王 強(qiáng),孟巧巧,何勝利,馬丹煒,王 煜,張 紅,王亞男

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,成都 610101)

【研究意義】桉樹(Eucalyptusspp.)為桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物的總稱,原產(chǎn)于澳大利亞、印度尼西亞島嶼和馬布亞新幾里亞[1],被100多個(gè)國家廣泛引種,是世界上最常見的人工造林樹種[2-3]。根據(jù)Wu和Chen[4]的報(bào)道,中國桉樹種植面積已經(jīng)達(dá)到5.40×106hm2,其中藍(lán)桉(Eucalyptusglobulus)和巨桉(E.grandis)為主要引種樹種[4-6]。桉葉富含揮發(fā)油,當(dāng)揮發(fā)性化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中,大部分揮發(fā)進(jìn)入大氣作用于植物的地上器官,小部分進(jìn)入土壤[7],因此,揭示桉樹揮發(fā)性化感物質(zhì)的化感效應(yīng),對(duì)桉樹引種健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來,桉樹種植導(dǎo)致物種多樣性和功能多樣性下降等生態(tài)問題引起了高度關(guān)注[8-9]。桉葉富含揮發(fā)油,目前已從桉葉揮發(fā)油中鑒定出近80種化合物,主要包括桉油精、α-蒎烯、桉葉醇、檸檬烯、ρ-對(duì)傘花素、香茅醛、藍(lán)桉醇等[10-11]。氣孔保衛(wèi)細(xì)胞能夠感知胞間CO2濃度和可利用水分的變化,調(diào)節(jié)氣孔開度以維持光合作用的最佳細(xì)胞狀態(tài)[12],根尖是植物吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)最活躍的部位[13-14]。根邊緣細(xì)胞(Root border cells, RBCs)與其分泌的粘液共同形成根尖保護(hù)鞘,在植物根系-外部環(huán)境之間構(gòu)筑了一道生物、化學(xué)和物理屏障[15]。桉樹揮發(fā)油具有植物毒性[16],釋放到環(huán)境后對(duì)周圍植物形成較強(qiáng)的化感脅迫[9,17]?；凶饔檬峭鈦碇参镆鹕锒鄻有韵陆档囊蛩刂籟18],受體對(duì)化感作用的耐受性和敏感性涉及復(fù)雜的生命活動(dòng)過程。高等植物機(jī)體由多細(xì)胞構(gòu)成,每一種細(xì)胞的生命活動(dòng)均會(huì)受機(jī)體其他細(xì)胞制約。以單細(xì)胞模式系統(tǒng)作為研究化感作用的靶標(biāo),可排除干擾從而直觀地洞察化感作用的本質(zhì)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來,氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和根邊緣細(xì)胞逐漸成為評(píng)估脅迫的單細(xì)胞模式系統(tǒng),具有反應(yīng)靈敏、取材方便、易于控制試驗(yàn)條件、耗費(fèi)少、周期短等優(yōu)勢[19-20],但桉樹揮發(fā)物化感作用對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞和根邊緣細(xì)胞影響的報(bào)道較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】以中國桉樹種植區(qū)主要農(nóng)作物蠶豆(ViciafabaL.)為受體,研究葉氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和根邊緣細(xì)胞對(duì)藍(lán)桉和巨桉的葉揮發(fā)油及其共有成分α-蒎烯和桉油精的響應(yīng)和信號(hào)調(diào)節(jié),旨在探討桉樹化感作用的分子生態(tài)過程,為桉樹種植和資源管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 揮發(fā)油及其處理母液的制備

藍(lán)桉、巨桉葉采集于四川師范大學(xué)成龍校區(qū)及其附近街道,陰干后剪成小段,采用水蒸氣蒸餾法[21]提取桉葉揮發(fā)油,無水Na2SO4除去水分,稱重,4 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)過GC-MS檢測,確定桉油精和α-蒎烯為2種桉油的主要成分,藍(lán)桉葉的桉油精和α-蒎烯分別為543.23 和156.72 mg/mL,巨桉葉的桉油精和α-蒎烯中分別為477.49和169.19 mg/mL。供試標(biāo)準(zhǔn)品α-蒎烯(≥99%)和桉油精(≥99%)購自科賽斯特(成都)科技有限公司。

用25%二甲基亞砜(DMSO)配制桉葉揮發(fā)物母液,藍(lán)桉和巨桉的葉揮發(fā)油母液濃度為0.1 μL/μL(分別記為VL和VR),根據(jù)在桉葉揮發(fā)油中的含量配制主要成分的母液,其中,α-蒎烯為0.02 μL/μL,桉油精為0.06 μL/μL。

1.2 材料培養(yǎng)及其制備

供試植物蠶豆種子(成胡14#)購自成都市龍泉驛區(qū)大面鎮(zhèn)街道種子市場;挑選大小均一、無病、無霉斑和顆粒豐滿勻稱的蠶豆種子, 0.5% KMnO4溶液消毒15 min,蒸餾水清洗5次, 25 ℃培養(yǎng)箱中浸種24 h后,均勻鋪在墊有濕紗布磁盤中,再覆蓋1層濕紗布,放入25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)至種子露白。

RBCs收集:待露白蠶豆種子生長到根長約2 cm時(shí)截取2 cm根尖,取0.5 mL EP管若干,每個(gè)管中放入根尖5個(gè),加入100 μL ddH2O,渦旋振蕩30 s,取出根尖并用50 μL ddH2O沖洗2次,用移液槍吹打使細(xì)胞散開,獲得根邊緣細(xì)胞懸液,每管200 μL。

表皮條的制備:將露白蠶豆種子播種在盛有石英砂的花盆(直徑10 cm,高6 cm)中,置于光暗周期14 h/10 h、25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間盆內(nèi)Hoagland營養(yǎng)液保持在0.2%; 4周后取頂端1～2對(duì)完全展開的葉片,蒸餾水洗凈后,在無葉脈的部位用鑷子撕取1.0 cm×0.5 cm的葉下表皮條,浸入裝有5 mL MES緩沖液的EP管中備用,每管5個(gè)表皮條。

1.3 根邊緣細(xì)胞試驗(yàn)

揮發(fā)物處理后根邊緣細(xì)胞的活性觀察參照楊小環(huán)等[22]的方法。分別取處理母液1、2、3、4和5 μL,用25% DMSO補(bǔ)足體積至5 μL作為處理液,加入到200 μL根邊緣細(xì)胞懸液中,以5 μL ddH2O為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次。置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 min。處理結(jié)束后,取細(xì)胞懸液10 μL加入4 μL吖啶橙和溴乙錠混合液(體積比為1∶1),混勻,暗處染色1～3 min,LEICA DM 3000熒光顯微鏡(藍(lán)光,激發(fā)波長420～485nm)鏡檢,活細(xì)胞為綠色熒光,死細(xì)胞為橘紅色熒光。統(tǒng)計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞的數(shù)量,計(jì)算根邊緣細(xì)胞的死亡率:死亡率=(死細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4 葉表皮條試驗(yàn)

將制備的表皮條隨機(jī)分為3組。A組:分別取處理母液2、4、6、8和10 μL,用25% DMSO補(bǔ)足體積至10 μL作為處理液處理表皮條,以10 μL MES緩沖液為對(duì)照。B組:緩解組先用10 μL拮抗劑處理表皮條5 min,再加入8 μL母液和2 μL 25% DMSO,處理組為8 μL母液+2 μL 25% DMSO+10 μL MES緩沖液,對(duì)照組為20 μL MES緩沖液;拮抗劑包括泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK(10和40 μmol/L)、Ca2+通道阻斷劑(0.1 mmol/L LaCl3)、活性氧清除劑抗壞血酸(0.1 mmol/L AsA)和硝酸還原酶抑制劑(0.1 mmol/L NaN3)。C組:緩解組分別取微絲聚合抑制劑細(xì)胞松弛素B(CB,10和20 μmol/L)、NADPH氧化酶抑制劑二聯(lián)苯碘(DPI,1和2 μmol/L)和活性氧清除劑抗壞血酸(0.1 mmol/L)10 μL處理表皮條5 min,再加入8 μL 處理母液和2 μL 25% DMSO,混勻;處理組加入8 μL母液、2 μL 25% DMSO和10 μL MES緩沖液;20 μL MES緩沖液作對(duì)照。

A組、B組和C組每個(gè)處理重復(fù)3次,置于25 ℃、4000 lx光照培養(yǎng)箱中處理30 min。處理結(jié)束后測定相關(guān)指標(biāo)。

蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性檢測:細(xì)胞活性檢測參照馬丹煒等[23]的方法。A組和B組表皮條用MES緩沖液清洗3次后,鋪展在載玻片上,吸去多余緩沖液,AO/EB避光染色3 min,LEICA DM 3000熒光顯微鏡(藍(lán)光,激發(fā)波長420～485 nm)觀察并拍照。每處理計(jì)數(shù)1000個(gè)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞,重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞核畸變和細(xì)胞核形態(tài)檢測:細(xì)胞核形態(tài)檢測采用 Feulgen染色法[23]。A組表皮條用MES緩沖液清洗3次,卡諾固定液[v(冰醋酸)∶v(無水乙醇)=1∶3) 4 ℃下固定2 h,1 mol/L HCl 60 ℃解離8 min,清洗3次,Schiff試劑避光染色1 h。LEICA DM 3000光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。每處理計(jì)數(shù)1000個(gè)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞,重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞核畸變率:細(xì)胞核畸變率(%)=核畸變細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

TUNEL檢測:參照黃素等[24]的方法。A組表皮條MES緩沖液清洗3次,卡諾固定液4 ℃下固定2 h,酶溶液(4%果膠酶,2%纖維素酶)37 ℃下酶解10 min,然后在2% triton-× 100溶液(PBS配制而成)中孵育5 min,PBS漂洗3次,將吸干水分的表皮條置于TUNEL反應(yīng)混合物中,37 ℃避光染色60 min。LEICA DM 3000熒光顯微鏡(藍(lán)光,激發(fā)波長420～485 nm)觀察并拍照。

氣孔開度檢測:用MES緩沖液清洗A組和C組表皮條3次,平鋪于載玻片上,在LEICA DM 3000光學(xué)顯微鏡下觀察并測定,每次觀察6個(gè)表皮條,每個(gè)表皮條隨機(jī)選取3個(gè)視野(40×),每個(gè)視野隨機(jī)選取10個(gè)氣孔進(jìn)行測量,每個(gè)處理組至少重復(fù)3次。

蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS、NO和Ca2+水平檢測與原位觀察:用MES緩沖液清洗A組表皮條3次,采用ROS、NO、Ca2+檢測試劑盒(碧云天,上海)測定ROS、NO和Ca2+水平,用Nikon ECLIPSE 55i熒光顯微鏡觀察胞內(nèi)ROS、NO、Ca2+的分布,酶標(biāo)儀測定蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞相對(duì)熒光值。

qRT-PCR分析:采用RNA提取試劑盒(福際,成都)提取A組葉表皮條的總RNA;用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件,設(shè)計(jì)蠶豆NADPH氧化酶基因(Rboh)和內(nèi)參基因(EF-1-alpha)特異性引物。RbohF:5’-GGGTATTTGCTCTGTGGATTGG-3’;RbohR:5’-CCTGAGCCAAGTAATGGTGTTTC-3’;EF-1-alphaF:5’-ACGAGGCTCTCACTGAGGCTCTTCC-3’;EF-1-alphaR:5’-CCTTGGCAGGGTCATCCTTGGAGTTG-3’。

引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成,使用熒光定量PCR儀(Stepone plus,ABI)進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系(25 μL)包含qPCR Mix 12.5 μL、7.5 μmol/L基因引物2.0 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL和ddH2O 8.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個(gè)循環(huán);每處理重復(fù)3次;使用StepOne Software v2.3軟件分析PCR過程的CT(Threshold cycle)值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)Williamson和Richardson[25]提出的化感作用響應(yīng)指數(shù)(Allelopathy response index, RI)用于衡量化感作用強(qiáng)度。

式中,C為對(duì)照值,T為處理值,RI<0表示抑制效應(yīng),RI>0表示促進(jìn)效應(yīng),其絕對(duì)值表示化感作用強(qiáng)度大小;化感作用綜合效應(yīng)(Synthesis effect,SE)為RI的算術(shù)平均值[26]。

采用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)、Tukey檢驗(yàn)多重比較(LSD)和Pearson相關(guān)性分析, Excel 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉葉揮發(fā)物對(duì)蠶豆根邊緣細(xì)胞活性的影響

蠶豆RBCs活性隨揮發(fā)物處理劑量升高而降低(圖1)。與對(duì)照相比,揮發(fā)物處理組死亡率顯著增加(P<0.05)。最大處理劑量時(shí),藍(lán)桉揮發(fā)油、巨桉揮發(fā)油、α-蒎烯和桉油精處理組的RBCs死亡率分別比對(duì)照上升5.15、5.30、2.97和2.66倍。表明桉葉揮發(fā)物對(duì)RBCs具有致死效應(yīng)。

VL.藍(lán)桉揮發(fā)油,VR.巨桉葉揮發(fā)油;不同字母表示在0.05水平上的差異顯著性,下同。VL and VR were volatile oil from E. globulus and E. grandis, respectively. Different letters indicated significance of difference at 0.05 level. The same as below.圖1 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆根邊緣細(xì)胞死亡率的變化Fig.1 Change of mortality rates of V.faba root border cells treated with the volatiles from Eucalyptus leaves

2.2 桉葉揮發(fā)物對(duì)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞的毒性效應(yīng)

從圖2可知,隨著桉葉揮發(fā)物處理母液體積增加,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性逐漸下降,達(dá)到最大處理劑量(10 μL)時(shí),藍(lán)桉和巨桉的葉揮發(fā)油處理組的蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞存活率分別比對(duì)照組下降30.31%和43.22%。

圖2 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性的變化Fig.2 Changes of the guard cell activities of V. faba leaves treated with the volatiles from Eucalyptus leaves

AO/EB染色結(jié)果表明,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞的細(xì)胞核在對(duì)照組中大多呈均勻的綠色熒光(圖3-a,3-b),而處理組則出現(xiàn)了橘紅色熒光(圖3-d,3-f),且表現(xiàn)為劑量依賴效應(yīng),表明揮發(fā)物降低了蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性;Schiff試劑染色結(jié)果顯示,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞的細(xì)胞核在對(duì)照組中位于細(xì)胞中央,形態(tài)規(guī)則(圖4-a),而處理組則出現(xiàn)固縮(圖4-b)、拉長(圖4-c)、畸形(圖4-d)、裂解(圖4-e)以及核消失(圖4-f)等畸變特征,核畸變率呈劑量依賴性升高(P<0.05)(圖5),當(dāng)達(dá)到最大處理劑量時(shí),藍(lán)桉揮發(fā)油、巨桉揮發(fā)油、α-蒎烯、桉油精處理組的細(xì)胞核畸變率分別達(dá)到69.43%、52.52%、42.50%和40.14%。表明桉樹揮發(fā)物降低了蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性。

a和b對(duì)照組;c. 低劑量處理組;d. 高劑量處理組; e. 氣孔單保衛(wèi)細(xì)胞活性喪失;f. 氣孔雙保衛(wèi)細(xì)胞活性喪失。a and b.Control group; c. Low-dose treatment group; d. High-dose treatment group; e. Loss of single guard cell activity; f. Loss of double guard cell activity.圖3 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞的熒光顯微圖Fig.3 Fluorescence images of V. faba leaf guard cells treated with volatiles from Eucalyptus leaves

a.對(duì)照組;b.核固縮;c.核拉長;d.核畸形;e.核裂解;f.核消失。a.Control group; b.Nuclear pyknosis; c.Nuclear elongation; d.Nuclear deformity; e.Nuclear lysis; f.Nuclear disappearance.圖4 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞核形態(tài)的變化Fig.4 Changes of the nucleus morphology of V. faba leaf guard cells treated with volatiles from Eucalyptus leaves

圖5 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞核畸變率的變化Fig.5 Changes of the nuclear aberration rates of V. faba leaf guard cells exposed to Eucalyptus volatiles

TUNEL檢測結(jié)果(圖6)表明,桉葉揮發(fā)物處理后,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞均呈綠色熒光,表明揮發(fā)物誘導(dǎo)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生凋亡,其中α-蒎烯和桉油精處理組的熒光相對(duì)較弱;當(dāng)泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK與揮發(fā)物共處理時(shí),蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度變?nèi)?表明蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性顯著升高; Z-VAD-FMK濃度越高,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性越大(圖7),表明桉葉揮發(fā)物誘導(dǎo)的蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞凋亡為Caspase依賴性細(xì)胞凋亡。

圖6 桉葉揮發(fā)油作用下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞TUNEL原位圖Fig.6 TUNEL in situ image of leaf guard cells of V. faba exposed to Eucalyptus volatiles

圖7 Caspase抑制劑與桉葉揮發(fā)物共同處理下對(duì)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性的變化Fig.7 Changes of guard cell activities of V. faba leaves co-treated with Caspase inhibitor and Eucalyptus volatiles

2.3 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞信號(hào)分子的變化

桉葉揮發(fā)物處理后蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS、NO、Ca2+含量顯著增加(圖8),其中揮發(fā)油處理組變化最明顯,用藍(lán)桉和巨桉的葉揮發(fā)油處理后,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS含量分別為對(duì)照的6.97和4.93倍;NO含量分別為對(duì)照的2.76和2.36倍;Ca2+含量分別為對(duì)照的4.17和3.75倍。

圖8 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞ROS、NO和Ca2+水平的變化Fig.8 Changes of ROS,NO and Ca2+ levels of leaf guard cells in V. faba exposed to Eucalyptus volatiles

當(dāng)LaCl3、NaN3和AsA分別與揮發(fā)物共處理時(shí),蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞存活率顯著高于揮發(fā)物處理組(圖9),表明胞內(nèi)信號(hào)分子ROS、NO和Ca2+參與了揮發(fā)物誘導(dǎo)的蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞死亡。熒光定位試驗(yàn)結(jié)果(圖10)表明,與揮發(fā)油處理組相比,AsA共處理組蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)NO和Ca2+水平較低, NaN3共處理組蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+水平較低, LaCl3共處理組蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS和NO水平差異不明顯。由此推測桉葉揮發(fā)油誘導(dǎo)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞ROS和NO升高,從而調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平。

圖9 桉葉揮發(fā)物與ROS、NO和Ca2+抑制劑共處理下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞存活率的變化Fig.9 Changes of guard cell activities of V. faba leaves co-treated with ROS, NO and Ca2+ inhibitors and volatiles of Eucalyptus

圖10 NaN3、AsA和LaCl3與桉葉揮發(fā)油共處理后蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS、NO和Ca2+熒光定位Fig.10 Fluorescence localization of ROS,NO and Ca2+ in V. faba L. leaf guard cells under the combined action of NaN3, AsA and LaCl3 with three Eucalyptus volatile oils

2.4 桉葉揮發(fā)物對(duì)蠶豆葉氣孔運(yùn)動(dòng)的影響

蠶豆葉氣孔開度隨桉葉揮發(fā)物劑量升高逐漸下降(圖11)。最大處理劑量組中,藍(lán)桉揮發(fā)油、巨桉揮發(fā)油、α-蒎烯和桉油精處理組的氣孔開度僅為對(duì)照組的22.31%、22.45%、30.26%和27.87%。

圖11 桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉氣孔開度的變化Fig.11 Changes of the stomatal aperture of V. faba leaves exposed to Eucalyptus volatiles

與揮發(fā)物處理組相比,CB、DPI和ASA與揮發(fā)物共處理組均表現(xiàn)出氣孔開度顯著增大(圖12)。CB和DPI濃度越大,氣孔開度越大。表明桉葉揮發(fā)物引起蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)微絲聚合、ROS和NADPH氧化酶活性升高,導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。

圖12 桉葉揮發(fā)物與CB、DPI和ASA共處理下蠶豆葉氣孔開度的變化Fig.12 Changes of the stomatal aperture of V. faba leaves co-treated with volatiles from Eucalyptus leaves with CB, DPI and ASA

2.5 蠶豆葉片NADPH氧化酶Rboh基因的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果(圖13)顯示,在桉樹葉揮發(fā)物作用下,蠶豆葉片內(nèi)NADPH氧化酶基因Rboh表達(dá)顯著上調(diào),其中以巨桉葉揮發(fā)油處理組上調(diào)幅度最大,為對(duì)照組的14.2倍,表明桉葉揮發(fā)油改變了葉片基因表達(dá),引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加。這一結(jié)果印證了蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞活性和氣孔開度與ROS變化相關(guān)的結(jié)果。

圖13 桉樹葉揮發(fā)油作用下NADPH氧化酶基因Rboh相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.13 Changes in the relative expression of NADPH oxidase Rboh exposed to Eucalyptus volatile oils, α-pinene and eucalyptol

2.6 不同桉葉揮發(fā)物對(duì)蠶豆細(xì)胞的化感效應(yīng)及分子機(jī)制

根據(jù)化感綜合效應(yīng)指數(shù)可知,4種揮發(fā)物化感綜合效應(yīng)由大到小依次為藍(lán)桉揮發(fā)油(0.529)>巨桉揮發(fā)油(0.525)>α-蒎烯(0.441)>桉油精(0.421),α-蒎烯和桉油精與2種揮發(fā)油的化感效應(yīng)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明二者是桉葉揮發(fā)油的主效化感物質(zhì)。

桉樹揮發(fā)物對(duì)蠶豆細(xì)胞化感作用的分子機(jī)制如圖14所示。

a.桉葉揮發(fā)物的作用途徑;b.受體葉保衛(wèi)細(xì)胞的信號(hào)調(diào)節(jié)。a.The action pathway of Eucalyptus volatiles;b.Signal regulation of receptor guard cells.圖14 藍(lán)桉和巨桉通過揮發(fā)途徑化感作用的分子機(jī)制Fig.14 Molecular mechanism of allelopathy of E. globulus and E. grandis via volatile pathway

3 討 論

3.1 桉葉揮發(fā)物對(duì)蠶豆根邊緣細(xì)胞和蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞的毒性效應(yīng)

植物釋放的揮發(fā)性化感物質(zhì)進(jìn)入土壤后會(huì)破壞根的微觀結(jié)構(gòu),干擾植物的礦物質(zhì)元素吸收和光合作用[27]。作為植物根系的第一道防御屏障,根邊緣細(xì)胞通過加速死亡[28]或分泌一些活性物質(zhì)螯合有毒物質(zhì)[29],可在一定程度上阻止有毒物質(zhì)侵入根系,從而緩解毒害作用[29-30],但這種緩解效應(yīng)具有一定的閾值。桉樹油具有顯著的植物毒性[31-32],對(duì)其他植物的種子萌發(fā)和幼苗生長均具有很強(qiáng)的化感作用[32-33]。本研究表明,在桉樹葉揮發(fā)物作用下,蠶豆的根邊緣細(xì)胞和葉保衛(wèi)細(xì)胞活性均降低,保衛(wèi)細(xì)胞出現(xiàn)了固縮、裂解、消失等多種類型的核畸變,并出現(xiàn)Caspase依賴性細(xì)胞凋亡,引起保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)微絲聚集、氣孔關(guān)閉。這些現(xiàn)象說明桉葉揮發(fā)物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,通過破壞根系的防御功能、干擾光合作用過程而影響植物的生長發(fā)育,而且α-蒎烯和桉油精的化感作用明顯,推測二者是桉葉揮發(fā)油的主要化感物質(zhì)。

3.2 桉葉化感脅迫下蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞NO和ROS的串?dāng)_

當(dāng)外界脅迫超出植物自身的耐受范圍時(shí),植物體內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)ROS爆發(fā)[34]。 在植物發(fā)生氧化應(yīng)激過程中,ROS往往與NO、Ca2+等信號(hào)分子相互作用[35],ROS和NO之間的平衡是調(diào)控細(xì)胞凋亡的決定性因素[36-37]。一方面NO作為一種保護(hù)性抗氧化劑直接淬滅ROS[38],形成毒性較小的ONOOH,防止細(xì)胞損傷[39]。 另一方面,高濃度的NO和ROS協(xié)同作用,二者均可使線粒體釋放Cyt c,產(chǎn)生Caspase樣信號(hào)級(jí)聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[40-41]。此外,NO也可獨(dú)立誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,如Cd脅迫下擬南芥大量積累NO,激活MPK6介導(dǎo)的Caspase-3樣細(xì)胞凋亡[42]。本研究表明,在桉葉揮發(fā)物作用下,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS、NO、Ca2+水平呈劑量依賴性大幅上升, ROS、NO、Ca2+清除劑顯著緩解了揮發(fā)物對(duì)葉保衛(wèi)細(xì)胞的致死效應(yīng),主要表現(xiàn)為NO合成抑制劑NaN3使ROS和Ca2+水平降低,抗氧化劑AsA降低胞內(nèi)ROS水平進(jìn)而降低NO和Ca2+水平。但Ca2+通道特異性抑制劑LaCl3阻止胞外Ca2+內(nèi)流后,胞內(nèi)ROS和NO水平無明顯變化。說明,在桉葉揮發(fā)物誘導(dǎo)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞死亡過程中,ROS和NO均能調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平,而Ca2+對(duì)ROS和NO水平?jīng)]有明顯影響,推測在2種桉葉揮發(fā)油及其主成分作用下,蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞通過NO直接調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào),或通過ROS調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)系統(tǒng),改變胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)水平引起細(xì)胞凋亡。

3.3 桉葉化感作用對(duì)蠶豆葉氣孔運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制

環(huán)境變化時(shí)氣孔能感知植物胞間CO2濃度和水分含量,通過調(diào)節(jié)氣孔開度來維持光合作用最佳條件。氣孔運(yùn)動(dòng)的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,其中ROS作為信號(hào)分子起著關(guān)鍵作用[13],ROS的產(chǎn)生與NADPH氧化酶密切相關(guān)。本研究中,在桉葉揮發(fā)物作用下蠶豆葉氣孔開度下降,質(zhì)膜NADPH氧化酶基因Rboh表達(dá)上調(diào),而NADPH氧化酶抑制劑和細(xì)胞松弛素B可緩解氣孔關(guān)閉,表明桉葉揮發(fā)物導(dǎo)致蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性增加,ROS爆發(fā),微絲聚合,從而引起氣孔關(guān)閉,勢必會(huì)影響光合作用過程,這些結(jié)果與Laila等[43]和魏愛麗等[44]研究逆境脅迫的結(jié)果較為相似。

4 結(jié) 論

藍(lán)桉和巨桉的葉揮發(fā)油及其共有成分α-蒎烯和桉油精具有細(xì)胞毒性,通過毒害根邊緣細(xì)胞,破壞根系保護(hù)屏障,影響根系對(duì)水分和礦質(zhì)元素的吸收;在桉葉揮發(fā)物作用下,蠶豆葉片內(nèi)NADPH氧化酶基因表達(dá)上調(diào),保衛(wèi)細(xì)胞ROS爆發(fā)導(dǎo)致核畸變和微絲聚合,ROS和NO相互串?dāng)_導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度升高, 最終誘導(dǎo)蠶豆葉保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴性凋亡,影響氣孔運(yùn)動(dòng)和光合作用。