4E、TIP41、UBQ、EF1α、PP2A在所有樣品中的穩(wěn)定性較好，最大值和最小值差值在1.21～1.53 之間.

圖3 工業(yè)大麻8 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct 值Fig.3 The Ct values of 8 candidate reference genes in industrial hemp

2.4 工業(yè)大麻種子萌發(fā)及其在滲透脅迫下候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

2.4.1 geNorm 軟件分析 geNorm 軟件以M=1.5為默認(rèn)閾值，M值越小，越穩(wěn)定，當(dāng)M＞1.5 時(shí)，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定.從表3 可以看出，8 個(gè)內(nèi)參基因的M值均小于1.5，均可能是適合的內(nèi)參基因.其中，在工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)階段，PP2A與TIP41基因表達(dá)穩(wěn)定性最好，Actin、TUB表達(dá)穩(wěn)定性最低.在滲透脅迫處理下萌發(fā)，eIF4E和UBQ基因表達(dá)穩(wěn)定性最好，TUB、Clathrin表達(dá)穩(wěn)定性最差.綜合兩種處理，eIF4E、EF1α基因表達(dá)穩(wěn)定性最好，TUB、Actin表達(dá)穩(wěn)定性最差.

表3 geNorm 軟件分析內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定性值(M)Tab.3 Average expression stability of reference genes calculated by geNorm

同時(shí)，根據(jù)geNorm 軟件分析內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異值，確定該試驗(yàn)所需要的最適內(nèi)參基因數(shù)目，當(dāng)Vn/n+1＜1.5，則最適數(shù)目為n；當(dāng)Vn/n+1＞1.5，則最適數(shù)目為n+1.分析結(jié)果表明，工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)或滲透脅迫處理下萌發(fā)配對(duì)差異值Vn/n+1均小于0.15，說明種子正常萌發(fā)或滲透脅迫下萌發(fā)選擇2 個(gè)內(nèi)參基因就可滿足試驗(yàn)需求，結(jié)果穩(wěn)定可靠(表4).

表4 geNorm 軟件分析內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異值(Vn/n+1)Tab.4 Pairwise variations of normalization factors(Vn/n+1) of reference genes calculated by geNorm

2.4.2 NormFinder 軟件分 析 NormFinder 軟 件是根據(jù)組內(nèi)方差和組間方差對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，給出每個(gè)內(nèi)參基因相應(yīng)的表達(dá)穩(wěn)定值(S)，S值越低，則表達(dá)越穩(wěn)定.評(píng)估結(jié)果表明(表5)，8 個(gè)候選內(nèi)參基因在工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)下eIF4E最穩(wěn)定，而滲透脅迫處理下萌發(fā)UBQ最穩(wěn)定，綜合比較兩者得出eIF4E內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定.

表5 基于NormFinder 和Bestkeeper 軟件對(duì)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增效率及表達(dá)穩(wěn)定性的分析Tab.5 Analysis of amplification efficiency and expression stability of candidate reference genes by NormFinder and Bestkeeper softwares

2.4.3 BestKeeper 軟件分析 BestKeeper 軟件判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性是通過計(jì)算候選內(nèi)參基因的Ct 值，獲得其標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異相關(guān)系數(shù)(CV).變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差越低，則內(nèi)參基因就越穩(wěn)定，反之，則越不穩(wěn)定.由BestKeeper 軟件分析可知(表5)，在工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)中，UBQ、TIP41內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定.在滲透脅迫處理下萌發(fā)，UBQ、EF1α內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定.綜合兩組結(jié)果，EF1α、eIF4E內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定.

2.4.4 RifFinder 軟件的綜合評(píng)價(jià) RifFinder 分析工具根據(jù)每種軟件的分析結(jié)果為單個(gè)基因分配適當(dāng)?shù)臋?quán)重，對(duì)不同軟件的分析結(jié)果進(jìn)行綜合分析.RifFinder 評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，8 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性在工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)處理中的排序 為：PP2A＞TIP41＞eIF4E＞UBQ＞EF1α＞Clathrin＞TUB＞Actin；在滲透脅迫下萌發(fā)處理中的排序?yàn)椋篣BQ＞EF1α＞eIF4E＞PP2A＞TIP41＞Actin＞Clathrin＞TUB；綜合兩組結(jié)果的排序：eIF4E＞EF1α＞TIP41＞UBQ＞PP2A＞Clathrin＞Actin＞TUB.

3 討論

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)早期最關(guān)鍵、最敏感的時(shí)期，容易受到逆境環(huán)境的影響.工業(yè)大麻由于特殊的種植地點(diǎn)，其種子萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育易受到干旱、鹽堿等滲透脅迫的影響.qRT-PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)分析，但選擇表達(dá)穩(wěn)定性高的內(nèi)參基因是其結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ).在關(guān)于滲透脅迫下種子萌發(fā)的研究中，最適內(nèi)參基因的選擇存在較大的差異.在草果(Amomum tsaoko)種子不同休眠解除階段UBCE2為理想內(nèi)參基因[24]；ACT是蜆殼花椒(Zanthoxylum dissitum)種子萌發(fā)時(shí)期最合適的內(nèi)參基因[25]；在低氧條件下水稻(Oryza sativa)萌發(fā)過程中GAPDH被發(fā)現(xiàn)是最適合的參考基因[26]；APM基因在落葉松(Larix kaempferi)不同器官和發(fā)育階段(體細(xì)胞胚胎發(fā)生和種子萌發(fā))中最穩(wěn)定[27]；ACT是芝麻(Sesamum indicum)種子萌發(fā)階段最適合的內(nèi)參基因[28]；藥用植物甘草(Glycyrrhizaspp.)滲透脅迫下葉中表達(dá)最穩(wěn)定的基因?yàn)門IF1，根中為DNAJ[29]；中間錦雞兒(Caragana intermedia)在滲透脅迫下UNK1、UNK2和PP2A在根中表達(dá)最穩(wěn)定，TIP41和PP2A組合在葉中表達(dá)最穩(wěn)定[30]；在干旱等滲透脅迫條件下，EF1α和sec3是馬鈴薯(Solanum tuberosum)中表達(dá)最穩(wěn)定的基因[31]；菠菜(Spinacia oleracea)在PEG 脅迫下ELF1B基因表達(dá)穩(wěn)定性最好[32]；冬瓜(Benincasa hispida)在高溫和干旱脅迫處理下UBQ和TUA表達(dá)穩(wěn)定性最好[33]；干旱和鹽脅迫下野生大麥(Hordeum vulgaressp.Spontaneum)和栽培大麥(Hordeum vulgaressp.Vulgare)葉片中ubiquitin、ACT和ARF1 適宜作為內(nèi)參基因組合進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 研究[34]；多年生黑麥草(Lolium perenne)在干旱、鹽、熱脅迫及ABA 處理下，eIF4A基因表達(dá)穩(wěn)定性最高[35].以上研究說明內(nèi)參基因的選擇隨著物種、組織及處理?xiàng)l件的不同而變化.

據(jù)先前的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究選擇了10 個(gè)候選內(nèi)參基因(CDPK、eIF4E、TIP41、UBQ、EF1α、PP2A、Actin、Clathrin、TUB、DHS2)，研究其在滲透脅迫處理和正常處理下工業(yè)大麻不同萌發(fā)時(shí)間階段中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性在不同的試驗(yàn)處理下會(huì)出現(xiàn)差異.試驗(yàn)中CDPK和DHS2基因在‘云麻7 號(hào)’中的引物特異性較差，其余8 個(gè)候選內(nèi)參基因Ct 值介于19～29 之間，處于正常范圍，滿足試驗(yàn)要求.利用專業(yè)分析軟件(geNorm、NormFinder 和Bestkeeper)對(duì)8 個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于各個(gè)程序的計(jì)算方法原理不同，各軟件得出的穩(wěn)定性結(jié)果存在差異.geNorm軟件分析結(jié)果顯示在不同分組中，內(nèi)參基因的選擇有所差異，但其V2/3值均小于0.15，表明2 個(gè)內(nèi)參基因的組合就可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定歸一化.NormFinder 軟件分析結(jié)果表明，eIF4E是工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)與滲透脅迫下萌發(fā)不同時(shí)間段中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因.BestKeeper 軟件分析結(jié)果也存在差異，可能是由于BestKeeper 軟件是直接對(duì)內(nèi)參基因Ct 值進(jìn)行分析.因此，利用RifFinder 軟件進(jìn)行綜合分析排序，在工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)階段PP2A最穩(wěn)定，滲透脅迫處理下萌發(fā)中UBQ最穩(wěn)定，綜合兩組結(jié)果eIF4E最穩(wěn)定.試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明了，內(nèi)參基因的選擇會(huì)隨著試驗(yàn)條件的變化而變化.

綜上所述，本研究分析了工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)與滲透脅迫處理下不同萌發(fā)時(shí)間段中10 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，最終確定在工業(yè)大麻種子正常萌發(fā)階段，PP2A內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定，在滲透脅迫處理下萌發(fā)中，UBQ內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定，而綜合兩組來看，eIF4E內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定.