楊偉平 龍宜 張海艷 易力 張耀武 陳萬光

摘要 ［目的］從鵝糞便中分離篩選具有生產(chǎn)潛能的酵母菌，為水質(zhì)凈化、畜禽糞便的資源化利用、動物養(yǎng)殖等提供菌種資源。［方法］使用麥芽汁培養(yǎng)基，采用涂布法和平板劃線方法從鵝糞便中分離酵母菌，然后對純化的菌種進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和26S rDNA序列的同源性分析進(jìn)行鑒定。同時(shí)測定酵母菌對模擬污水COD的降解性能。［結(jié)果］分離到4株酵母菌，通過鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，最終將分離到的菌株Y-1、Y-2、Y-3、Y-5分別鑒定并命名為阿氏絲孢酵母菌Y-1（Trichosporon asahii Y-1）、紅酵母菌Y-2（Rhodotorula sp.Y-2）、膠紅酵母菌Y-3（Rhodotorula mucilaginosa Y-3）、隱球酵母菌Y-5（Cryptococcus albidus Y-5）。4株酵母菌中，Y-3對模擬污水COD的去除效果最好，在菌濃度為1.5×109 CFU/mL、1%接種量、培養(yǎng)96 h時(shí)，對污水中COD的去除效果達(dá)到56.8%。［結(jié)論］篩選到4株酵母菌，其中膠紅酵母菌Y-3對模擬污水COD的去除效果最好，可進(jìn)一步用于后續(xù)研究。

關(guān)鍵詞 酵母菌；分離鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析；COD降解

中圖分類號 X703? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）10-0005-05

Abstract ［Objective］To isolate and screen yeast with production potential from goose feces，and provide bacterial resources for water purification，resource utilization of livestock and poultry feces and animal breeding.［Method］Yeasts were isolated from goose feces using the wort medium by the plate coating method and the streak plate method，and according to morphological，physiological and biochemical ，26S rDNA sequence analysis.At the same time，it was measured that the degradation performance of the yeast for COD in simulated sewage.［Result］The four isolated yeast strains Y1，Y2，Y3 and Y5 were finally named as Trichosporon asahii Y1，Rhodotorula sp.Y2，Rhodotorula mucilaginosa Y3，Cryptococcus albidus Y5 through identification and phylogenetic analysis.Among the 4 strains of yeast，Rhodotorula mucilaginosa Y3 had the best removal effect on COD in simulated sewage，and the removal rate reached 56.8% when the bacterial concentration was 1.5×109 CFU/mL，1% inoculum and cultured for 96 h.［Conclusion］Four strains of yeasts were screened，among which Rhodotorula mucilaginosa Y3 had the best removal effect on COD in simulated sewage，which could be further used in subsequent studies.

Key words Yeast;Isolation and identification;Phylogenetic analysis;COD degradation

酵母菌是一種結(jié)構(gòu)簡單的、兼性厭氧型單細(xì)胞微生物，菌體中富含動物和人體所必需的多種氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)、維生素等［1］。酵母菌在動物生產(chǎn)中作為益生菌，不僅能恢復(fù)腸道的微生態(tài)平衡，而且有助于腸道形態(tài)的生長和發(fā)育［2-3］。齊瓊［4］研究表明海洋紅酵母菌的添加不僅對蝦的增重率、餌料系數(shù)等均有提高，還可改善腸道菌群，增加蝦殼的蝦青素和抵抗力。唐微微等［5］所分離的2株酵母菌具有一定除臭作用，兩菌復(fù)合后對豬糞便中的氨氣和硫化氫的去除率增加。惠文森等［6］研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌可提高發(fā)酵玉米秸稈粗蛋白、粗脂肪的含量，但對粗纖維作用甚微；而劉曉輝等［7］從土壤中分離出的一株膠紅酵母菌則對纖維素有一定的降解能力。此外，酵母菌還對水質(zhì)有較大的凈化作用，較好地應(yīng)用在有毒廢水、高濃度有機(jī)廢水以及生活廢水中，對重金屬離子具有一定的清除效果［8-9］。

動物腸道中的真菌在正常菌群中所占比例極小，但在維持腸道微生態(tài)平衡和機(jī)體健康中發(fā)揮重要作用。該試驗(yàn)旨在從鵝的新鮮糞便中分離篩選有益的酵母菌并對其進(jìn)行鑒定和分析，以便為水質(zhì)凈化、動物飼料添加劑開發(fā)、秸稈腐熟以及動物糞便除臭等方面的研究提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集。該試驗(yàn)中所用的鵝的新鮮糞便采集于洛陽師范學(xué)院伊濱校區(qū)月明湖畔。采集糞便時(shí)，除去其表面的雜草和泥土，取中間部分，裝封口塑料袋中，排氣封口，編號，放入干凈的泡沫盒中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行酵母菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基配制。

（1）麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基。稱取成品的麥芽浸粉瓊脂33.6 g，加熱煮沸溶解于1 000 mL蒸餾水中，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，用作酵母菌的分離篩選［10］。

（2）YPD培養(yǎng)基。酵母粉10 g/L、蛋白胨 20 g/L、葡萄糖20 g/L，若制固體培養(yǎng)基，加入1.7%瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌15 min，用作酵母菌的培養(yǎng)和純化［5］。

1.1.3 模擬污水的制備。

模擬污水的配制參照黃秋婷等［11］的方法進(jìn)行。通過測定，模擬污水化學(xué)需氧量（COD）為513.07 mg/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鵝糞便的預(yù)處理。

稱取采集的鵝糞便5.0 g，轉(zhuǎn)移至無菌的錐形瓶中，加入100 mL滅菌的蒸餾水，于30 ℃、150 r/min 條件下在搖床中振蕩30 min后，靜置20 min后用于酵母菌的分離。

1.2.2 酵母菌的分離純化。

取“1.2.1”中一定量的糞便稀釋液樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別從 10-2、10-3、10-4稀釋度下吸取 0.1 mL 于麥芽浸粉瓊脂平板上涂布，30 ℃條件下在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。挑取單菌落，進(jìn)一步用平板劃線法在YPD固體培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)2～3次，然后進(jìn)行斜面保存和-20 ℃下甘油保存。

1.2.3 酵母菌的鑒定方法。

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》［12］，采用糖發(fā)酵試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)等進(jìn)行酵母菌種屬的鑒定。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定。按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［13］的方法提取酵母菌基因組DNA，根據(jù) 26S rDNA的D1/D2 區(qū)序列合成的一對保守引物（NL1-F：5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′，NL4-R： 5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG GG-3′）［5，7］，然后對酵母菌的26S rDNA 的D1/D2 區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95 ℃ 5 min；隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的變性 95? ℃ 30 s，退火30 s，延伸40 s;最后在 72? ℃下延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后委托上海生工生物工程股份有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast，分析并下載與待鑒定菌株26S rDNA相似性高的序列，利用Clustal X軟件和Mega 6.0軟件進(jìn)行序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［7］。

1.2.4 分離菌株對模擬污水降解性能的測定。

將初篩的純化好的各菌液濃度調(diào)至OD600=0.5左右，按1%接種量接種至盛有100 mL模擬污水的三角瓶中，在30 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h取上清液測定模擬污水的COD含量，計(jì)算各菌株對模擬污水中COD的去除效果。對照組接種同量的滅菌發(fā)酵液。

1.2.5 試驗(yàn)菌株在不同濃度和培養(yǎng)時(shí)間下對模擬污水COD的去除能力。

根據(jù)各菌株對模擬污水COD的去除效果，選擇去除效果最好的菌株進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)中，除對照組（CG）外，共分為4個(gè)試驗(yàn)組，即試驗(yàn)組1（EG1，各菌的原液，濃度為1.5×109 CFU/mL）、試驗(yàn)組2（EG2，濃度為5.0×108 CFU/mL）、試驗(yàn)組3（EG3，濃度為3.0×108 CFU/mL）、試驗(yàn)組4（EG4，濃度為1.5×108 CFU/mL）。按 1%的接種量接種到模擬污水中，于 30 ℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)，分別在24、48、72、96 h取樣測定模擬污水的COD含量。對照組接種同量的滅菌發(fā)酵液。

1.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Excel中進(jìn)行分析整理，然后用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，采用 Dancan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝源酵母菌的分離純化及形態(tài)學(xué)特征

通過使用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基對鵝糞便中酵母菌的分離，挑取單一的乳白色、紅色菌落在YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，根據(jù)其生長快慢，最終從鵝糞便樣品中共分離純化出4株疑似酵母菌的菌株，分別標(biāo)號為Y-1、Y-2、Y-3、Y-5（圖1），其菌落形態(tài)特征描述見表1。

2.2 菌株的生理生化鑒定

試驗(yàn)所分離的酵母菌經(jīng)生理生化鑒定，發(fā)現(xiàn)4株都能在28～37 ℃條件下生長，且對糖類都發(fā)酵，其具體結(jié)果見表2。

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

以酵母菌基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增其26S rDNA的D1/D2 區(qū)序列，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，均擴(kuò)增到一清晰的600 bp左右的條帶（圖2）。測序結(jié)果顯示，Y-1、Y-2、Y-3、Y-5菌株的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列長度分別為611、584、575和585 bp，與預(yù)期結(jié)果基本相符合。

將測序的序列在NCBI中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果見表3。各菌株的26S rDNA的D1/D2 區(qū)序列與NCBI中相應(yīng)模式菌株26S rDNA序列的相似性均達(dá)到了97%及以上。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖3）來看，Y-1的26S rDNA序列與Trichosporon asahii CLIB 3029（LT627403.1）的同源性達(dá)到100%，菌株Y-2與Rhodotorula sp.CRUB 1485 （EF585198.1）的序列同源性達(dá)到了97%，菌株Y-3與Rhodotorula mucilaginosa lhWW25 （MF448272.1）的同源性達(dá)到98%，菌株Y-5與Cryptococcus albidus YM2518 （KT345310.1）的同源性達(dá)到了100%。

結(jié)合各菌株的菌落形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，鑒定菌株Y-1為阿氏絲孢酵母菌（Trichosporon asahii），命名為Trichosporon asahii Y-1；菌株Y-2為紅酵母菌（Rhodotorula sp.），命名為Rhodotorula sp. Y-2；菌株 Y-3為膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa），命名為Rhodotorula mucilaginosa Y-3；菌株Y-5屬于隱球酵母菌（Cryptococcus albidus），命名為Cryptococcus albidus Y-5。

2.4 分離酵母菌株對模擬污水降解性能的測定

從各酵母菌在48 h時(shí)對模擬污水COD的去除效果來看（圖4），Y-2和Y-3顯著優(yōu)于Y-1和Y-5（P<0.05），且Y-2和Y-3均屬于紅酵母菌屬，但Y-3對模擬污水COD的去除效果最好，對模擬污水中COD的去除率達(dá)36.2%。

對Y-3去除模擬污水COD的效果進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)（圖5），隨著使用時(shí)間的延長，不同濃度的Y-3去除模擬污水COD的效果逐漸增強(qiáng)，但從同一時(shí)間不同濃度來看，試驗(yàn)組1（EG1）去除COD的效果顯著優(yōu)于其他試驗(yàn)組（P<0.05）；在菌濃度為1.5×109 CFU/mL、1%接種量、培養(yǎng)96 h時(shí)，對污水中COD的去除效果達(dá)到56.8%。

3 討論

3.1 酵母菌的分離及鑒定

酵母菌在自然界中如土壤［7］、污水口［5］、動物胃腸道［8，10］和食品［14-15］等中廣泛存在，采用特定的培養(yǎng)基從這些環(huán)境中分離篩選出具有有益的酵母菌也成了人們常采用的方法。

在酵母菌的鑒定中，細(xì)胞的形態(tài)會因不同的生長階段和不同的培養(yǎng)基而有所差異，所以形態(tài)學(xué)不能提供有效的分類學(xué)信息。菌株的生理生化鑒定中，因酵母菌屬各菌種間生理生化特性差異有限，對試驗(yàn)條件和培養(yǎng)基也要求嚴(yán)格，菌的生長狀態(tài)和代謝能力也導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。因此，酵母菌rDNA序列分析被廣泛用于其分類學(xué)研究中［16］。

酵母菌rDNA為編碼核糖體rRNA的串聯(lián)重復(fù)序列，包括高度保守的序列和較大變異性的區(qū)域。在酵母菌分類和系統(tǒng)學(xué)研究中，主要以5.8S-ITS間隔區(qū)和26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析為依據(jù)［14］。如謝鳳行等［8］擴(kuò)增了所分離酵母菌的5.8S rDNA序列，利用Gen Bank數(shù)據(jù)庫及Mega 6.0軟件對其測序序列進(jìn)行分析，并對所分離的酵母菌進(jìn)行了鑒定。郭冬琴［14］采用5.8S rDNA及其ITS間隔區(qū)序列RFLP分析和26S rDNA D1/D2區(qū)序列測定相結(jié)合的方法鑒定了所分離的酵母菌株。劉曉輝等［7，15，17］用26S rDNA基因序列測序分析對所分離的酵母菌株進(jìn)行了鑒定。但酵母菌26S rDNA的Dl／D2區(qū)序列的數(shù)據(jù)庫比5.8S-ITS序列數(shù)據(jù)庫更完整，進(jìn)行序列比對時(shí)可以搜索到同源性更高的參考菌株序列，因此，宜選擇26S rDNA的Dl／D2區(qū)序列用于酵母菌的鑒定［14-16］。

通過對分離菌株的序列相似性分析結(jié)果看，所分離到的4株酵母菌與模式菌序列的相似性均達(dá)到了97%以上，可認(rèn)為是用一種菌。目前比較公認(rèn)的觀點(diǎn)是具有相同Dl/D2區(qū)序列或ITS序列的酵母菌應(yīng)屬于同一個(gè)種；在Dl/D2區(qū)序列或ITS序列中堿基差異大于1%的菌株應(yīng)屬于不同的種［16］。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果看，該試驗(yàn)中菌株Y-1和Y-5與其相應(yīng)的模式菌株的同源性均達(dá)到100%，所以與模式菌株為同一種菌，即分別命名為Trichosporon asahii Y-1和Cryptococcus albidus Y-5；而Y-2和Y-3與其相應(yīng)的模式菌株的同源性分別為97%和98%，所以與模式菌株為同一屬中的不同亞種或者是其變種，分別命名為Rhodotorula sp.Y-2和Rhodotorula mucilaginosa Y-3。

3.2 對模擬污水COD的降解性能

在集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式中，由于水產(chǎn)動物糞便、生物殘?bào)w和殘餌大量沉積腐爛，水體養(yǎng)分富集，導(dǎo)致有害藻類和病菌的大量繁殖，水質(zhì)惡化［8］。目前用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體凈化的微生物菌劑中，與光合細(xì)菌、芽孢桿菌等相比，酵母菌因具有生長快、胞體營養(yǎng)成分豐富和能夠降解水中有機(jī)物而受到水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的歡迎［18］。該試驗(yàn)所分離的4株酵母菌在對模擬污水COD去除性能的研究中，膠紅酵母菌Y-3具有強(qiáng)的去除模擬污水COD的能力，且去除效果優(yōu)于其他3株菌，但對COD的去除效果低于謝鳳行等［8，19］的研究結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)，COD初始濃度的高低影響微生物菌劑對COD的去除效果，即COD初始濃度越高，微生物菌劑對COD的去除效果越弱［19-20］。

此外，通過研究不同時(shí)間和不同接種量對COD的影響，發(fā)現(xiàn)菌種菌液的濃度和使用時(shí)間對COD的去除均有一定的影響，但該試驗(yàn)結(jié)果均低于其他學(xué)者的研究［8，19-20］。由此可見，微生物菌劑對COD的去除效果不僅與模擬污水初始COD濃度有關(guān)，還與微生物菌劑的投加量、菌種來源、作用時(shí)間等均有一定的關(guān)系。

3.3 所分離酵母菌可能存在的用途和問題

根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，分離到的4個(gè)酵母菌均有一定的用途。如阿氏絲孢酵母菌能夠產(chǎn)生高的β-葡萄糖苷酶，在紅酒的釀造中能夠保持酒體色澤［21］。在駱駝奶中發(fā)現(xiàn)的阿氏絲孢酵母菌能夠產(chǎn)生抗菌肽P16，對根狀芽孢桿菌有一定的抑制作用［22］。但也有研究表明，絲孢酵母屬菌還屬于條件致病菌，對皮膚、黏膜、肝、脾、腎、腸道等系統(tǒng)有一定的損害［23］。

Vajpeyi等［24］對白色隱球酵母菌的基因組序列和代謝路徑進(jìn)行研究，指出該菌可以利用各種有機(jī)碳源合成脂質(zhì)。張?jiān)赖龋?5］研究指出白色隱球酵母菌能顯著抑制葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的生長，為果實(shí)采后保鮮提供可能。此外，由于臨床上隱球菌病發(fā)病頻率的增加，Cryptococcus albidus的研究受到重視，目前已經(jīng)從血液、肺、皮膚和腦脊液中有分離出來［26］。Nascimento等［27］從鸚鵡泄殖腔的樣品中分離到了10株隱球酵母屬菌，其中9株屬于Cryptococcus albidus var.，并且這9株酵母菌均能產(chǎn)生細(xì)胞毒力因子磷脂酶和蛋白酶，因此指出不僅是環(huán)境，鳥類也可能是該菌攜帶者。該研究分離到的Cryptococcus albidus? Y-5來自健康鵝的糞便，可能屬于Cryptococcus albidus 的一個(gè)變種，是否與隱球菌病有一定的關(guān)聯(lián)還需進(jìn)一步的深入研究。

人類和動物不能合成類胡蘿卜素，必須通過攝取富含類胡蘿卜素的食物，經(jīng)過消化吸收后才能利用［28］。而紅酵母菌屬的酵母菌的菌體含有蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、蝦青素、天然類胡蘿卜素、多不飽和脂肪酸和維生素等營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，是很有潛力的工業(yè)生產(chǎn)菌株，因此在食品工業(yè)、食品添加劑開發(fā)、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料和飼料等方面被廣泛應(yīng)用［17，19，29-31］。而紅酵母菌具有氨氮降解［32］、吸附和抵抗Cu2+對細(xì)胞的毒害作用［33］，因此在水質(zhì)凈化方面也被廣泛關(guān)注［8，9，19］。

4 結(jié)論

（1）該試驗(yàn)從鵝糞便中分離到了4株酵母菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)、生理生化特征及26S rDNA的Dl／D2區(qū)序列分析分別被鑒定為阿氏絲孢酵母菌Y-1（Trichosporon asahii Y-1）、紅酵母菌Y-2（Rhodotorula sp. Y-2）、膠紅酵母菌Y-3（Rhodotorula mucilaginosa Y-3）、隱球酵母菌Y-5 （Cryptococcus albidus Y-5）。

（2）4株酵母菌中，膠紅酵母菌Y-3對模擬污水COD的去除效果最好，在菌濃度為1.5×109 CFU/mL、1%接種量、培養(yǎng)96 h時(shí)，對污水中COD的去除效果達(dá)到56.8%。

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