黃 莉 陳偉剛 李威濤 喻博倫 郭建斌 周小靜 羅懷勇 劉 念 雷 永 廖伯壽 姜慧芳

花生根部結瘤性狀QTL定位

黃 莉 陳偉剛 李威濤 喻博倫 郭建斌 周小靜 羅懷勇 劉 念 雷 永 廖伯壽 姜慧芳*

中國農業(yè)科學院油料作物研究所 / 農業(yè)農村部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室, 湖北武漢 430062

花生是我國重要的豆科油料作物和經濟作物。根瘤是花生共生固氮的重要場所, 研究花生根瘤形成的遺傳基礎, 有助于更好地研究花生根瘤固氮能力和固氮特性。然而, 關于花生根瘤形成的研究較少, 調控花生根瘤形成的遺傳機制不清楚。本研究通過對一個高世代RIL群體的根部結瘤性狀進行調查, 鑒定到7份根部不結瘤家系, 根部不結瘤家系的葉綠素含量, 以及株高、單株鮮重、單株干重均顯著低于雙親。利用前期構建的SSR標記遺傳連鎖圖, 在A08和B07染色體上各鑒定到1個主效QTL和。通過InDel標記加密, 將QTL的區(qū)間由4.7 Mb縮小至1.6 Mb, 遺傳變異解釋率由9.1%增加至16.4%;的區(qū)間由9.9 Mb縮小至1.8 Mb, 遺傳變異解釋率由7.1%增加至9.9%。根據(jù)基因功能注釋, 2個QTL區(qū)間分別鑒定到4個和2個結瘤素基因存在變異位點。本研究將為解析花生根瘤形成發(fā)育以及共生固氮提供理論依據(jù)。

花生; 結瘤; QTL定位; 連鎖分析

花生(L.)是我國重要的油料與經濟作物之一, 是食用植物油和蛋白質的重要來源, 在國民經濟和社會發(fā)展占有重要地位。我國是世界上花生總產量和消費量最大的國家, 而且花生的總產、單產、單位面積產油量以及種植業(yè)產值均居國內油料作物首位[1]。花生作為豆科作物, 根瘤固氮對氮素積累的貢獻率高達50%, 是花生氮素供應的主要方式[2]。根瘤固氮能力直接影響著植株地上部的生長和產量的形成, 根瘤固氮能力越強, 植株固氮積累量及產量越高。對花生根瘤固氮相關指標及其與產量的相關性分析表明根瘤數(shù)和根瘤鮮重與根瘤固氮積累量、供氮比例和莢果產量呈正相關, 高產品種具有良好的固氮能力[3]。因此, 研究花生根瘤形成的遺傳基礎, 有助于更好地研究花生根瘤固氮能力和固氮特性, 為花生根瘤高效固氮提供理論依據(jù)。

根瘤的形成和發(fā)育過程受結瘤因子信號通路(Nod Factor Signaling Pathway)和結瘤自調控信號通路(Autoregulation of Nodulation Signaling Pathway)調控。豆科植物在根際釋放代謝產物類黃酮物質, 根瘤菌感知類黃酮信號附著于根毛上, 激活結瘤基因的表達, 釋放結瘤因子(Nod Factor, NF)到植物根際。根毛表皮細胞質膜上的NFR1 (Nod Factor Receptor 1)和NFR5 (Nod Factor Receptor 5)受體識別結瘤因子后, 二者形成共受體將信號向下傳遞, 誘導產生鈣震蕩, 進而通過依賴于Ca2+、鈣調素的激酶CCaMK與其磷酸化底物CYCLOPS的相互作用, 激活下游的轉錄因子, 如()、()和()等, 最后促進下游早期結瘤相關基因表達, 如()、(), 從而形成根瘤原基, 即根瘤[4-7]。由于根瘤菌的侵染, 根被誘導生成一種CLE類小肽, 通過植物的傳導結構向地上運輸, 并作為富亮氨酸類受體激酶(LRR-RLK)的配體在莖部與LRR-RLK互作, 并使之激活[8]。類受體蛋白激酶可能介導合成與結瘤有關的信號分子, 通過傳導結構被運送至根部, 調控根部結瘤的數(shù)量[9-10]。此外, microRNA也參與根瘤的形成與發(fā)育,能夠靶向切割百脈根的mRNA, 阻礙侵染線的形成并抑制根瘤發(fā)育[11]。光信號能夠通過誘導大豆地上組織合成TGACG-motif結合因子3/4 (GmSTF3/4)和 FLOWERING LOCUS T (GmFTs)蛋白, 并將這2個蛋白長距離轉運至根中從而調控大豆根瘤形成[12]。綜上, 豆科植物根瘤的形成發(fā)育是一個復雜的過程, 受到多個基因的協(xié)同調控。

國內外在百脈根、大豆等根瘤形成上的研究較多, 但花生根瘤已有的研究主要集中在根瘤菌與花生共生互作過程的生理特征, 關于根瘤形成發(fā)育的遺傳基礎研究較少?；ㄉ龅男纬砂l(fā)育過程可以分為侵染(1 d)、根瘤原基形成(4 d)、根瘤相似結構形成(8 d)、未成熟根瘤形成(12 d)、成熟根瘤(21 d) 5個階段[13]。模式豆科植物中, 結瘤因子被受體識別后, 誘導根毛變形彎曲, 形成侵染線, 以“侵染線(Infection Thread)”方式進入寄主植物表皮層細胞。根瘤菌在花生中是以“裂隙侵染(Crack-Entry)”方式通過寄主植物表皮傷口, 從細胞間隙侵染進入, 不同于模式豆科植物[13-14]。研究人員認為, 花生根瘤的形成機制與模式豆科植物根瘤形成機制存在不同,花生“裂隙侵染”形成根瘤的方式更為古早[15-16]。早期研究發(fā)現(xiàn)通過雜交2個根部結瘤的花生材料, 其重組自交系后代中會出現(xiàn)不結瘤家系材料, 遺傳學分析表明花生根瘤數(shù)受2個獨立基因調控, 當2個隱性等位基因重組在一起時, 出現(xiàn)根部不結瘤的現(xiàn)象[17-18]。對侵染根瘤菌5 d后的根進行轉錄組分析表明, 結瘤與不結瘤材料之間表達差異顯著的基因與一些已知的結瘤因子信號通路基因同源, 如、、、等[19]。

本研究利用一個高世代RIL群體, 通過對其根瘤多年鑒定, 發(fā)掘根部不結瘤種質, 對根部不結瘤種質材料的葉綠素含量以及農藝性狀進行鑒定, 并通過QTL定位分析, 挖掘花生根部結瘤性狀的主效QTL, 為花生根瘤形成發(fā)育以及共生固氮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以油料所培育的品種中花10號為母本、資源材料ICG12625為父本進行雜交, 通過單粒傳法連續(xù)多代自交, 構建了一個高世代的重組自交系群體(recombinant inbred lines, RIL), 共包含140個家系。其中, 中花10號為珍珠豆類型花生, ICG12625為赤道類型花生。

1.2 田間試驗及根部結瘤性狀考察

親本及群體材料分別于2017年和2018年種植于湖北武漢中國農業(yè)科學院油料作物研究所試驗基地, 采用完全隨機區(qū)組設計, 2次重復, 每個小區(qū)單行種植, 每行15株, 行間距30 cm, 每行株距10 cm, 常規(guī)田間管理。收獲時, 考慮邊際效應, 剔除兩邊的植株, 從每行材料中間選取10株, 用清水洗凈根部泥土, 對根部結瘤情況進行觀察鑒定。

1.3 根部不結瘤材料葉綠素含量及農藝性狀鑒定

將RIL群體中鑒定到的穩(wěn)定不結瘤的家系分別于2019年和2020年種植于武昌湖北武漢中國農業(yè)科學院油料作物研究所試驗基地, 采用完全隨機區(qū)組設計, 2次重復, 每個小區(qū)單行種植, 每行15株, 行間距30 cm, 每行株距10 cm, 常規(guī)田間管理。親本和不結瘤家系每份材料各取10株, 利用SPAD- 502型手持式葉綠素儀在飽果期測量主莖上倒數(shù)第3完全展開葉。收獲時, 調查選取的每株材料的主莖高和單株植株鮮重, 并調查單株莢果干重。

1.4 根部結瘤性狀QTL定位分析

根據(jù)田間調查的結果, 將結瘤性狀分為“結瘤”和“不結瘤”, 視為質量性狀, 結合前期構建的該群體SSR分子標記遺傳連鎖圖[20], 利用Windows QTL Cartographer V. 2.5軟件復合區(qū)間作圖法(composite interval mapping, CIM)進行QTL定位分析。LOD值大于3.0的QTL被認為主效QTL。將QTL兩側SSR標記的引物序列在PeanutBase數(shù)據(jù)庫(www. peanutbase.com)中與已發(fā)表的栽培種花生基因組序列進行比對, 獲得該標記在基因組上的物理位置。利用實驗室已有的親本中花10號和ICG12625的基因組重測序數(shù)據(jù), 使用GATK軟件包檢測QTL區(qū)間內兩親本間的SNP和InDel差異位點, 將差異片段>3 bp的InDel位點作為目標InDel, 將其上下游各500 bp的DNA序列從PeanutBase數(shù)據(jù)庫中下載, 并利用Primer 5.0軟件設計正向和反向引物。設計完成的引物序列在PeanutBase數(shù)據(jù)庫中與栽培種花生基因組序列比對, 確認該引物是否為目標InDel位點的有效擴增。利用這些開發(fā)的InDel標記對RIL群體進行擴增, 對主效QTL進行加密分析。

1.5 QTL區(qū)間多態(tài)性位點分析

使用ANNOVAR軟件對加密后的QTL區(qū)間內的變異位點進行注釋, 并預測變異對基因功能的影響, 根據(jù)變異位點在參考基因組上的位置信息(UTR區(qū)、基因間區(qū)、基因區(qū)或CDS區(qū)等), 判斷變異對基因的影響(同義突變、非同義突變等)。

1.6 QTL區(qū)間基因表達分析

利用R軟件包“biomaRt” (https://bioconductor. org/packages/release/bioc/html/biomaRt.html)將已發(fā)表的花生多組織轉錄組測序獲得的read counts數(shù)據(jù)[21]轉換成FPKM值, 分析QTL區(qū)間內基因在花生根與根瘤中的表達水平。

2 結果與分析

2.1 花生根部結瘤性狀的鑒定

連續(xù)2年對140份RIL群體及其親本材料的根部結瘤情況進行調查發(fā)現(xiàn), 親本中花10號和ICG12625根部均有根瘤, RIL群體中出現(xiàn)不結瘤家系。母本中花10號平均根瘤數(shù)為187個, 父本ICG12625平均根瘤數(shù)為92個。RIL群體中鑒定到7份家系在2年的環(huán)境中穩(wěn)定地表現(xiàn)為植株根部不結瘤(圖1)。

2.2 花生根部不結瘤家系性狀鑒定

將這7份不結瘤家系與結瘤家系及親本進行對比發(fā)現(xiàn), 不結瘤家系葉片偏黃。對這7份不結瘤家系和親本材料的葉綠素含量進行測定, 不結瘤家系2019年葉片的葉綠素含量變異范圍在20.41～29.22 SPAD, 2020年葉片的葉綠素含量變異范圍在24.37～ 29.97 SPAD, 而母本材料中花10號2年的葉綠素含量分別為43.91 SAPD和45.80 SPAD, 父本材料ICG12625兩年的葉綠素含量分別為40.92 SAPD和46.18 SPAD。不結瘤家系的葉片葉綠素含量均顯著低于2個親本材料的葉綠素含量。株高方面, 除L099家系跟母本中花10號株高無差異, 其他6份不結瘤家系的株高2年均顯著低于雙親材料, 2019年株高變異范圍為30.33～38.52 cm, 2020年株高變異范圍為28.23～39.63 cm。不結瘤家系的單株植株鮮重變異范圍為119.0～208.8 g, 單株莢果干重變異范圍為16.1～29.6 g, 均顯著低于雙親材料(表1)。

圖1 花生植株根部結瘤

A: 結瘤的根; B: 不結瘤的根。A: root with nodules; B: root without nodules.

2.3 花生根部結瘤性狀QTL定位

將該RIL群體根部結瘤性狀分為“結瘤”與“不結瘤”, 通過WinQTLCart2.5進行QTL定位分析, 鑒定到2個主效QTL和, 分別位于連鎖群A08和B07。QTL的LOD值為3.7, 遺傳變異解釋率為9.1%, 區(qū)間兩側標記分別為AHGS1880和AGGS1495。QTL的LOD值為3.1, 遺傳變異解釋率為7.1%, 區(qū)間兩側標記分別為Ai07B24086和Ai07B26973。將QTL區(qū)間兩側SSR分子標記的引物序列與四倍體栽培種花生Tifrunner基因組序列進行比對, QTL定位到染色體A08上9.5～14.2 Mb區(qū)間,定位到染色體B07上118.7～128.6 Mb區(qū)間(表2)。

表1 不結瘤家系和親本的葉片葉綠素含量和農藝性狀鑒定

表2 花生根部結瘤性狀QTL定位

QTL: quantitative trait locus; PVE: phenotypic variation explained.

2.4 花生根部結瘤性狀QTL加密分析

利用親本中花10號和ICG12625的重測序數(shù)據(jù),在染色體A08上9.5～14.2 Mb區(qū)間和B07上118.7～128.6 Mb區(qū)間鑒定親本間堿基差異。2個親本在QTL區(qū)間內有647個SNP差異和117個InDel差異, 在區(qū)間內有1609個SNP差異和564個InDel差異?；贗nDel差異, 在2個QTL區(qū)間分別開發(fā)了10個和19個InDel標記, 并在RIL群體中進行擴增。利用這些InDel標記在RIL群體中基因型, 在染色體A08上9.5～14.2 Mb區(qū)間加密構建了一個包含10個標記、遺傳距離17.6 cM的連鎖群, 在染色體B07上118.7～128.6 Mb區(qū)間加密構建了一張包含19個標記、遺傳距離18.8 cM的連鎖群。

利用這2個加密的連鎖群, 對不結瘤性狀進行QTL分析, 在這2個連鎖群上仍然鑒定到2個主效QTL (表3和圖2)。區(qū)間為6.9～13.5 cM, LOD值由3.7增加到5.9, 遺傳變異解釋率由9.1%增加到16.4%, 比對基因組序列后, 該QTL區(qū)間物理位置由原來的4.7 Mb縮小至1.6 Mb。區(qū)間為9.9～15.2 cM, LOD值由3.1增加到3.7, 遺傳變異解釋率由7.1%增加到9.9%, 同時該QTL區(qū)間物理位置由原來的9.9 Mb縮小至1.8 Mb。通過標記加密, 2個QTL區(qū)間物理位置均縮小至2 Mb以內。

表3 標記加密后的根部結瘤性狀主效QTL信息

QTL: quantitative trait locus; PVE: phenotypic variation explained.

圖2 標記加密后的根部結瘤性狀主效QTL

2.5 根部結瘤性狀QTL加密區(qū)間變異位點分析

QTL加密后,區(qū)間1.6 Mb內有237個多態(tài)性位點, 其中包括198個SNP差異和39個InDel差異。對這些變異位點進行了分析, 接近80%的變異位點位于基因間區(qū), 而在基因內的變異位點中, 存在8個外顯子變異位點, 其中有5個變異位點屬于非同義突變。區(qū)間1.8 Mb內有269個多態(tài)性位點, 其中包括199個SNP差異和70個InDel差異。約85%的變異位點位于基因間區(qū), 基因內僅有3個變異位點位于外顯子區(qū)域, 分別為1個非同義突變、1個翻譯提前終止和1個非移碼缺失(表4)。

表4 主效QTL候選區(qū)間內SNP和InDel注釋結果

此外, 加密后的區(qū)間和區(qū)間各包含88個和80個基因?；趨⒖蓟蚪M基因功能注釋, 這2個QTL區(qū)間中分別包含6個結瘤素基因, 其中基因、、和在兩親本之間沒有差異位點, 其他8個結瘤素基因共有42個變異位點, 包含26個基因間區(qū)變異位點和16個基因區(qū)變異位點, 重要的變異位點信息見表5。

表5 基因區(qū)存在變異位點的結瘤素基因

2.6 根部結瘤性狀QTL區(qū)間內基因表達分析

利用已發(fā)表的花生多組織的轉錄組數(shù)據(jù), 對QTL和區(qū)間內的基因進行表達分析。QTL區(qū)間內有19個基因在根和根瘤中均不表達, 有8個基因在根和根瘤中基因表達FPKM值均小于2。結瘤素基因和在根中的表達量顯著高于根瘤的表達, 而和在根瘤中的表達顯著高于根的表達, 并且基因在根中幾乎不表達。QTL區(qū)間內有22個基因在根和根瘤中均不表達, 有9個基因在根和根瘤中基因表達FPKM值均小于2。結瘤素基因和在根中的表達量顯著高于根瘤的表達, 而和在根瘤中的表達顯著高于根的表達。同時在根中幾乎不表達,在根瘤中幾乎不表達(表6)。

3 討論

花生與根瘤菌互作形成根瘤, 根瘤是花生進行生物固氮的重要場所。本研究連續(xù)2年對140份RIL群體及其親本材料的根部結瘤情況進行調查發(fā)現(xiàn), 親本材料中花10號和ICG12625根部均有根瘤, RIL群體中出現(xiàn)不結瘤的材料。前人研究分析發(fā)現(xiàn)花生不結瘤受2對隱性基因共同調控[17-18]。通過QTL定位分析, 鑒定到2個主效QTL和, 分別位于連鎖群A08和B07, 根據(jù)加性效應值推測2個主效QTL分別來源于2個親本。分析不結瘤家系的基因型發(fā)現(xiàn), 父本ICG12625攜帶的隱性等位基因, 而母本中花10號攜帶的隱性等位基因。只有2個QTL的隱性等位基因聚合在一起時, 才會抑制根瘤的形成, 導致根部不結瘤。對花生核心種質資源的多年田間觀察, 沒有觀察到不結瘤的材料, 說明雙隱性等位基因的組合在自然界中幾乎不存在。

表6 主效QTL區(qū)間內結瘤素基因在根和根瘤中的表達

基于分子標記和RIL群體的連鎖分析是QTL定位研究的重要方法之一。本研究利用前期已構建的SSR分子標記的遺傳連鎖圖[20]和RIL群體的根部結瘤情況, 在A08染色體和B07染色體上分別各定位到一個結瘤性狀的主效QTL。但是由于SSR標記的遺傳連鎖圖定位精度較低, 2個QTL在物理圖譜上區(qū)間還比較大。近年來, 隨著高通量測序技術的發(fā)展, 基于基因組重測序技術開發(fā)SNP標記和InDel標記成為可能。但是由于SNP標記需要通過測序技術檢測結果, 而InDel標記的擴增只需通過PAGE膠或者瓊脂糖膠檢測, 因此InDel標記是成為加密QTL的最快捷有效的標記。本研究利用親本基因組重測序的數(shù)據(jù), 在基于SSR標記檢測到的2個主效QTL區(qū)間內設計InDel標記進行QTL加密。加密后, 2個主效QTL的LOD值和遺傳變異解釋率均有所增加, 同時,區(qū)間由4.7 Mb縮小至1.6 Mb,區(qū)間由9.9 Mb縮小至1.8 Mb。通過InDel標記加密, 將QTL區(qū)間均縮小至2 Mb, 這為后續(xù)挖掘候選基因提供了理論基礎。

根瘤的形成和發(fā)育離不開植物基因的調控和參與。結瘤素基因是指一些在根瘤形成發(fā)育過程中特異表達并參與共生固氮作用的植物基因, 對根瘤結構的形成及發(fā)育、固氮產物的代謝都有重要作用[22]。根據(jù)結瘤素基因表達時間的早晚分為早期結瘤素基因()和晚期結瘤素基因()。在根瘤固氮之前表達的植物基因被稱為早期結瘤素基因, 一般在根瘤菌侵染幾個小時后到根瘤形成、固氮作用之前出現(xiàn), 主要參與根瘤的形成和發(fā)育。而晚期結瘤素基因則在發(fā)育完全的、成熟的根瘤中表達, 參與維持根瘤的結構以及共生固氮[23]。的表達參與了皮層細胞分裂, 導致根瘤原基的形成[24-25]; 敲除不影響侵染線的形成, 但會抑制根瘤的形成[26]; 大豆中miR393j-3p可以通過靶向調控而負向調控根瘤的形成[27]。此外, 蒺藜苜蓿中的和[28]、蠶豆中的和[29]、大豆中的[30]均被報道可能涉及豆科植物的根瘤形成和發(fā)育。本研究在2個主效QTL區(qū)間內均鑒定到8個結瘤素基因在基因區(qū)有變異位點, 同時部分結瘤素基因在根和根瘤中的表達有顯著差異, 但現(xiàn)有的結果還不能充分確定這些結瘤素基因是否與調控花生根瘤形成的關聯(lián)性, 還需要后續(xù)的試驗驗證。

4 結論

本研究鑒定到7份根部不結瘤的花生材料, 根部不結瘤家系的葉綠素含量以及株高、單株鮮重、單株干重均顯著低于雙親。利用連鎖分析, 在A08和B07染色體上各鑒定到1個主效QTL和。

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Identification of major QTLs for nodule formation in peanut

HUANG Li, CHEN Wei-Gang, LI Wei-Tao, YU Bo-Lun, GUO Jian-Bin, ZHOU Xiao-Jing, LUO Huai-Yong, LIU Nian, LEI Yong, LIAO Bo-Shou, and JIANG Hui-Fang*

Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062, Hubei, China

Peanut is an important oil and economic crop of legumes in China. Nodules are important for symbiotic nitrogen fixation in peanut. Dissecting the genetic basis of nodule formation could promote the understanding of nitrogen fixation ability and characteristics of nodules in peanut. However, there are few studies on nodule formation and the genetic basis of nodule formation remained unclear in peanut. In this study, the nodules were investigated in a high generation RIL population and seven lines were identified without nodule. The chlorophyll content, plant height, fresh weight per plant, and dry weight per plant of the lines without nodule were significantly lower than those of parents. Using the previous genetic linkage map based on SSR markers, major QTLsandwere identified on chromosome A08 and B07, respectively. The InDel markers in the two major QTLs were developed by the genome resequencing data of parents and performed amplification in the RILs. The interval of QTLsandwas reduced to 1.6 Mb and 1.8 Mb, respectively. Meanwhile, the phenotypic variation explained of these two QTLs was increased to 16.4% and 9.9%, respectively. There were four and two nodulin genes variation loci in the two target intervals, respectively. This study provided the understanding for unveiling the genetic basis of formation and development of nodule and symbiotic nitrogen fixation in peanut.

peanut; nodule formation; QTLs mapping; linkage analysis

2023-02-10;

2023-02-22.

10.3724/SP.J.1006.2023.24184

通信作者(Corresponding author):姜慧芳, E-mail: peanutlab@oilcrops.cn

E-mail: huangli5100@126.com

2022-08-09;

本研究由財政部和農業(yè)農村部國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-13)和中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目(2022-2060299- 089-031)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-13) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences (2022-2060299-089-031).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230221.1719.014.html

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