李曉川 王朝海 周平 馬維 陳軍 陸燚 吳顯 王宗明 吳瑞 宋治豪 馬杰 付毅

摘要 從馬鈴薯參考基因組中篩選出了433個NBS-LRR類基因，并繪制這些基因在基因組中的分布圖，這些基因的其中一部分成簇分布。馬鈴薯基因組測序協(xié)會（PGSC）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，只有12個NBS-LRR類基因在PGSC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中完全沒有檢測到表達，不同NBS-LRR類基因轉(zhuǎn)錄水平不同，一部分NBS-LRR類基因有較高的生物脅迫和激素刺激應激性。分析了這433個基因的編碼區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，SNP標記作為在高通量測序和生物大數(shù)據(jù)分析中最常使用的遺傳標記，有助于鑒定NBS-LRR基因在不同馬鈴薯品種中的實際抗病性。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯；晚疫?。豢剐曰?/p>

中圖分類號 Q37? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）10-0079-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.017

Abstract In this paper， 433 NBSLRR genes were screened from the Solanum tuberosum reference genome， and the distribution of these genes in the genome were mapped， showing that some of these genes were distributed in clusters. Only 12 NBSLRR genes were not detected in all of the transcriptome analysis data of PGSC. The expression levels of different NBSLRR genes were different， and some NBSLRR genes had higher biological and hormonal stimulation irritability. The single nucleotide polymorphism （SNP） sites in the coding regions of these 433 genes were also analyzed. As the most commonly used genetic markers in highthroughput sequencing and biological big data analysis， SNP markers are helpful for the identification of actual disease resistance of NBSLRR genes in Solanum tuberosum varieties.

Key words Solanum tuberosum;Phytophthora infestans （Mont.） DE Bary;Resistance （R） gene

馬鈴薯（Solanum tuberosum）適應性廣，豐產(chǎn)性好，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟效益高，已成為世界上繼水稻、小麥的第三大糧食作物［1］。但在生產(chǎn)中經(jīng)常受到其第一大病害——晚疫病的危害造成產(chǎn)量嚴重降低。晚疫病是由致病疫霉菌［Phytophthora infestans（Mont.）de Bary.］引起，特別是由于病原菌A2交配型的出現(xiàn)，與原A1交配型有性雜交，發(fā)生變異，導致最初的抗病馬鈴薯品種失去抗性［2-3］。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個馬鈴薯晩疫病抗病基因（R基因），包括克隆自Solanum demissum中，位于第5號染色體上的R1［4］，第4號染色體上的R2［5］，第11號染色體上的R3a［6］和R3b［7］，第9號染色體上的R8［8］；克隆自Solanum bulbocastanum，位于第8號染色體上的Rpi-blb1（RB）［9-10］，第6號染色體上的Rpi-blb2［11］，第9號染色體上的Rpi-blb3和第4號染色體上的Rpi-abpt［5］；來源于Solanum venturii位于第9號染色體上Rpi-vnt1.1、Rpi-vnt1.2和Rpi-vnt1.3［12］；來源于Solanum stoloniferum位于第8號染色體上Rpi-sto1和Rpi-pta1［13-14］；來源于Solanum americanum位于第4號染色體上Rpi-amr3i［15］。已鑒定出的R基因都擁有NBS-LRR（Nucleotidebinding site and leucinerich repeat）結(jié)構(gòu)，因此可以利用基因結(jié)構(gòu)上的保守型從參考基因組中篩選潛在的抗性基因［16-17］。目前已在多個植物的參考基因組中篩選出NBS-LRR類基因，包括重要的作物水稻［18］、小麥［19］、玉米［20］、大豆［21］、棉花［22］、十字花科［23］、黃瓜［24］、模式生物-擬南芥［25］以及茄科植物辣椒、番茄［26］和茄子［27］等。雖然馬鈴薯晩疫病抗病基因能提供抗病性，但單個R基因?qū)霂淼目剐砸妆蛔儺惖闹虏∫呙咕朔?，如將RD基因?qū)攵傻脑耘喾NBiogold，在田間種植不到1年即被晚疫病菌克服［28］，但通常認為引入多個R基因能夠增強晚疫病抗病表現(xiàn)［29］。因此，盡可能多地篩選出晩疫病抗病基因，有助于馬鈴薯晚疫病抗性育種。

高通量測序技術(shù)提高了人們對作物遺傳學的理解。由于普通栽培馬鈴薯基因組是高度雜合的同源4倍體的特性。馬鈴薯基因組測序協(xié)會（potato genome sequencing consortium，PGSC）首先通過對一個純合的雙單倍體（DM1-3 516 R44，DM）馬鈴薯品種測序得到了馬鈴薯參考基因組，參考基因組提供了詳細的馬鈴薯基因座信息，因此可以通過序列比對在參考基因組中查找具有保守序列和結(jié)構(gòu)域的基因［30］。并且利用參考基因組對一個（雜合二倍體RH89-039-16，RH）馬鈴薯品種重測序，基因分型得到了兩者之間的單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）。PGSC還利用參考基因組對DM的16種組織包括：心皮、花瓣、萼片、雄蕊、花、果肉、未成熟果實、成熟果實、葉柄、葉、匍匐莖、未成熟塊莖、成熟塊莖、愈傷組織、根和芽的轉(zhuǎn)錄組，以及11種經(jīng)處理包括：鹽、甘露醇和熱脅迫，4種激素［IAA（吲哚乙酸）、BAP（6-芐基腺嘌呤）、GA3（赤霉酸）和ABA（脫落酸）］處理，4種生物脅迫［接種晚疫病菌、2種誘導植物抗病的因子苯并噻二唑（BTH）和DL-氨基丁酸（BABA）處理以及受傷葉片］后轉(zhuǎn)錄組表達水平的變化情況處理進行了轉(zhuǎn)錄組測序。并且作為對DM轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的補充和對照，PGSC還對雜合二倍體品種RH的花、雄蕊、根、葉、水分脅迫葉、葉柄、莖尖、莖、匍匐莖、未成熟塊莖、成熟塊莖、塊莖髓、塊莖皮、塊莖芽、塊莖皮質(zhì)和整株16種組織的轉(zhuǎn)錄組進行了測序。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)隨后的RNA定量驗證顯示出很高的準確性［30-31］。因此，可以利用R基因的NBS-LRR結(jié)構(gòu)特性，分析馬鈴薯參考基因組種的NBS-LRR類基因，并通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析這些基因在不同組織和處理條件下的表達特性，以及利用基因組序列信息，分析分子標記信息，為鑒定各基因的實際抗病性鑒定打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯NBS-LRR類基因的鑒定

使用BLASTp工具（http：//spuddb.uga.edu/blast.shtml），以期望值（E-value=1）為閾值，用已知的R基因的蛋白序列作為查詢序列，以及隱馬模型（Hidden Markov Model，HMM）［32］，以Pfam：PF00931作為查詢序號，以默認參數(shù)從馬鈴薯參考基因組（V 4.03）中鑒定（http：//spuddb.uga.edu/integrated_searches.shtml）。利用SMART檢索基因的蛋白結(jié)構(gòu)域（http：//smart.emblheidelberg.de/）［33］；以0.9為閾值，利用 COILS 程序檢索基因的CC結(jié)構(gòu)域（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）［34］。基因的氨基酸序列利用Clustal Omega在線服務器進行多序列比對，利用Neighbor-Joining參數(shù)進過計算1 000次生成樹圖（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）。

1.2 馬鈴薯NBS-LRR類基因的表達分析

利用馬鈴薯基因組測序協(xié)會（potato genome sequencing consortium，PGSC）的Illumina RNA 測序數(shù)據(jù)分析NBS-LRR類基因在不同組織和處理方式下的表達模式［30-31］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達豐度用每百萬個映射上的片段數(shù)中映射到外顯子中的每1 000個堿基上的片段個數(shù)（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，F(xiàn)PKM）值表示。對不同組織內(nèi)NBS-LRR類基因表達水平的熱圖（Heat map）進行構(gòu)建時，F(xiàn)PKM 值首先經(jīng)過以2為底數(shù)的對數(shù)進行轉(zhuǎn)化。構(gòu)建生物脅迫以及激素處理時NBS-LRR類基因表達水平變化的熱圖時，首先計算與對照的對比值，以log2比值的相對值≥1確定為差異表達基因［31］。熱圖使用 MeV 4.9.0 軟件進行構(gòu)建［35］。相關(guān)性分析用IBM SPSS Statistics 22 軟件進行（SPSS GmbH Software，Munich，Germany）。

1.3 馬鈴薯NBS-LRR類基因編碼序列的SNP標記分析

NBS-LRR類基因編內(nèi)的SNP標記信息來源于以DM為參考基因組，RH重測序信息，Sol-CAP對于6個常見栽培種的轉(zhuǎn)錄組測序信息，以及對大西洋（Atlantic）和Superior的重測序信息［6，36］。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯NBS-LRR類基因的鑒定

從馬鈴薯參考基因組中鑒定得到433個NBS-LRR類基因，其中366個基因能夠定位到12個染色體中。在這些基因中的142個基因間的距離小于1.0 mb，其中44個基因間的距離小于10 kb。21個基因定位于第4染色體上2.0 mb的染色體區(qū)域，12個基因定位于第5染色體上1.5 mb的染色體區(qū)域，22個基因定位于第11染色體上2.0 mb的染色體區(qū)域，說明這些基因的其中一部分成簇分布（圖1）。433個NBS-LRR類基因中的103個基因蛋白編碼序列的N端含有一個CC（coiled-coil）結(jié)構(gòu)域，這與已發(fā)現(xiàn)的晚疫病抗性基因的CC-NBS-LRR蛋白結(jié)構(gòu)域相同（圖2）。進一步利用已知的R基因和CC-NBS-LRR基因的氨基酸序列進行比對并繪制系統(tǒng)進化樹。進化樹分成2個部分（黑色和紅色），其中黑色部分沒有已克隆的R基因。紅色部分的進化樹又可分成2個部分（基因編號突出顯示和未突出顯示的部分），這2部分內(nèi)部又可分成2～3個小組（基因編號不同顏色字體顯示）。Rpi-blb1（RB）與15個CC-NBS-LRR基因聚集成一個小組，R3a和R3b 與19個CC-NBS-LRR基因親緣關(guān)系較近，Rpi-amr3i與14個CC-NBS-LRR基因聚集成一個小組，Rpi-vnt1.1、Rpi-vnt1.2和Rpi-vnt1.3與17個CC-NBS-LRR基因聚集成一個小組，其他7個已克隆的R基因與23個CC-NBS-LRR基因親緣關(guān)系較近（圖3）。

2.2 馬鈴薯NBS-LRR類基因的表達分析

利用PGSC在馬鈴薯不同器官和發(fā)育階段以及在脅迫處理和激素刺激時的不同轉(zhuǎn)錄組測序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，包括：DM的16種組織內(nèi)基因的表達水平，DM的11種包括鹽脅迫、激素刺激、生物脅迫處理后轉(zhuǎn)錄組表達水平的變化情況，以及以DM為參考基因組，RH的16種組織內(nèi)基因的表達模式。分析NBS-LRR類基因的表達。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，只有12個NBS-LRR類基因在所有的組織或處理中完全沒有檢測到表達（圖2）。

PGSC分別在DM和RH的16種不同組織中進行了轉(zhuǎn)錄組分析，提取了其中易受晚疫病侵染影響的組織的轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)，進一步分析了433個NBS-LRR類基因在不同組織和樣品間的表達模式。在DM的6種組織中（根、葉、葉柄、匍匐莖、不成熟塊莖和成熟塊莖），433個NBS-LRR類基因，表達量FPKM均值最大的10個基因分別是PGSC0003DMG400007999、PGSC0003DMG400009635、PGSC0003DMG400007469、PGSC0003DMG400003527、PGSC0003DMG402018257、PGSC0003DMG400018464、PGSC0003DMG400031405、PGSC0003DMG400020587、PGSC0003DMG400033159和PGSC0003DMG400007471，其表達量的FPKM值在52.67～11.60。有57個基因在DM的6種組織中沒有檢測到表達，208個基因在這6種組織中至少有1種組織中沒有檢測到表達。376個基因在至少DM的6種組織之一中檢測到表達，反映表達量在6種組織間離散程度的標準差（σ），最大為34.13，平均為1.76。在RH的8種組織中（根、葉、葉柄、植株、莖、匍匐莖、不成熟塊莖和成熟塊莖），433個之間NBS-LRR類基因，表達量均值最大的10個基因分別是PGSC0003DMG400007999、PGSC0003DMG400007469、PGSC0003DMG400031405、PGSC0003DMG400013490、PGSC0003DMG400029505、PGSC0003DMG400005335、PGSC0003DMG400007462、PGSC0003DMG400018428、PGSC0003DMG400018429和PGSC0003DMG400026187，其表達量的FPKM值在60.27～12.58。有32個基因在RH的8種組織中沒有檢測到表達，179個基因在這8種組織中至少有1種組織中沒有檢測到表達。401個基因在至少RH的8種組織之一檢測到表達，反映表達量FPKM值在8種組織間離散程度的標準差（σ），最大為62.45，平均為1.57。結(jié)果顯示，相同的NBS-LRR類基因在DM或RH的不同組織間的表達水平有一定的差異，但整體上差異并不明顯，即組織特異性不明顯。在DM和RH組織之間，相同基因表達量的FPKM值均值，其中在DM中大于RH中的基因有126個，在RH中大于DM中的基因有283個，說明相同的NBS-LRR類基因在DM和RH之間，整體上基因在RH中表達水平略高于在DM中。433個NBS-LRR基因在DM和RH組織間表達水平的Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.600（P<0.01），有顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明NBS-LRR基因在DM和RH的組織中有類似的表達模式。

生物脅迫處理包括接種馬鈴薯晚疫病菌和2種誘導植物抗病的因子［苯并噻二唑（BTH，100 mg/mL）以及DL-氨基丁酸（BABA，2 mg/mL）］處理24 h/48 h/72 h后混合樣本的表達豐度。參加分析的數(shù)據(jù)為計算每個處理相對于對照的相對表達豐度。從結(jié)果中可知，在接種晚疫病菌處理后，有32個基因表達量顯著上升（基因表達量log2比值≥1，即處理后的基因表達量是對照的基因表達量的2倍及以上）；4個基因（PGSC0003DMG400011521、PGSC0003DMG400011906、PGSC0003DMG400033161和PGSC0003DMG400009307）的基因表達量log2比值>2。在接受誘導植物抗病的BTH因子處理后，有36個基因表達量顯著上升，3個基因（PGSC0003DMG400011906、PGSC0003DMG400010527和PGSC0003DMG400044423）的表達量log2比值>2。在BABA因子處理后，有179個基因表達量顯著上升，32個基因的表達量log2比值>2，3個基因（PGSC0003DMG401007609、PGSC0003DMG403015877和PGSC0003DMG400028081）的表達量log2比值>4（圖2）。在3種生物脅迫方式處理后，有4個基因（PGSC0003DMG400011521、PGSC0003DMG400011906、PGSC0003DMG400033161和PGSC0003DMG400044423）至少在接受2種處理后基因表達量log2比值>2。

有研究顯示，晚疫病抗性基因的表達受到激素的影響［37］。為研究激素對NBS-LRR類基因的表達的影響，分析整株植物經(jīng)IAA（吲哚乙酸）10 mmol /L、BAP（6-芐基腺嘌呤）10 mmol /L、GA3（赤霉酸）50 mmol /L、ABA（脫落酸）50 mmol /L 處理24 h后的相對表達豐度。在IAA刺激后，有80個基因表達量顯著上升（基因表達量log2比值≥1，即處理后的基因表達量是對照的基因表達量的2倍及以上），4個基因（PGSC0003DMG400020741、PGSC0003DMG400011521、PGSC0003DMG400029220和PGSC0003DMG400001989）的基因表達量log2比值>2。在BAP處理后，有66個基因表達量顯著上升，15個基因表達量log2比值>2，2個基因（PGSC0003DMG400010612和PGSC0003DMG400026433）的表達量log2比值>4。在GA3刺激后，有159個基因表達量顯著上升，17個基因表達量log2比值>2，2個基因（PGSC0003DMG 400020741和PGSC0003DMG400019804）的表達量log2比值>4。在ABA處理后，有51個基因表達量顯著上升，2個基因（PGSC0003DMG400020741和PGSC0003DMG400011521）的表達量log2比值>2。在4種激素刺激后，有8個基因（PGSC0003DMG400001989、PGSC0003DMG400002427、PGSC0003DMG400003527、PGSC0003DMG400011521、PGSC0003DMG400019804、PGSC0003DMG400020587、PGSC0003DMG400020741和PGSC0003DMG400026433）至少在接受2種處理后基因表達量log2比值>2（圖2）。

2.3 馬鈴薯NBS-LRR類基因編碼序列的SNP標記分析

SNP標記是DNA中的單堿基變異造成的，在該研究中，以雙單倍體DM為參考基因組，利用雜合二倍體RH重測序信息，Sol-CAP對于6個常見栽培種的轉(zhuǎn)錄組測序信息，以及對栽培種大西洋（Atlantic）和Superior的重測序信息，分析在433個NBS-LRR類基因編碼序列內(nèi)的SNP標記。結(jié)果顯示，在以上9個品種的序列信息內(nèi)，只有19個NBS-LRR類基因的編碼區(qū)域內(nèi)沒有SNP，134個NBS-LRR類基因的編碼區(qū)域內(nèi)有1～10個SNP，67個NBS-LRR類基因的編碼區(qū)域內(nèi)有超過50個SNP（圖2）。同時，還分析了NBS-LRR類基因編碼序列內(nèi)SNP的數(shù)量是否影響其表達，結(jié)果顯示沒有相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

目前已發(fā)現(xiàn)的晚疫病抗病（R）基因都是NBS-LRR家族基因，利用已測序完成的參考基因組序列信息，可以初步篩選潛在的抗性基因。目前已在多個植物基因組中鑒定出NBS-LRR家族候選基因，包括重要的作物水稻［12］、小麥［13］、玉米［14］、大豆［15］、棉花［16］、十字花科［17］、黃瓜［18］以及模式生物-擬南芥［19］。在茄科植物中，從辣椒的參考基因組中鑒定到了305個 NBS-LRR類基因，從番茄的參考基因組中鑒定到了255個NBS-LRR類基因［20］，從茄子的參考基因組中鑒定到了245個NBS-LRR類基因［21］。該研究從馬鈴薯參考基因組中鑒定出433個NBS-LRR類基因（圖1）。相較于其他茄科植物，從馬鈴薯參考基因組中鑒定出更多的NBS-LRR類基因，可能是由于更多的基因組倍性變化，如普通栽培種馬鈴薯的基因組是四倍體，而野生馬鈴薯的基因組是二倍體至六倍體，導致的基因組更多變異的累加，并分化出不同的NBS-LRR類基因。這些NBS-LRR類基因的其中一部分成簇分布（圖1），成簇分布的基因，由于連鎖效應，將更易于在雜交育種的過程中，一次性轉(zhuǎn)移更多的NBS-LRR類基因進行品種改良，而選育晚疫病抗性馬鈴薯品種需要更多的R基因累加。

基因發(fā)揮功能首先必須轉(zhuǎn)錄成mRNA，在該研究中利用PGSC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括DM的16種組織內(nèi)基因的表達水平，DM對11種包括鹽脅迫、激素刺激、生物脅迫處理后轉(zhuǎn)錄組表達水平的變化情況，以及以DM為參考基因組，RH的16種組織內(nèi)基因的表達模式［30-31］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，只有12個NBS-LRR類基因在所有的組織或處理中完全沒有檢測到表達。進一步分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在易受晚疫病侵染影響的DM的6種組織和RH的8種組織中NBS-LRR基因的表達情況中，不同的NBS-LRR基因表達水平不同，但相同的NBS-LRR基因在DM或RH的不同組織間的表達水平有一定差異，但整體上差異并不明顯，即組織特異性不明顯。相同的NBS-LRR基因整體上在RH中表達水平略高于在DM中的表達水平。433個NBS-LRR基因在DM和RH組織間表達水平有顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明NBS-LRR基因在DM和RH中表達模式類似。同時，部分NBS-LRR基因在生物脅迫處理和激素刺激后，表達水平顯著上升，有明顯的應激性。

SNP標記作為在高通量測序和生物大數(shù)據(jù)分析中最常使用的遺傳標記，在該研究中分析了433個NBS-LRR基因的編碼區(qū)域內(nèi)的SNP位點（圖2），已知的SNP標記，可以利用多態(tài)性位點及側(cè)翼序列，通過如KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）高通量基因分型技術(shù)，實現(xiàn)在不同品種中對該位點較快速的基因分型［38］，有助于鑒定NBS-LRR基因在不同馬鈴薯品種中的實際抗病性。根據(jù)選擇性清除理論，在受選擇的基因組區(qū)域，其多態(tài)性會降低，表現(xiàn)為SNP標記數(shù)目減少［39］，盡管研究結(jié)果顯示NBS-LRR基因編碼區(qū)域內(nèi)的SNP數(shù)量的多少與其表達不相關(guān)，但67個NBS-LRR基因的編碼區(qū)域內(nèi)存在50個以上的SNP，可能代表基因組的這部分區(qū)域重組頻繁，對基因的功能也可能產(chǎn)生一定的影響。

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