文利超 熊 濤 鄧智超 劉 濤 郭 存 李 偉 郭永峰

煙草轉錄因子在非生物脅迫下的表達分析及功能鑒定

文利超1,2熊 濤3鄧智超1,2劉 濤1,2郭 存4李 偉1,*郭永峰1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所/ 煙草行業(yè)基因資源利用重點實驗室, 山東青島 266101;2中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院, 北京 100081;3湖北省煙草公司恩施州公司利川市分公司, 湖北恩施 445000;4云南省煙草公司昆明市公司石林分公司, 云南昆明 650000

NAC作為植物特有的轉錄因子, 廣泛參與植物生長發(fā)育、衰老及脅迫響應等生物學過程。為探究煙草在非生物脅迫響應中的功能, 利用qRT-PCR技術分析了不同脅迫處理下的表達模式, 結果表明,的表達受干旱、高鹽脅迫以及ABA、MeJA和SA激素的誘導; 以基因的敲除突變體及野生型(K326)煙株為材料, 分析敲除株系在高鹽和干旱脅迫下抗逆表型。試驗表明, 與野生型相比, 2個敲除株系的耐鹽抗旱能力均明顯增強; 干旱和鹽脅迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量顯著高于野生型, 而丙二醛含量顯著低于野生型。相反地, 異源表達的轉基因擬南芥與野生型(Col-0)相比對鹽和干旱的耐受性明顯減弱。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽處理后脅迫相關基因(、、等)在基因敲除株系中表達水平顯著高于野生型。以上結果表明,在煙草的非生物脅迫響應中起負調控作用, 這可能是通過調控抗氧化酶活性及脅迫相關基因的表達來實現(xiàn)的。

煙草;; ROS; 表達分析; 非生物脅迫

干旱和鹽脅迫一直以來都是農(nóng)作物在生產(chǎn)過程中最常遇到的脅迫類型[1], 對農(nóng)業(yè)及其他產(chǎn)業(yè)的正常運轉造成重大影響。已有的數(shù)據(jù)表明, 全世界已存在的鹽漬化土地已接近8億公頃, 灌溉農(nóng)業(yè)地中約有20%正在遭到鹽堿化的危害[2]。鹽漬化耕地在我國的面積已達到920.9萬公頃, 且能被改良再利用的耕地僅占極少部分[3]。近年來隨著全球氣候變暖的加劇, 我國干旱地區(qū)的面積也日益增加, 部分地區(qū)降雨不充分導致農(nóng)作物受到嚴重的干旱威脅, 而煙草作為我國重要經(jīng)濟作物之一, 其產(chǎn)量和質量一直以來受干旱和鹽害的影響較大[4]。因此, 研究煙草應答干旱和鹽脅迫的分子機理具有重要的理論和實踐意義。

干旱、高鹽、高溫等非生物脅迫造成植物葉片光合系統(tǒng)受損, 光合速率降低; 還會誘導植物體內的活性氧(ROS)大量積累, 最終導致植物細胞嚴重損傷, 加速植物組織器官衰老等過程[5-6]。同時, 植物也不斷進化出多種復雜的防御機制來抵御和適應逆境脅迫, 以便于保證自身正常的生長和發(fā)育過程。已有大量的研究表明, 多個轉錄因子參與調控植物的逆境應答過程, 如NAC、WRKY、MYB及bZIP等。這些轉錄因子通過與靶基因啟動子的特定順式元件結合引起基因表達變化, 從而導致靶基因的激活或抑制[7-8]。其中, NAC轉錄因子廣泛分布于高等植物中并參與多種生物學過程, 研究表明該家族成員不僅對植物發(fā)育成長進程有著重要的調控作用, 在植物的逆境脅迫應答進程中也發(fā)揮著不同的功效[9]。人們利用RNA-seq技術分析水稻NAC轉錄因子的表達模式時發(fā)現(xiàn), 不同生物和非生物逆境脅迫刺激會誘導至少45個水稻NAC基因的表達[10]; 對誘導表達的轉錄因子進行功能分析發(fā)現(xiàn), 過表達、、及等基因會顯著增強轉基因水稻植株對外界脅迫的耐受性[11-14]。在擬南芥中, 多個NAC轉錄因子也被證明參與了植物逆境應答過程, 如、、或()轉錄因子的過表達增強了擬南芥對干旱、高鹽和溫度脅迫的耐受性[15-17]。此外, 研究表明在鹽、低溫和干旱脅迫下, 小麥的表達顯著增加, 在擬南芥中過表達該基因可以誘導脅迫應答基因的表達從而增強植株對干旱、鹽和低溫脅迫的耐受性[18]; 在小麥中過表達基因可以誘導應激基因和脫水響應基因表達來提高植株的抗逆性[19]。番茄NAC轉錄因子和能夠有效增強植物對鹽、干旱和低溫的抗性[20-21]。煙草中及的過表達會提高CAT、SOD及POD的活性從而增強轉基因煙草對ROS的清除能力進而提高煙草植株對干旱脅迫的抗性[22-23]。

本課題組前期鑒定到了一個參與煙草葉片衰老調控的NAC轉錄因子基因, 該基因在葉片衰老過程中顯著上調表達; 利用CRISPR-Cas9技術定向敲除煙草基因后能夠延緩葉片衰老過程[24]。本研究發(fā)現(xiàn)也受干旱和鹽脅迫誘導, 預示著該基因可能參與非生物脅迫應答過程。進一步, 本研究在干旱和鹽脅迫下對轉基因材料的抗逆性進行分析, 為解析煙草NAC轉錄因子在植物非生物脅迫應答中的分子機制提供一定的理論依據(jù), 也為篩選和培育優(yōu)質耐鹽抗旱煙草新種質以及作物抗逆性的改良提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

擬南芥Col-0和轉基因植株在植物培養(yǎng)箱(加拿大Conviron)中生長, 培養(yǎng)條件為: 22℃, 長日照(16 h光/8 h暗), 白熾燈光照強度(120 μmol m–2s–1)。敲除株系和野生型K326種植在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所溫室。

植物RNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技股份公司, 反轉錄試劑盒、熒光定量試劑購自寶生物工程(大連)有限公司, 由深圳華大基因科技有限公司合成引物。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因表達模式分析 K326種子用75%乙醇浸泡20 s, 無菌水沖洗2次, 15% H2O2浸泡8～ 12 min, 無菌水沖洗4～5次, 將無菌種子接種于MS培養(yǎng)基上進行種子萌發(fā)。幼苗長出4片真葉時, 選取長勢均勻的幼苗轉移到MS液體培養(yǎng)基中, 進行200 mmol L–1NaCl、150 μmol L–1脫落酸(abscisic acid, ABA)、150 μmol L–1水楊酸(salicylic acid, SA)及150 μmol L–1茉莉酸(jasmonic acid, JA)處理0～ 48 h。干旱處理時, 將幼苗置于濾紙上, 室溫脫水0、1、3、6、12 h。取樣后液氮速凍, –80℃保存。提取處理后煙草幼苗總RNA并反轉錄為cDNA, 每個處理設置3個生物學重復。

利用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)方法對煙草、、、、、及擬南芥、、、、基因表達模式進行分析, 分別選擇和作為煙草和擬南芥的內參基因。根據(jù)基因的編碼序列設計熒光定量引物(表1), qRT- PCR在ABI7500 (美國ABI公司)儀器中進行, 采用2–??Ct方法分析基因的相對表達情況。

1.2.2 煙草和擬南芥干旱脅迫處理 將2個敲除株系與K326種子同時播種在育苗盆中, 2周后挑選大小一致的植株移栽到花盆里, 煙苗生長到五葉一心時停止?jié)菜? 進行干旱處理12 d后復水。試驗設置3個生物學重復。

擬南芥2個過表達株系與Col-0同時播種在育苗盤內(營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1), 幼苗生長到4周時停止?jié)菜＿M行干旱處理7 d后復水。試驗設置3個生物學重復。

1.2.3 煙草和擬南芥鹽脅迫處理 經(jīng)表面消毒的及K326種子接種在MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng), 2周后挑選長勢大小一致的幼苗小心地轉移至分別含有0、50、100、150和200 mmol L–1NaCl的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長, 培養(yǎng)皿豎直放置于人工氣候培養(yǎng)室, 培養(yǎng)條件為光照16 h/黑暗8 h, 培養(yǎng)2周。觀察幼苗在模擬鹽脅迫條件下根的生長發(fā)育情況, 照相并統(tǒng)計根長, 每個處理設置3個生物學重復。

擬南芥種子在超凈工作臺中進行種子表面消毒,具體步驟為75%的乙醇處理5 min, 無水乙醇處理1 min, 消毒完后的種子置于濾紙上完全晾干, 將無菌種子分別接種于0、100和150 mmol L–1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上進行種子萌發(fā), 觀察1周內種子的萌發(fā)情況并照相記錄。每個處理設置3個生物學重復。

1.2.4 植株生理指標測定 按照參考文獻測定[25]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)活性及丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)含量, 根據(jù)文獻方法測定[26]過氧化氫酶(catalase, CAT)活性, 磺基水楊酸測定脯氨酸含量[27], 考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量, 采用NBT染色法檢測超氧陰離子含量(索萊寶, 中國)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Excel和SigmaPlot 14.0軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析, 用SPSS 20.0軟件進行顯著性檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 NtNAC080表達模式分析

本研究利用qRT-PCR方法在煙草不同組織器官中的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn),的轉錄水平在下部葉片中最高, 在頂芽中表達量極低(圖1-A)。此外,在上部葉、中部葉、根、莖和花中表達量較高。為研究在非生物脅迫應答中的作用, 本研究進一步研究了在鹽脅迫和干旱脅迫下的表達模式。鹽和干旱脅迫處理均可顯著誘導的表達(圖1-B, C)。同時, 我們分析了外源激素處理下的表達情況發(fā)現(xiàn), ABA及SA處理后,的表達量持續(xù)快速升高, 但MeJA處理后的表達量在1 h時急劇上升, 隨后表達量均低于1 h (圖1-D～F)。

表1 用于qRT-PCR分析的引物序列

圖1 NtNAC080表達模式分析

LB: 側芽; R: 根; S: 莖; UL: 上部葉; ML: 中部葉; LL: 下部葉; AP: 頂芽; F: 花。*表示在0.05概率水平差異顯著。

LB: lateral bud; R: root; S: stem; UL: the upper leaf; ML: the middle leaf; LL: the low leaf; AP: the apical bud; F: flower. * means significant difference at the 0.05 probability level.

2.2 NtNAC080敲除增強了煙草植株的耐鹽性

在正常生長條件下,敲除株系與K326根長沒有明顯差異, 鹽脅迫條件下, 2個敲除株系根長明顯長于對照K326。當NaCl濃度達到200 mmol L–1時, K326平均根長約為2 cm, 與正常生長情況下相比減少4 cm,敲除株系平均根長約為4.3 cm, 與正常生長情況下相比減少2 cm (圖2-A, B)。表明基因敲除后增強了煙草植株對鹽脅迫的耐受性, 因此基因可能作為一個負調控因子參與了植株對鹽脅迫的響應。

植物體內的SOD、POD、CAT是生物膜保護酶系統(tǒng)的重要成員, 它們協(xié)同作用, 防御活性氧(ROS)或其它過氧自由基對膜系統(tǒng)的傷害, 抑制膜脂過氧化, 減輕干旱脅迫對細胞的傷害[28-29]。正常條件下, K326與敲除株系的SOD、POD, CAT酶活性沒有明顯差異, 鹽脅迫條件下,敲除株系SOD、POD、CAT酶活顯著高于K326, 且3種酶的活力隨著鹽濃度增大而逐漸升高, 且顯著高于對照K326 (圖2-C～E)。植物遭遇脅迫時體內的MDA含量會顯著增加, 細胞內MDA含量可反映膜脂過氧化損傷程度和膜系統(tǒng)的完整性[32]。為抵御這些脅迫刺激, 植物通過增加可溶性蛋白來保持某些主要生物大分子的結構完整, 使細胞保持生物活性[29], 此外, 還會分泌一些游離脯氨酸來重建植物體內離子平衡, 防止細胞失水[30]。在正常條件下, K326與敲除株系MDA, 可溶性蛋白及脯氨酸含量沒有明顯差異(圖2-F～H); 而在鹽脅迫條件下,敲除株系MDA含量顯著低于K326, 可溶性蛋白及脯氨酸含量顯著高于K326。表明可通過影響SOD、POD、CAT抗氧化酶活性、MDA、可溶性蛋白及脯氨酸含量來降低鹽脅迫對煙草幼苗的傷害。

2.3 NtNAC080敲除增強了轉基因煙草植株的抗旱性

敲除株系與K326在干旱處理前生長狀態(tài)基本一致。干旱處理12 d后, K326植株底部葉片變黃并干枯, 其余葉片縮小卷曲, 萎蔫嚴重。而敲除株系在干旱處理后表現(xiàn)出明顯的抗旱表型, 僅底部第一片真葉表現(xiàn)出變黃干枯的表型,其余葉片略有萎蔫現(xiàn)象。復水3 d后, K326煙草葉片不能恢復到正常生長狀態(tài), 而敲除株系復水后能卻能迅速地恢復到較為挺拔的生長狀態(tài)(圖3-A)。說明基因敲除后增強了煙草植株對干旱的抗性。

在干旱脅迫下,敲除株系SOD、POD、CAT酶活與K326相比均有顯著性差異(圖3-B～D), 說明煙草植株在干旱脅迫下能夠提高與ROS清除相關酶的活性, 適應并減輕干旱對其造成的傷害。此外, 在干旱脅迫下,敲除株系中MDA含量顯著低于K326 (圖3-E), 說明在干旱脅迫下,敲除株系有一定的膜脂過氧化調節(jié)能力, 可明顯降低干旱脅迫對煙草的膜脂過氧化程度, 維持膜的穩(wěn)定性。

圖2 煙草ntnac080敲除植株在鹽脅迫下表型分析

A:敲除系和K326煙草植株在鹽脅迫下的表型。B: 幼苗在含0、50、100、150和200 mmol L–1NaCl的MS培養(yǎng)基上生長2周的根長統(tǒng)計。C～E: 鹽處理前后敲除系和K326煙草葉片中抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)分析。F～H: 鹽處理前后敲除系和K326煙草葉片中MDA含量、可溶性蛋白含量以及脯氨酸含量。*表示在0.05概率水平差異顯著。

A: phenotypes ofand K326 tobacco under control and NaCl treatment. B: seedlings were vertically cultivated on MS plates containing 0, 50, 100, 150, and 200 mmol L–1NaCl. C–E: POD, SOD, and CAT activities of K326 andmutant under various concentration of salt treatment. F–H: MDA, soluble protein, and proline contents of K326 andmutant under salt treatment. * means significant difference at the 0.05 probability level.

(圖3)

A:敲除系煙草植株和K326在干旱脅迫下的表型。B～D: 干旱處理前后敲除系和K326煙草葉片中抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)分析。E: 干旱處理前后敲除系和K326煙草葉片中MDA含量。*表示在0.05概率水平差異顯著。

A: phenotypes of tobacco plants treated with drought stress. B–D: POD, SOD, and CAT activities of K326 andmutant under drought treatment. E: MDA content of K326 andmutant under drought treatment. * means significant difference at the 0.05 probability level. 0D: 0 day; 12D: 12 days.

2.4 NtNAC080在擬南芥中過表達功能驗證

為進一步探究在鹽和干旱脅迫下的作用, 本研究在擬南芥中異源過表達基因并進行功能分析。qRT-PCR分析顯示,在和株系中的轉錄水平分別是Col-0的200倍和486倍(圖4-A)。本研究對擬南芥株系進行了耐鹽性分析(圖4-B, C)發(fā)現(xiàn), 不加NaCl處理時種子的萌發(fā)率沒有明顯差異; 而100 mmol L–1和150 mmol L–1NaCl處理下,株系的發(fā)芽率顯著低于Col-0,表明株系對鹽脅迫更為敏感。鹽脅迫往往會導致植物細胞產(chǎn)生過多的ROS。為明確耐鹽性的降低是否與ROS水平的改變有關, 通過NBT染色來觀察葉片中超氧化物自由基(O2–)的水平。正常情況下株系與Col-0葉片中NBT染色后的顏色無顯著差異。在200 mmol L–1NaCl處理下,株系積累了更多的O2–, 葉片呈現(xiàn)出濃厚的深藍色(圖4-D); 同時, 本研究測定了株系和Col-0的內源H2O2水平。在鹽脅迫下,株系比Col-0積累了更多的H2O2(圖4-E)。表明, 在擬南芥中過表達可誘導鹽脅迫下植株ROS的積累。此外, 本研究分析了株系和Col-0在正常和脅迫條件下的SOD、POD和CAT酶活。在正常條件下,株系與Col-0相比無明顯差異, 而鹽脅迫處理后,株系中SOD、POD和CAT酶活顯著低于Col-0 (圖4-F～H)。

A:基因在轉基因擬南芥中的表達量分析。B～C:在鹽脅迫下的萌發(fā)率。D: NBT染色。E: 測定不同基因型植物離體葉片中H2O2的積累。F～H: 鹽脅迫處理后過表達系和WT的POD、SOD、CAT活性。I:過表達系(OE3和OE6)和WT在干旱脅迫下的表型。J: 干旱脅迫后過表達系(OE3和OE6)和WT的存活率。K:過表達系(OE3和OE6)和WT離體葉片失水率。*表示在0.05概率水平差異顯著。

A: the relative expression analysis ofgene in transgenicplants by qRT-PCR. B–C: the germination of WT andoverexpression lines with different concentrations NaCl. D: NBT staining. E: measurement of accumulation of H2O2in detached leaves of plants with different genotypes. F–H: POD, SOD, and CAT activities ofoverexpression lines and WT after salt treatment. I: phenotypes ofoverexpression lines (OE3 and OE6) and WT under drought stress treatment. J: the survival rates ofoverexpression lines and WT after the drought stress. K: water loss rates of detached leaves fromoverexpression lines and WT. * means significant difference at the 0.05 probability level.

本研究對過表達株系及Col-0進行干旱脅迫處理。7 d后,和植株因缺水表現(xiàn)出嚴重的葉片干枯表型, 而Col-0植株未觀察到明顯的萎蔫癥狀(圖4-I)。復水3 d后, 過表達植株幾乎全部死亡, 而WT植株的存活率接近100% (圖4-J)。同時, 對過表達株系及Col-0進行了離體葉片失水率測定發(fā)現(xiàn),株系離體葉片失水率顯著高于WT (圖4-K)。表明, 過表達降低了擬南芥植株的抗旱性。

2.5 脅迫應答基因在敲除及過表達植株中表達量分析

敲除株系以及K326植株中脅迫相關基因、、、、表達量見圖5。脅迫處理后、、、、基因表達量均明顯升高, 且2個敲除株系中這些基因的表達量均顯著高于K326, 表明基因敲除后的煙草株系能夠通過提高抗性相關基因的表達量來響應逆境脅迫。

株系以及Col-0中脅迫相關基因、、、、表達量見圖6。在脅迫處理下,和株系中、、、、基因表達量均顯著低于Col-0。表明基因過表達能夠抑制脅迫相關基因的轉錄水平進而導致植株的抗逆性顯著降低。

3 討論

干旱和鹽脅迫會造成植物發(fā)育遲緩、抑制植物組織和器官的生長和分化, 使植物的發(fā)育進程提前[33]。NAC作為一類重要的轉錄因子, 在植物衰老及非生物脅迫應答中發(fā)揮著關鍵的調控作用[6]。先前的研究表明, 一些NAC轉錄因子成員作為調控衰老途徑的關鍵因子在植物應激反應中發(fā)揮重要作用[34-35]。例如, 在擬南芥中過表達小麥可以增強轉基因植株的耐鹽性和耐旱性, 同時轉基因植株表現(xiàn)出延遲衰老的表型[36]。擬南芥基因負向調節(jié)滲透脅迫的耐受性, 卻正向調節(jié)葉片和果實的衰老[8,37]。有趣的是, 水稻的同源基因在葉片衰老和非生物脅迫響應(高鹽和干旱)中都起正調控作用[38]。前期研究發(fā)現(xiàn)是葉片衰老的正向調控因子[24], 為探究該基因在調控衰老的同時是否對各種脅迫也有一定的響應, 本研究利用qRT-PCR對干旱鹽和外源激素下的轉錄水平進行分析, 發(fā)現(xiàn)轉錄水平在干旱、高鹽和外源ABA處理下快速上調, 暗示其參與衰老調控的同時還可能對其他多種非生物脅迫有應答。對煙草敲除株系以及擬南芥株系進行干旱脅迫時發(fā)現(xiàn),敲除株系抗旱能力相對于K326顯著增強, 而株系較Col-0相比則表現(xiàn)出對干旱十分敏感, 這與毛果楊基因在抗旱中功能相似[39]; 同時, 我們對基因敲除以及過表達株系進一步進行鹽脅迫處理,敲除株系的抗鹽能力較K326相比顯著增強,擬南芥過表達株系抗鹽能力較Col-0相比明顯減弱, 這些結果表明, 煙草基因功能與擬南芥功能相似, 即在鹽和干旱脅迫應答中起負向調控作用, 對植物葉片衰老起正向調控作用。

圖5 干旱和鹽脅迫應答基因在煙草敲除株系中的表達模式

*表示在0.05概率水平差異顯著。* means significant difference at the 0.05 probability level.

(圖6)

*表示在0.05概率水平差異顯著。* means significant difference at the 0.05 probability level.

正常生長條件下, 植物體內的活性氧(ROS)能夠被活性氧清除系統(tǒng)的各種酶(SOD、POD、CAT等)及時清除, 對細胞的正?；钚圆粫刑蟮挠绊慬40]。但干旱和鹽脅迫會使細胞內的活性氧水平迅速上升,破壞生物膜整體流動性、通透性和完整性, 導致細胞膜透性增大、細胞液外滲, 甚至導致細胞內膜系統(tǒng)的破壞及誘發(fā)細胞凋亡[41]。MDA作為一種脂質過氧化產(chǎn)物, 其含量高低代表著膜受損程度[42], 可溶性蛋白能夠維持植物細胞結構相對完整, 功能穩(wěn)定, 使細胞保持生物活性, 而脯氨酸作為一種滲透調節(jié)物質, 對細胞的滲透調節(jié)也起著關鍵作用[43]。在干旱和鹽脅迫下,敲除株系SOD、CAT和POD酶活、可溶性蛋白和脯氨酸含量均顯著高于K326, 而MDA含量顯著低于K326, 同時利用NBT染色對過表達株系在鹽脅迫下活性氧進行定性觀察, 發(fā)現(xiàn)擬南芥過表達株系的染色顏色較深。表明不僅能夠通過影響SOD、POD、CAT酶的活性來增強ROS清除能力, 還會通過影響可溶性蛋白及脯氨酸含量來維持細胞滲透平衡, 這與前人的研究結果一致, 即抗性較強的品種氧化損傷相對較小[44-45]。種子的萌發(fā)率是表征種子萌發(fā)水平和種子生活力的重要指標[46],株系在鹽脅迫條件下的種子萌發(fā)率低于Col-0, 說明基因過表達會導致種子在鹽脅迫萌發(fā)過程中細胞功能異常, 從而導致萌發(fā)率降低, 這與Jiang等[47]的研究結果一致, 表明基因的過表達可能會通過影響種子的萌發(fā)進而影響后期植株的抗逆性。

DREB類轉錄因子可以結合在DRE順式作用元件上, 從而調節(jié)一些抗性相關基因的表達, 使植株的抗旱能力顯著提高[48]。具有組織表達特異性, 屬于植物內向鉀離子通道基因, 在參與植物抗性調控中有重要作用[49]。及對Na+和K+的穩(wěn)態(tài)至關重要, 可提高ROS清除能力, 維持膜完整性[50]。是乙烯響應因子(ERF)超家族的成員, 能夠參與植物響應多種非生物脅迫的應答反應[51]。qRT-PCR結果表明,敲除會誘導這些抗性相關基因大量表達, 從而有利于提高煙草的抗性。這與閆筱筱等[52]的研究結果相似, 這表明能通過負調控相關抗性基因的表達來提高煙株抗旱及耐鹽性。

4 結論

本試驗對敲除株系進行鹽脅迫和干旱脅迫處理發(fā)現(xiàn),基因敲除后植株在耐鹽及抗旱能力均有所提高, 對其生理數(shù)據(jù)進行測定發(fā)現(xiàn)SOD、POD、CAT酶的活性以及可溶性蛋白及脯氨酸含量均高于K326, MDA含量低于K326, 結果與表型相符合。同時在擬南芥中異源過表達, 發(fā)現(xiàn)植物的抗逆性明顯減弱。因此,基因可能通過負調控抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)、MDA、可溶性蛋白和脯氨酸含量等生理生化反應以及脅迫相關基因表達進而提高植株的抗性。

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Expression and functional characterization oftranscription factor gene fromunder abiotic stress

WEN Li-Chao1,2, XIONG Tao3, DENG Zhi-Chao1,2, LIU Tao1,2, GUO Cun4, LI Wei1,*, and GUO Yong-Feng1,*

1Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China;2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Enshi Tobacco Company, Enshi 445000, Hubei, China;4Kunming Tobacco Company, Kunming 650000, Yunnan, China

NAC proteins, which constitute one of the largest plant-specific transcription factor families, are widely involved in the regulation of plant development, senescence and stress responses. To explore the function ofin abiotic stress response, qRT-PCR was used to analyze the relative expression pattern ofgenesunder different abiotic stress treatments. Results showed that the relative expression level ofgenes was induced by drought, salt, ABA, MeJA, and SA treatments. Themutant and WT (K326) plants were used to analyze the phenotypes under salt and drought stresses. Results showed thatknockout tobacco lines had increased tolerance to salt and drought stresses. Under salt and drought stresses treatments, the antioxidant enzymes (SOD, POD, and CAT) activities, soluble protein, and proline contents of these two knockout lines plants were significantly higher than those of WT, while MDA content was significantly lower than that of WT. In contrast,-overexpressingplants had more sensitive to salt and drought stresses. Furthermore,mutation in tobacco resulted in the up-regulated expression of abiotic stress-related genes (,, and) after salt and drought treatments. These results indicated thatcould be play a negative role in response to salt and drought stresses by regulating the activity of antioxidant enzymes and the relative expression level of stress-related genes.

tobacco;; ROS; the relative expression analysis; abiotic stresses

2023-02-10;

2023-02-28.

10.3724/SP.J.1006.2023.24193

通信作者(Corresponding authors):李偉, E-mail: liwei06@caas.cn;郭永峰, E-mail: guoyongfeng@caas.cn.

E-mail: 82101201624@caas.cn

2022-08-23;

本研究由國家自然科學基金項目(31400267, 31970204)和中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目(ASTIP-TRIC02)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31400267, 31970204) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program (ASTIP-TRIC02).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230227.1346.004.html

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