彭琳,譚巧文,韓瑩,趙靜怡,郭宗君

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,山東 青島 266100; 2 青島濱海學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

調(diào)查顯示,中國吸煙人群數(shù)量仍較多[1]。煙依賴是慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、動脈粥樣硬化的獨立危險因素[2]。CDH23基因編碼的鈣黏附素23,是鈣黏附素超家族中的典型成員,介導(dǎo)鈣離子依賴的細胞間和細胞內(nèi)黏附[3]。一項對中國煙依賴人群的全基因組檢測結(jié)果顯示,煙依賴人群細胞黏附分子(鈣黏附素23)與煙依賴相關(guān)[4]。DNA甲基化是基因組的表觀遺傳修飾,參與調(diào)控基因表達和基因組穩(wěn)定性[5]。尼古丁是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的獨立危險因素[6]。煙依賴者是否存在CDH23基因位點甲基化變化,這種改變是否與煙依賴者頸動脈粥樣硬化發(fā)生相關(guān),目前尚無相關(guān)文獻報道。本文從臨床角度驗證煙依賴是否會導(dǎo)致CDH23基因位點甲基化狀態(tài)改變,并進一步探究這種甲基化狀態(tài)改變是否與頸動脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取青島某三甲醫(yī)院健康查體的男性130例作為研究對象,有煙依賴史者64例納入煙依賴組,無煙依賴史者66例納入對照組。所有研究對象納入標準:①男性,居住地長期住戶且年齡≥45歲;②煙依賴者與對照者之間排除血緣關(guān)系;③過去1年間無除尼古丁以外的濫用物質(zhì)史;④獲得知情同意。煙依賴組入組標準:①符合美國精神障礙診斷統(tǒng)計手冊第四版(DSM-IV)關(guān)于物質(zhì)依賴的診斷標準;②在過去1年內(nèi)每天吸煙≥10支,吸煙≥2年或戒煙<3個月[7]。對照組入組標準:①無煙依賴史或者明顯被動煙依賴史,在入組前總計吸煙量<5支;②無定期使用任何尼古丁替代品(例如尼古丁貼片、尼古丁口香糖等)或其他煙草制品(如電子煙、雪茄等)[8]。排除標準:①有除尼古丁以外的濫用物質(zhì)史(如藥物、乙醇等);②有某種精神疾病(如抑郁、精神分裂癥等)或病史;③嚴重心腦疾病等多臟器功能障礙或無法配合臨床量表調(diào)查者。本研究得到青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準,所有研究對象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料收集 由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的老年醫(yī)學(xué)科醫(yī)師,采用問卷調(diào)查方式收集研究對象一般資料,包括年齡、受教育年限、煙依賴史(初始吸煙年齡、每日吸煙數(shù)量、吸煙持續(xù)時間、戒煙時間等)、既往疾病史;應(yīng)用尼古丁依賴量表(FTND)[9]評估煙依賴者對煙草的依賴程度。既往疾病史包括高血壓、糖尿病、高脂血癥等疾病史,其診斷根據(jù)相關(guān)文獻的標準[10-12]。

1.2.2頸部血管超聲檢查 應(yīng)用GE LOGIQ E9型彩色多普勒超聲檢查設(shè)備,由同一人進行頸動脈超聲檢查,記錄研究對象頸動脈內(nèi)膜厚度。根據(jù)2009年《血管超聲檢查指南》[13]標準,頸動脈內(nèi)-中膜厚度(IMT)<1.0 mm 為正常,IMT≥1.0 mm為內(nèi)-中膜增厚。

1.2.3CDH23基因甲基化檢測 采集受試對象空腹外周靜脈血5 mL,放入EDTA抗凝管中,再提取管中血樣1 mL放入EP管中,-80 ℃冰箱保存。CDH23基因甲基化檢測由上海天昊生物科技有限公司完成,檢測流程:①樣品質(zhì)控;②引物設(shè)計與單位點PCR條件優(yōu)化;③多重PCR引物panel優(yōu)化;④重亞硫酸鹽處理;⑤樣本目標片段多重PCR反應(yīng);⑥樣本添加特異性標簽序列;⑦定量后上機測序,最終于Illumina Hiseq平臺上,以2×150 bp的雙端測序模式進行高通量測序,獲得基因位點甲基化原始數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組間平均年齡、受教育年限比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);兩組間高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。煙依賴組初始吸煙年齡(24.06±7.48)歲,持續(xù)時間(31.45±9.36)年,每日吸煙量(20.73±9.92)支,FTND評分(6.38±1.30)分。

表1 兩組基線資料比較

2.2 兩組CDH23基因甲基化位點差異比較

CDH23基因啟動子存在4個完整的CpG島,分別為CDH23-1、CDH23-2、CDH23-3、CDH23-4,其中CDH23-1包含24個CpG位點,CDH23-2包含17個CpG位點,CDH23-3包含12個CpG位點,CDH23-4包含13個CpG位點。檢測兩組共計66個位點甲基化值,結(jié)果顯示煙依賴組CDH23-1片段中的CpG246位點、CDH23-2片段中的CpG48位點甲基化水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.454、-2.436,P<0.05)。見表2。煙依賴組CDH23-1片段中的CpG110、CpG112、CpG127、CpG131、CpG135、CpG139、CpG147、CpG156、CpG162、CpG170、CpG191、CpG195、CpG200、CpG222、CpG224位點,CDH23-2片段的CpG36、CpG38、CpG43、CpG57、CpG60、CpG62、CpG64、CpG88、CpG101、CpG140、CpG152、CpG185位點,CDH23-3片段中的CpG50、CpG52、CpG62、CpG80、CpG91、CpG98位點,CDH23-4片段中的CpG33、CpG55、CpG89、CpG138、CpG166、CpG192、CpG208等40個位點甲基化程度均低于對照組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 兩組CDH23基因甲基化水平差異比較

2.3 兩組CDH23基因片段甲基化程度差異比較

以CDH23-1、CDH23-2、CDH23-3、CDH23-4所包含的位點的平均甲基化程度作為該片段的平均甲基化程度,煙依賴組各片段的平均甲基化程度均低于對照組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 煙依賴者CDH23基因甲基化與頸動脈粥樣硬化關(guān)系

根據(jù)CpG246、CpG48位點甲基化中位數(shù)(分別為0.010 556、0.056 351),將研究對象分為高甲基化組和低甲基化組,根據(jù)研究對象是否煙依賴分為煙依賴組和非煙依賴組,利用析因設(shè)計方差分析兩種因素(煙依賴和基因位點甲基化)與頸動脈內(nèi)膜厚度的關(guān)系,結(jié)果顯示,CpG246位點、CpG48位點甲基化水平與頸動脈內(nèi)膜厚度相關(guān),低甲基化水平時頸動脈內(nèi)膜厚度顯著大于高甲基化水平(F=6.235、4.692,P<0.05)。見表3、4。

表3 CpG246位點2×2析因設(shè)計組合動脈內(nèi)膜厚度比較

表4 CpG48位點2×2析因設(shè)計組合動脈內(nèi)膜厚度比較

3 討 論

CDH23基因位于染色體10q22.1上,其編碼的鈣黏附素23是鈣黏附素超家族中的一員,鈣黏附素是一種跨膜糖蛋白,參與細胞間、細胞內(nèi)黏附及細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能[14]。既往研究認為,CDH23基因甲基化及多態(tài)性改變在聽力異常[15]、癌癥[14]和阿爾茨海默病[16]中發(fā)揮作用,近年也有研究發(fā)現(xiàn)鈣黏附素23與煙依賴也密切相關(guān)[5]。蛋白表達受基因調(diào)控,CDH23基因甲基化改變是否與煙依賴相關(guān)目前尚不清楚,CDH23基因甲基化水平是否與頸動脈粥樣硬化相關(guān)尚需進一步探討。

本研究對CDH23基因位點的甲基化水平進行了檢測,結(jié)果顯示煙依賴組CpG246位點、CpG48位點甲基化水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明煙依賴可能導(dǎo)致CDH23基因位點發(fā)生低甲基化改變。有研究表明,70%的GpG島位于啟動子區(qū)域,在此區(qū)域內(nèi)甲基化程度與基因表達程度相反[5],因此推測基因甲基化水平的降低可導(dǎo)致CDH23基因表達的增加,其編碼的鈣黏附素23表達增加,細胞間的黏附功能增強。HUAN等[17]研究發(fā)現(xiàn),許多與吸煙相關(guān)的頂級差異表達基因(包括LRRN3和GPR15)在啟動子區(qū)域都有發(fā)生DNA甲基化改變的位點,這些位點在吸煙者中呈現(xiàn)低甲基化改變;隨后他們將這些差異表達基因位點與吸煙相關(guān)的疾病進行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果顯示這些基因位點與腦血管疾病及肺部慢性疾病(慢性阻塞性肺疾病、支氣管炎等)的發(fā)生顯著相關(guān)。

本文研究進一步結(jié)合研究對象煙依賴情況分析CpG246、CpG48兩個位點低甲基化水平與頸動脈內(nèi)膜厚度的關(guān)系,結(jié)果顯示CpG246、CpG48兩個位點低甲基化水平時頸動脈內(nèi)膜厚度顯著高于高甲基化水平,推測煙依賴人群中CpG246、CpG48位點的低甲基化水平與頸動脈粥樣硬化相關(guān)。鈣黏附素23介導(dǎo)細胞內(nèi)和細胞間的黏附,相關(guān)研究表明,其主要在神經(jīng)視網(wǎng)膜、耳蝸和前庭毛細胞的立體纖毛等部位表達[18],同時也在腦、心、血管、肺、腎、鼻、眼等細胞內(nèi)皮上廣泛表達[19]。目前研究認為,頸動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病,細胞黏附分子作為關(guān)鍵的成員參與了單核巨噬細胞的聚集、泡沫細胞的形成等環(huán)節(jié)[20]。尼古丁被認為是煙依賴的主要物質(zhì)及香煙致病的主要物質(zhì),既往研究表明尼古丁可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞功能障礙,促使內(nèi)皮細胞黏附分子異常表達。細胞黏附異常是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。CDH23基因位點低甲基化改變導(dǎo)致細胞內(nèi)皮上鈣黏附素23表達增加,加強了細胞間的黏附,從而參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生。

此前有大量的研究結(jié)果表明,異常的DNA甲基化改變包括異常的低甲基化和高甲基化,在動脈粥樣硬化內(nèi)皮細胞功能障礙、巨噬細胞炎癥、血管平滑肌細胞異常增殖、斑塊破裂和血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。ISTAS等[22]通過綜合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),BRCA1和CRISP2DMRs為大多數(shù)中心疾病相關(guān)的DNA甲基化生物標志物,這種差異甲基化BRCA1和CRISP2區(qū)域通過焦磷酸測序檢測得到驗證,并可在動脈粥樣硬化病人的血液、主動脈組織和頸動脈斑塊材料中進一步復(fù)制。本研究結(jié)果顯示,煙依賴者CDH23基因CpG位點發(fā)生低甲基化改變,這種低甲基化改變與頸動脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)。但本文僅對研究對象外周血樣本進行甲基化檢測,結(jié)果不能完全代表研究對象動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮上發(fā)生的事件,因此需要進一步取得病人的病理組織標本進行研究以驗證本文結(jié)論。同時本文樣本量相對較少,仍需擴大樣本量進一步研究。