韋新宇 曾躍輝 楊旺興 肖長春 候新坡 黃建鴻 鄒文廣 許旭明,*

利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯基因創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)香型秈稻三系不育系

韋新宇1,3,**曾躍輝1,3,**楊旺興2,3肖長春1,3候新坡2,3黃建鴻1,3鄒文廣2,3許旭明2,3,*

1三明市農(nóng)業(yè)科學研究院生物技術(shù)研究所, 福建三明 365500;2三明市農(nóng)業(yè)科學研究院水稻研究所, 福建三明 365500;3福建省(山區(qū))作物遺傳改良與創(chuàng)新利用重點實驗室, 福建三明 365500

稻米香味是水稻的重要食味品質(zhì)之一, 其主要受第8染色體上編碼甜菜堿脫氫酶基因控制, 該基因突變可導致香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加從而促進香味的產(chǎn)生。本研究以三明市農(nóng)業(yè)科學研究院自主選育的優(yōu)質(zhì)秈型雜交稻保持系明太B為受體, 利用CRISPR-Cas9技術(shù)對其基因進行編輯和敲除。獲得2個T0代轉(zhuǎn)基因純合突變體植株并對其衍生的48個T1代單株進行鑒定和分析, 獲得1個不含轉(zhuǎn)基因載體骨架且在第2外顯子插入單個堿基T的純合突變體株系明太B-。利用半定量PCR和qRT-PCR技術(shù)以及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測基因相對表達量和2-AP含量; 同時采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T 1433-2014)推薦的48對水稻SSR引物進行指紋圖譜分析。結(jié)果表明, 該株系基因RNA表達水平顯著下調(diào); 籽粒中香味物質(zhì)2-AP的含量顯著增加; 指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn), 僅1對引物Rm571在野生型和突變體之間鑒定到等位變異, 兩組材料遺傳差異較小。此外, 本研究還對野生型和突變體T2代植株表型性狀、稻米蒸煮食味品質(zhì)和外觀品質(zhì)指標進行了考察和測定分析。結(jié)果表明, 所有指標在兩組材料間均無顯著差異。進一步采用測交和回交轉(zhuǎn)育方法并結(jié)合位點測序分析, 成功選育獲得了其對應的純合香型三系不育系明太A-。通過與恢復系明恢703、明恢3009測配, 其組合產(chǎn)量與國家審定品種明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009相近且表現(xiàn)出較強的超標優(yōu)勢。此外, 通過與香型恢復系明恢1831測配后發(fā)現(xiàn)其組合籽粒中香味物質(zhì)2-AP含量極顯著高于對照組合明太A/明恢1831。因此, 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù), 可對水稻香味基因進行精準定向編輯和敲除, 實現(xiàn)對水稻香味性狀的改良, 為創(chuàng)制香型秈稻不育系提供理論指導, 從而加快香型雜交稻育種進程。

水稻; CRISPR-Cas9; 基因編輯; 香味;; 2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)

水稻是世界上重要的糧食作物之一。近年來, 隨著人們生活水平的穩(wěn)步提高和膳食結(jié)構(gòu)的不斷改變, 國內(nèi)外市場對優(yōu)質(zhì)稻米的需求日益增加, 傳統(tǒng)的水稻育種已無法滿足人們對優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻的強烈需求。香味作為考量水稻稻米食味品質(zhì)的一項極其重要的指標, 其愈來愈受到國內(nèi)外水稻遺傳學家和育種學家的高度關(guān)注。同時, 香稻作為水稻中一類特殊的栽培稻群體, 由于其稻米具有獨特的香味且食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良而被視為水稻中的珍品, 深受廣大消費者的青睞[1]。因此, 發(fā)掘和創(chuàng)制香稻種質(zhì)資源, 改善稻米香味品質(zhì), 培育優(yōu)質(zhì)香稻新品種已成為當前水稻遺傳改良的一項重要研究內(nèi)容。

隨著水稻分子生物學和基因組學的不斷發(fā)展, 許多研究者對水稻稻米香味的來源和分子遺傳機理進行了廣泛而深入的研究。水稻香味基因從初步定位到分離克隆以及功能分析, 再到目前在水稻遺傳育種中的廣泛應用, 已經(jīng)取得了巨大的進展。香稻中香味的遺傳基礎(chǔ)比較復雜, 但目前大部分研究結(jié)果表明, 水稻香味主要受一個編碼甜菜堿脫氫酶的細胞核隱性基因控制[2]。該基因位于水稻8號染色體, 包含15個外顯子和14個內(nèi)含子, CDS全長1512 bp, 共編碼503個氨基酸[3]。張江麗等[4]對來自國內(nèi)外不同地區(qū)86份香稻種質(zhì)資源進行了香味基因型的鑒定, 發(fā)現(xiàn)其極大部分種質(zhì)的香味性狀受等位基因控制。曾躍輝等[5]對來自我國南方稻區(qū)不同省份的32份優(yōu)質(zhì)香稻品種進行了基因型鑒定和分析, 研究發(fā)現(xiàn)如玉針香、美香占2號、贛香占1號等28份目前在水稻遺傳育種中被廣泛應用的優(yōu)質(zhì)香稻品種的香味性狀均來源于水稻8號染色體上編碼甜菜堿脫氫酶基因的功能缺失突變, 且主要表現(xiàn)為在基因第7外顯子發(fā)生8 bp缺失和3個單核苷酸(SNP)位點多態(tài)性突變, 屬于類型。此外, Shi等[6]和Shao等[7]研究發(fā)現(xiàn)在一些不同的地方香稻品種中存在不同類型的等位基因突變, 即表現(xiàn)為基因第7外顯子堿基序列正常, 但在第2外顯子處發(fā)生7 bp堿基缺失的突變類型以及在基因第4和第5外顯子之間發(fā)生1個803 bp片段缺失的突變類型, 導致基因發(fā)生移碼突變, 從而產(chǎn)生濃郁的香味。2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1- pyrroline, 2-AP)是一種特殊的具有濃郁爆米花香味的揮發(fā)性物質(zhì), 已有學者研究表明, 2-AP是水稻稻米香味的特征化合物和主要香氣貢獻物[8]。在基因編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)發(fā)生突變的香稻品種中, 其所編碼的蛋白甜菜堿脫氫酶(BADH2)翻譯提前終止, 導致BADH2功能保守的結(jié)構(gòu)域不能正常翻譯, 產(chǎn)生無生物活性的甜菜堿脫氫酶, 無法完成脫氫反應, 造成2-AP前體物質(zhì)4-氨基丁醛含量增加, 進而導致香味物質(zhì)2-AP在水稻葉片和籽粒中大量合成和積累, 最終使水稻產(chǎn)生濃郁的香味[9-12]。因此,是調(diào)控水稻稻米香味的主要基因, 自然突變或通過人工干預改變其DNA遺傳信息, 抑制基因的表達, 即可使非香型水稻材料產(chǎn)生香味, 從而創(chuàng)制出新的香稻種質(zhì)資源。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展, 分子標記輔助選擇育種、分子設(shè)計育種、全基因組育種以及轉(zhuǎn)基因育種等技術(shù)已經(jīng)成為水稻遺傳育種過程中重要且高效的分子育種技術(shù)和策略, 可明顯提高育種效率, 加快香稻新品種的培育, 從而彌補傳統(tǒng)育種中的缺陷和不足, 實現(xiàn)水稻產(chǎn)量的突破和稻米品質(zhì)的同步提高。近年來, 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟, 利用基因編輯技術(shù)對目標性狀基因進行定點改良已成為行之有效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段之一。其中RNAi技術(shù)[13]、ZFN (鋅指核酸酶)技術(shù)[14]和TALEN (轉(zhuǎn)錄激活樣效應因子核酸酶)技術(shù)[15]在早期的基因功能研究方面被視為有效的基因編輯工具。Niu等[16]利用RNAi技術(shù), 成功降低了日本晴轉(zhuǎn)基因后代植株中基因的表達, 從而使香味物質(zhì)2-AP的含量明顯增加。Chen等[17]通過人工microRNA轉(zhuǎn)基因技術(shù), 同樣實現(xiàn)了抑制日本晴中基因的表達, 在轉(zhuǎn)基因株系后代籽粒中2-AP的含量顯著提高。Shan等[18]通過TALEN技術(shù), 對日本晴香味基因進行基因組編輯, 通過后代分離鑒定, 在T1代株系中獲得了不含轉(zhuǎn)基因克隆載體且香味得到明顯改良的純合突變體材料。近年來, 新推出和發(fā)展起來的CRISPR-Cas9 (成簇規(guī)律間隔短回文重復技術(shù))是繼RNAi、ZFN和TALEN等基因編輯技術(shù)推出后的第3代基因編輯技術(shù)。由于其具有操作簡單、靶基因突變效率高、成本低且易獲得純合突變等特點, 目前已快速發(fā)展成為各研究領(lǐng)域中基因編輯和基因修飾方面最為關(guān)鍵的技術(shù)之一, 并廣泛應用于植物和動物基因功能和遺傳改良研究[19-20]。邵高能等[21]通過CRISPR-Cas9技術(shù)對常規(guī)粳稻品種中花11的香味基因進行編輯, 獲得了1株無轉(zhuǎn)基因載體骨架且在第1外顯子插入一個堿基T的純合突變體材料。該材料中基因RNA表達水平顯著下調(diào), 籽粒中香味物質(zhì)2-AP含量顯著提高, 成功地對中花11香味基因進行了編輯。祁永斌等[22]利用CRISPR-Cas9技術(shù)將常規(guī)粳稻品種嘉58和秀水134中的進行編輯, 成功獲得了多個在位點發(fā)生不同類型突變且無轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯株系, 株系籽粒中2-AP的含量均極顯著高于非轉(zhuǎn)基因野生型對照品種, 實現(xiàn)了對常規(guī)粳稻品種香味性狀的定向改良。因此, 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可快速、精準且高效地對水稻香味基因進行編輯, 從而加快香稻育種進程。但目前已報道的利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯基因的遺傳轉(zhuǎn)化受體如日本晴、中花11、嘉58和秀水134等均為粳稻模式品種或常規(guī)粳稻品種, 而在秈稻品種中的應用報道較少, 尤其對秈型三系雜交稻保持系親本材料香味基因的編輯從而創(chuàng)制香型三系不育系新品種的研究尚未見報道。

秈稻三系不育系作為雜交水稻的重要親本, 對雜交水稻新組合的培育具有十分關(guān)鍵的作用, 生產(chǎn)應用價值高。但目前秈稻三系不育系的選育主要還是通過常規(guī)的雜交、自交和多世代連續(xù)回交技術(shù), 若對其作單一香味性狀進行改良, 易帶來潛在不良性狀的連鎖累贅, 且周期長, 育種進程緩慢, 目前生產(chǎn)上育成的優(yōu)質(zhì)香型秈稻三系不育系較少。因此, 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對水稻香味基因進行定向編輯, 從而實現(xiàn)香味性狀的改良, 可有效提高育種效率, 進一步加快優(yōu)質(zhì)香型秈稻三系不育系的培育。明太A是三明市農(nóng)業(yè)科學研究院近年來自主選育的優(yōu)質(zhì)秈型雜交稻三系不育系, 其具有株型好、米質(zhì)優(yōu)、配合力強和異交結(jié)實率高等優(yōu)點。目前已利用該不育系育成國家審定雜交稻新品種3個, 省級審定雜交稻新品種5個。但該不育系不具有香味, 有待進一步集聚香味基因, 以增強其市場競爭力。本研究以明太A同型保持系明太B為研究材料, 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對其香味基因進行定向編輯, 通過PCR鑒定和測序分析獲得不含轉(zhuǎn)基因載體骨架且在位點發(fā)生純合突變的基因編輯株系明太B-。進一步通過測交和回交轉(zhuǎn)育方法并結(jié)合靶點檢測分析, 創(chuàng)制純合香型三系雜交稻不育系明太A-, 為香型秈稻三系不育系的選育提供新的育種思路, 同時為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)香型雜交稻新品種的選育提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以明太A同型保持系明太B為遺傳轉(zhuǎn)化受體, 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)并結(jié)合農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法對其基因進行敲除, 開展常規(guī)的轉(zhuǎn)基因試驗, 轉(zhuǎn)基因材料種植于三明市農(nóng)業(yè)科學研究院沙縣瑯口轉(zhuǎn)基因試驗基地, 常規(guī)田間種植及管理。

1.2 靶點設(shè)計及載體構(gòu)建

利用生物信息學數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://rice.plant-biology.msu.edu/index.shtml), 參考粳稻品種日本晴基因組, 下載水稻香味基因(基因登陸號:) DNA序列。結(jié)合https://crispr.cos. uni-heidelberg.de/index.html在線分析工具, 以基因的CDS序列為靶序列, 分別在其第1外顯子和第2外顯子區(qū)域設(shè)計靶點, 并通過BLAST比對分析, 確保其特異性。其中Target 1為靶點一, Target 2為靶點二, 分別加上對應的靶點接頭。其中Target 1-Fwd和Target 1-Rev為第1外顯子設(shè)計靶點接頭, Target 2-Fwd和Target 2-Rev為第2外顯子設(shè)計靶點接頭。二聚體制備(50 μL體系), 含H2O 40 μL、上下游引物各 5 μL。95℃預變性10 min, 以55℃退火10 min, 最后14℃保持5 min。利用北京唯尚立德生物科技有限公司提供的載體試劑盒將二聚體構(gòu)建至CRISPR-Cas9載體。10 μL體系含CRISPR-Cas9載體1.5 μL、二聚體2 μL、31I 0.5 μL、T4-ligase 0.5 μL、T4-buffer 1 μL和H2O 4.5 μL, 37℃反應2 h。構(gòu)建好的Cas9/sgRNA質(zhì)粒載體通過測序驗證后用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化并對目標基因進行編輯和敲除。

1.3 轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)建和檢測

構(gòu)建CRISPR-Cas9基因敲除表達載體, 通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化保持系明太B愈傷組織, 通過潮霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。采用改良的CTAB法提取轉(zhuǎn)基因T0代植株幼苗葉片基因組DNA, 利用潮霉素抗性標記引物-F/R和Cas9核酸酶特異性引物identify-F/R對提取的DNA進行PCR擴增檢測。PCR反應體系20 μL, 包括2×PCR MasterMix 10 μL (Vazyme), 正向引物1.0 μL (10 μmol L–1), 反向引物1.0 μL (10 μmol L–1), DNA模板1.5 μL (50 ng μL–1), ddH2O 6.5 μL。PCR反應程序為: 94℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共35個循環(huán); 72℃延伸7 min, 4℃保持。PCR擴增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離和純化, 出現(xiàn)明顯條帶的即為轉(zhuǎn)基因陽性植株, 無條帶的為陰性植株。T1代材料采用同樣的方法篩選無轉(zhuǎn)基因成分單株。

1.4 突變類型分析

根據(jù)水稻香味基因序列, 在其靶點位置上下游設(shè)計特異性測序引物Seq-F/R, 利用高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme)對基因編輯后代基因靶點相鄰序列進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL, 包括2×Phanta Max buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol L–1) 1 μL, 上游引物2.0 μL (10 μmol L–1), 下游引物2.0 μL (10 μmol L–1), Phanta Max Super-Fidelity DNA Poly-merase 1 μL, DNA模板2 μL (50 ng μL–1), ddH2O 17 μL。PCR反應程序為: 95℃預變性3 min; 95℃變性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35個循環(huán); 72℃延伸5 min, 4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠進行電泳和分離, 利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(OMEGA)對目的片段進行回收和純化或連接pMD18-T載體后送大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司測序。參照野生型明太B基因序列, 并利用Snapgene和DNAMAN等軟件對測序結(jié)果進行比對和分析, 同時觀察峰圖是否有套峰出現(xiàn)從而判斷其突變類型。測序峰圖中有套峰的為雜合突變, 無套峰且測序結(jié)果和野生型一致或不一致的分別為未突變和雙等位基因純合突變。

1.5 香味物質(zhì)2-AP含量測定

采用GC-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定香味物質(zhì)2-乙酰-1吡咯啉(2-AP)的含量, 以2,4,6,-三甲基吡啶(TMP)作為內(nèi)標, 最低檢出限為0.01 mg kg–1。收獲野生型和轉(zhuǎn)基因材料成熟種子, 脫殼并將糙米碾磨成粉末, 稱取1.0 g米粉樣品于5 mL錐形瓶中, 加入1.0 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg L–1的TMP提取試劑, 80℃水浴浸提3 h。取出后自然條件下冷卻至室溫, 將上清液移至帶內(nèi)插管的進樣瓶中, 靜置30 min后待測。氣體成分以高純氦氣作為傳送媒介連續(xù)注射至配置有光離子探測器的氣相色譜儀, 色譜柱為HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm), 恒壓不分流進樣,進樣量為1.0 μL。具體檢測方法參照應興華等[23], 并做了相應的改進。

1.6 Badh2基因表達分析

利用RNA提取試劑盒(Vazyme)提取野生型和轉(zhuǎn)基因突變體材料苗期葉片總RNA, 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)獲得第1鏈cDNA, cDNA模板稀釋一定倍數(shù)后用于半定量RT-PCR和熒光定量qRT-PCR, 分析香味基因相對表達量。使用SYBR qPCR Master Mix (Vazyme)作為熒光染料, PCR反應體系為: 2×SYBR qPCR Mix 10 μL, 正向引物和反向引物各0.5 μL (10 μmol L–1), cDNA模板1 μL, ddH2O補至20 μL。PCR反應程序: 94℃預變性1 min; 94℃變性15 s, 57℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 共40個循環(huán)。以作為內(nèi)參基因, 基因相對表達量采用2–DDCt方法計算。

1.7 主要農(nóng)藝性狀考察、稻米品質(zhì)檢測以及指紋圖譜分析

在水稻成熟期, 分別隨機選取野生型和轉(zhuǎn)基因材料T2代植株共5個單株, 對包括株高、穗長、分蘗數(shù)、穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、粒長、粒寬、長寬比、劍葉長和劍葉寬等主要農(nóng)藝性狀進行考察和分析, 分別3次生物學重復。此外, 收獲水稻成熟種子, 對包括膠稠度、堿消值、直鏈淀粉含量和蛋白質(zhì)含量等稻米蒸煮食味品質(zhì)以及包括堊白度、透明度、堊白粒率、糙米率、精米率和整精米率等稻米外觀品質(zhì)進行測定, 3次生物學重復。獲得的數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel進行統(tǒng)計和分析。此外, 利用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T 1433-2014)推薦的48對水稻SSR核心引物對野生型和轉(zhuǎn)基因株系進行指紋圖譜和遺傳差異分析。PCR反應體系(10 μL): 2×PCR MasterMix 5 μL (Vazyme), 正向引物和反向引物等體積混合溶液1.0 μL (10 μmol L–1), DNA模板0.8 μL (50 ng μL–1), ddH2O 3.2 μL。PCR反應程序為: 94℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 min, 共35個循環(huán); 72℃延伸7 min, 4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離和純化, 電壓120 v, 時間90 min, 利用核酸染料Ultra GelRed (Vazyme)染色20 min后在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)中照相觀察。

1.8 明太A-badh2的選育及配組分析

以獲得的具有濃郁香味且性狀穩(wěn)定的基因編輯株系為父本, 與野生型三系不育系明太A進行測交和回交轉(zhuǎn)育, 期間利用Seq-F/R引物對回交后代單株靶點進行PCR擴增和測序分析, 篩選位點為純合突變香味基因型且表型和基因編輯株系一致的單株進行回交, 獲得不育性穩(wěn)定且具有香味基因型的株系明太A-。為鑒定其配合力, 利用已通過農(nóng)業(yè)部國家農(nóng)作物品種審定委員會審定的雜交稻品種明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009的恢復系明恢703和明恢3009與其進行試制測配。所配制的雜交組合種植于三明市農(nóng)業(yè)科學研究院沙縣瑯口轉(zhuǎn)基因試驗基地, 3個小區(qū)重復, 小區(qū)面積13.33 m2,株行距20 cm×20 cm, 單本栽插, 常規(guī)田間管理。于成熟期從小區(qū)中間選擇5個單株對包括播始歷期、株高、穗長、有效穗、穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀進行考察, 同時進行小區(qū)測產(chǎn)分析。同樣田間栽培和管理條件下種植明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009及區(qū)試對照品種天優(yōu)華占, 并采取同樣的方法對其主要農(nóng)藝性狀進行考察和小區(qū)測產(chǎn)分析, 獲得的數(shù)據(jù)通過Excel進行統(tǒng)計和分析。此外, 為鑒定明太A-在雜交稻組合香味性狀上的表現(xiàn), 本研究利用三明市農(nóng)業(yè)科學研究院自主選育的優(yōu)質(zhì)香型恢復系明恢1831分別與野生型明太A以及基因編輯后的明太A-進行少量手工試制測配, 獲得雜交稻組合明太A/明恢1831和明太A-/明恢1831。同時, 采用目前在水稻育種中被廣泛應用的優(yōu)質(zhì)香稻品種泰國小香占作為香味對照品種。相應材料種植于三明市農(nóng)業(yè)科學研究院沙縣瑯口轉(zhuǎn)基因試驗基地, 常規(guī)田間管理, 待植株完全成熟后, 分別單獨收獲其種子并利用GC-MS檢測籽粒中香味物質(zhì)2-AP含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR-Cas9表達載體的構(gòu)建

利用前人研究和設(shè)計開發(fā)的位點特異性引物(Badh2P1-P10)[6]對明太B香味基因全長序列進行克隆和測序分析。結(jié)果表明, 該基因具有完整的CDS編碼序列, 屬于典型的非香型秈稻品種。此外, 該品種具有株型好、米質(zhì)優(yōu)和配合力強等特點。因此, 本研究以明太B作為轉(zhuǎn)基因受體, 借助CRISPR-Cas9基因定點編輯技術(shù)開展轉(zhuǎn)基因試驗。參照粳稻品種日本晴基因組序列, 獲得水稻香味基因全長DNA序列(登錄號:), 利用https://crispr.cos.uni-heidelberg. de/index.htmlh和BLAST在線分析和序列比對工具, 分別在基因第1和第2外顯子區(qū)域設(shè)計一條長度為20 bp且特異性較好的靶點序列Target 1 (TGGCCACGGCGATCCCGCAG)和Target 2 (AGGCGAGATCCCGGCGGGCA) (表1)。通過制備二聚體后將其構(gòu)建至CRISPR-Cas9表達載體(圖1-A), PCR擴增測序驗證后將含有sgRNA的Cas9表達載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105, 并開展轉(zhuǎn)基因試驗。

表1 本研究所使用的引物序列

2.2 Badh2基因編輯及靶點突變類型分析

以明太B愈傷組織為轉(zhuǎn)基因受體, 利用農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)基因法進行遺傳轉(zhuǎn)化, 共獲得15個獨立的T0代轉(zhuǎn)基因植株。分單株提取每個轉(zhuǎn)基因植株苗期葉片全基因組DNA, 并利用潮霉素抗性標記引物-F/R和核酸酶Cas9特異性引物identify-F/R對DNA進行PCR擴增檢測外源基因。分析發(fā)現(xiàn), 其中10個單株基因組已成功插入了含靶點序列的外源載體, 為轉(zhuǎn)基因陽性植株, 轉(zhuǎn)化陽性率達到66.67% (圖1-B, C)。通過設(shè)計特異性測序引物Seq-F/R對篩選出的10個陽性轉(zhuǎn)基因植株基因靶點位置相鄰序列進行PCR擴增和測序分析。結(jié)果顯示, 共8個獨立的T0代轉(zhuǎn)基因植株材料在PAM附近發(fā)生了編輯, 其中6個單株(L1、L2、L3、L8、L13和L15)為雜合突變, 分別在第1外顯子或第2外顯子處表現(xiàn)出6種不同方式的突變類型(圖1-D, E); 2個單株(L5和L7)為雙等位基因純合突變, 分別表現(xiàn)為在基因第2外顯子處距離起始密碼子ATG下游223 bp和221 bp位置發(fā)生1個堿基T的插入和7個堿基GGGCACG的缺失(圖1-E),導致基因發(fā)生移碼突變, 進而影響其相應蛋白BADH2的正常結(jié)構(gòu)和功能。為獲得無轉(zhuǎn)基因載體成分的基因編輯株系, 分別單獨收獲L5和L7 2個T0代轉(zhuǎn)基因植株種子, 繼續(xù)在轉(zhuǎn)基因試驗田種植其T1代分離材料, 每個株系分別種植24個單株。通過提取單株幼苗葉片基因組DNA, 進一步利用潮霉素抗性標記引物和核酸酶Cas9特異性引物以及基因測序引物對外源轉(zhuǎn)基因載體進行鑒定, 并同時對基因靶點位置DNA序列進行PCR擴增和測序分析。研究結(jié)果顯示, 其2個轉(zhuǎn)基因株系T1代分離單株在基因靶點位置突變特性與其T0代表現(xiàn)一致, 其純合突變可穩(wěn)定遺傳, 在后代中不再發(fā)生分離。但轉(zhuǎn)基因載體在其中一個基因編輯株系L5后代中發(fā)生了分離, 24個T1代植株中共檢測到5個單株不含有外源轉(zhuǎn)基因載體(圖1-F, G); 而在基因編輯株系L7分離的24個T1代植株中, 未檢測到不含外源轉(zhuǎn)基因載體的單株(圖1-H, I)。根據(jù)田間表現(xiàn), 從L5株系T1代中選擇一個長勢較好、結(jié)實率高且香味濃郁的單株L5-T1-15, 進行進一步加代繁殖并用于后續(xù)的功能研究和表型分析, 同時本研究將該株系命名為明太B-。

圖1 Badh2基因編輯及其突變類型分析

A: Cas9/gRNA載體圖; B:identify-F/R引物對T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測; C:-F/R引物對T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測; D, E: 基因編輯株系T0代單株靶點1和靶點2突變類型分析; F, H:identify-F/R引物對T1代基因編輯株系中基因PCR檢測; G, I:-F/R引物對T1代基因編輯株系中基因PCR檢測。圖A中的LB為載體左邊界, UBI為UBI啟動子,為基因, gRNA為引導RNA, rU6為水稻U6啟動子, 35S為35S啟動子, Hygro為潮霉素基因, RB為載體右邊界。圖B和圖C中“+”代表陽性對照, “-”代表陰性對照。圖D和圖E中藍色字體表示靶點序列, 紅色字體表示PAM序列, “-”表示堿基缺失, “+”表示堿基插入。圖B、C、F、G、H和I中的M代表2000 bp DNA marker。

A: the vector map of Cas9/gRNA; B: PCR identification of the positive transgenic plant in the gene-editing plants of T0generation withidentify-F/R; C: PCR identification of the positive transgenic plant in the gene-editing plants of T0generation with-F/R; D and E: mutation analysis of Target 1 (D) and Target 2 (E) in the gene-editing plants of T0generation; F and H: PCR detection ofgene in the gene-editing plants of T1generation withidentify-F/R; G and H: PCR detection ofgene in the gene-editing plants of T1generation with-F/R. LB, UBI,, gRNA, rU6, 35S, Hygro, and RB in Fig. A represent the vector left border, UBI promoter,gene, guide RNA, rice U6 promoter, 35S promoter, hygromycin, and vector right border, respectively. “+” and “–” in Fig. B–C represent positive control and negative control, respectively. The nucleotides with blue and red font in Fig. D–E represent Target and PAM sequence, respectively,“-” and “+” in Fig. D–E represent base deletions and base insertion, respectively. M in Fig. B–C, F–H, and I all represent 2000 bp DNA marker.

2.3 轉(zhuǎn)基因后代Badh2基因表達水平檢測

通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù), 獲得一個具有濃郁香味的轉(zhuǎn)基因水稻新材料明太B-, 該材料不含外源轉(zhuǎn)基因載體且在基因第2外顯子發(fā)生單個堿基插入純合突變。同時研究發(fā)現(xiàn), 明太B-與野生型明太B表現(xiàn)出相似的植株表型。為了進一步研究香味基因在轉(zhuǎn)基因后代中的功能以及在RNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達情況, 分別提取明太B和轉(zhuǎn)基因突變體材料明太B-T2代植株苗期葉片總RNA, 并通過半定量RT-PCR和熒光定量qRT-PCR技術(shù)對基因進行表達水平分析。研究結(jié)果顯示, 明太B-中基因的相對表達量明顯低于野生型明太B, 差異達到極顯著水平(<0.01) (圖2-A, B)。因此, 通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已成功對明太B中的香味基因進行了編輯, 且在轉(zhuǎn)基因材料中, 其基因第2外顯子單個核苷酸的插入, 直接導致了該基因發(fā)生移碼突變, 從而影響了其正常轉(zhuǎn)錄和RNA表達水平。

2.4 轉(zhuǎn)基因后代香味物質(zhì)2-AP含量測定

前期研究表明, 2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)是香稻的香味特征化合物和主要貢獻物。為了進一步分析基因突變和表達水平降低是否是導致明太B-產(chǎn)生濃郁香味的關(guān)鍵因素, 本研究收獲該突變體材料T2代植株成熟種子, 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對其籽粒中香味物質(zhì)2-AP的含量進行檢測和分析。檢測過程中2-AP和TMP在野生型明太B和突變體明太B-兩組材料GC-MS總離子色譜中能得到有效的分離(圖2-D, E), 研究結(jié)果顯示, 明太B籽粒中香味物質(zhì)2-AP的含量為0.052 mg kg–1, 而明太B-籽粒中2-AP的含量達到了0.586 mg kg–1(圖2-C)。因此, 相對于野生型對照品種明太B, 突變體材料明太B中香味物質(zhì)2-AP的含量極顯著提高(<0.01)。以上結(jié)果表明, 明太B-中基因的突變以及表達下調(diào), 是導致其香味物質(zhì)2-AP含量增加和積累以及濃郁香味產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。

2.5 主要農(nóng)藝性狀考察、稻米品質(zhì)檢測以及指紋圖譜分析

為了研究香味基因突變后是否對表型性狀及稻米品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響, 本研究對野生型明太B和突變體材料明太B-T2代植株主要農(nóng)藝性狀以及稻米蒸煮食味品質(zhì)和外觀品質(zhì)等各項指標進行考察和檢測。生物學統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn), 所有指標在2組材料間均無顯著差異(圖3和圖4)。此外, 利用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T 1433-2014)中推薦的48對水稻SSR核心引物對明太B和明太B-進行指紋圖譜和遺傳差異分析。結(jié)果顯示, 僅1對引物RM571在2組材料基因組DNA中檢測到等位變異, 其他引物在2組材料中擴增獲得的基因型條帶完全一致(圖5)。因此, 通過以上數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明, 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對明太B中的香味基因進行敲除后獲得的轉(zhuǎn)基因突變體材料明太B-與野生型具有較高的遺傳相似度, 且在外觀表型、稻米品質(zhì)等各項指標間均無顯著差異, 同時該材料不僅表現(xiàn)出濃郁的香味, 而且不含外源轉(zhuǎn)基因載體, 因此可直接應用于后期香型雜交水稻新品種的選育, 從而加快香稻育種進程。

圖2 明太B及明太B-badh2中Badh2基因RNA轉(zhuǎn)錄水平及香味物質(zhì)2-AP含量

A, B:基因在明太B和明太B-中的表達水平; C: 明太B和明太B-中2-AP含量; D, E: 明太B和明太B-總離子色譜圖及內(nèi)標2,4,6-三甲基吡啶。圖A中為水稻內(nèi)參基因。圖B和圖C中數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示(檢驗: *:< 0.05, **:< 0.01),= 3。圖中MTB表示明太B, MTB-表示明太B-。

A–B: the relative expression levels ofin MTB and MTB-analyzed by semi-quantitative RT-PCR (A) and qRT-PCR (B); C: 2-AP content in MTB and MTB-; D–E: the total ion chromatograms (TIC) of 2-AP and TMP (as the internal standard) in MTB and MTB-.in Fig. A was amplified as the control. Values in Fig. B–C are shown as means ± SDs of three biological replicates (Student’s-test: *:< 0.05, **:< 0.01). MTB and MTB-in all figures represent Mingtai B and Mingtai B-, respectively.

圖3 表型性狀在明太B和明太B-badh2中的表現(xiàn)

A～D: 野生型明太B和突變體明太B-成熟期植株、穗子和谷粒表型比較; E: 株高(cm); F: 結(jié)實率(%); G: 穗總粒數(shù); H: 千粒重(g); I: 分蘗數(shù); J: 穗長(cm); K: 劍葉長(cm); L: 劍葉寬(cm); M: 粒長(cm); N: 粒寬(cm); O: 長寬比。圖A中標尺表示10 cm; 圖B中標尺表示3 cm; 圖C和D中標尺表示0.5 cm。圖E～O中數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示(檢驗: *:< 0.05, **:< 0.01),= 5。MTB: 明太B; MTB-: 明太B-。

A–D: the phenotype comparison of plant, panicle, and grains between wild-type MTB and MTB-mutant at mature stage; E: plant height (cm); F: seed setting rate (%); G: the total grain number per panicle; H: 1000-grain weight (g); I: tiller number; J: panicle length (cm); K: flag leaf length (cm); L: flag leaf width (cm); M: grain length (cm); N: grain width (cm); O: length-width ratio. Bars: 10 cm in A, 3 cm in B, 0.5 cm in C and D. Values in Fig. E–O are shown as means ± SDs of five biological replicates (Student’s-test: *:0.05; **:0.01). MTB: Mingtai B; MTB-: Mingtai B-.

(圖4)

A: 膠稠度; B: 堿消值; C: 直鏈淀粉含量(%); D: 蛋白質(zhì)含量(%); E: 堊白度; F: 透明度; G: 堊白粒率(%); H: 糙米率(%); I: 精米率(%); J: 整精米率(%)。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示(檢驗: *:< 0.05, **:< 0.01),= 3。MTB: 明太B; MTB-: 明太B-。

A: gel consistency; B: alkali spreading value; C: amylose content (%); D: protein content (%); E: chalkiness degree; F: transparency degree; G: chalkiness rate (%); H: brown rice rate (%); I: white rice rate (%); J: head rice rate (%). Values are shown as means ± SDs of three biological replicates (Student’s-test: *:0.05, **:0.01). MTB: Mingtai B; MTB-: Mingtai B-.

圖5 野生型和突變體材料指紋圖譜分析

每對SSR引物4個樣品, 前2個為明太B, 后2個為明太B-; M: 100 bp DNA ladder marker。

Each pair of SSR primer had four samples, the first two were Mingtai B, and the last two were Mingtai B-. M: 100 bp DNA ladder marker.

2.6 明太A-badh2配組優(yōu)勢及香味分析

以篩選獲得的具有濃郁香味的基因編輯株系明太B-為父本, 與野生型不育系明太A進行測交和回交轉(zhuǎn)育并結(jié)合位點測序分析, 選育獲得純合香型三系不育系明太A-(圖6-A)。為了鑒定明太A-的配合力以及在組合產(chǎn)量上的優(yōu)勢, 選用已通過農(nóng)業(yè)部國家農(nóng)作物品種審定的雜交稻品種明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009的恢復系明恢703和明恢3009作父本, 利用明太A-作母本進行試制測配, 并對所配制的雜交稻組合明太A-/明恢703、明太A-/明恢3009的主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量超標優(yōu)勢進行考察和分析。結(jié)果表明, 與審定品種明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009相比, 雜交稻組合明太A-/明恢703和明太A-/明恢3009在主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量方面沒有顯著差異; 與區(qū)試對照品種天優(yōu)華占相比, 明太A-/明恢703、明太A-/明恢3009主要農(nóng)藝性狀, 包括穗長、穗粒數(shù)、千粒重和結(jié)實率均顯著高于對照品種, 其中穗長、穗粒數(shù)、千粒重達極顯著水平(<0.01); 同時, 在產(chǎn)量方面, 2個雜交稻組合相對對照品種天優(yōu)華占的增產(chǎn)幅度分別達到6.6%和6.0% (表2)。這些結(jié)果表明雜交稻組合明太A-/明恢703和明太A-/明恢3009具有較強的產(chǎn)量超標優(yōu)勢, 香味基因編輯后的明太A-依然保持較高的配合力。此外, 為了鑒定香味基因編輯后的明太A-在雜交稻組合香味性狀上的表現(xiàn), 利用自主選育的優(yōu)質(zhì)香型恢復系明恢1831分別與明太A以及明太A-進行少量試制測配, 獲得雜交稻組合明太A/明恢1831和明太A-/明恢1831 (圖6-B)。GC-MS檢測分析結(jié)果顯示, 雜交稻組合明太A-/明恢1831籽粒中香味物質(zhì)2-AP的含量達到0.212 mg kg–1, 極顯著高于對照組合明太A/明恢1831 (0.08 mg kg–1), 且與香味對照品種泰國小香占(0.206 mg kg–1)相近(圖6-C)。

3 討論

香味是影響稻米食味品質(zhì)的一項極其重要的指標, 是水稻品質(zhì)改良的一個重要目標性狀[24]。全球香稻種質(zhì)資源豐富, 栽培歷史悠久且種植分布范圍廣泛, 國內(nèi)外頗有名氣的香稻品種有印度的Basmati系列、泰國的KDML105、日本的宮香、美國的Jasmine 85和Della以及我國東北的稻花香、云南的螃蟹谷、廣西的靖西香糯和貴州的香禾等, 但這些傳統(tǒng)的地方品種不僅具有獨特的地理區(qū)域局限性, 而且存在產(chǎn)量低、抗病能力差、易倒伏等諸多缺點, 從而限制了其在實際生產(chǎn)和推廣上的應用[5,21-22]。目前, 香稻育種主要還是通過香型與非香型水稻品種間雜交、回交等常規(guī)育種技術(shù)將香味導入現(xiàn)有的優(yōu)良品種。然而,由于水稻香味性狀受隱性基因控制, 在雜交后代群體進行單株選擇時容易造成雜合狀態(tài)下香味基因的丟失以及在水稻籽粒灌漿成熟前很難對目標性狀進行鑒定, 同時香味基因可能與產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性基因存在連鎖累贅, 導致常規(guī)育種在材料選擇和鑒定過程中的復雜性和繁瑣性。因此, 利用傳統(tǒng)育種技術(shù)來改良稻米香味以及選育優(yōu)質(zhì)香稻新品種不僅費時費力, 且易受到各種不確定因素的影響[21-22,25]。

圖6 明太A-badh2配制雜交組合明太A-badh2/明恢1831香味物質(zhì)2-AP含量

A: 明太A和明太A-植株表型; B: 明太A/明恢1831和明太A-/明恢1831植株表型; C: 明太A/明恢1831, 明太A-/明恢1831和泰國小香占香味物質(zhì)2-AP含量。圖A和B中標尺表示20 cm。圖C中數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示,= 3, 不同字母表示在0.01水平上差異極顯著。MTA: 明太A, MTA-: 明太A-, MTA/MH1831: 明太A/明恢1831, MTA-/MH1831: 明太A-/明恢1831, TGXXZ: 泰國小香占。

A: plant morphology of MTA and MTA-; B: plant morphology of MTA/MH1831 and MTA-/MH1831; C: 2-AP content in MTA/MH1831, MTA-/MH1831, and TGXXZ. Bars: 20 cm in A and B. Values in Fig. C are shown as means ± SDs of three biological replicates. Different letters indicate significantly different at the 0.01 probability level. MTA: Mingtai A, MTA-: Mingtai A-, MTA/MH1831: Mingtai A/Minghui 1831, MTA-/MH1831: Mingtai A-/Minghui 1831, TGXXZ: Taiguoxiaoxiangzhan.

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展, 尤其是香味基因的分離克隆和功能研究以及相應功能標記的開發(fā), 分子標記輔助選擇技術(shù)、RNAi技術(shù)、基因組編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于香味基因的鑒定、篩選和香味性狀的改良以及優(yōu)質(zhì)香型雜交稻新品種的選育和創(chuàng)制, 從而大大加快了香稻育種進程[6,26-27]。CRISPR-Cas9技術(shù)是目前應用最為廣泛的基因組編輯技術(shù), 是繼RNAi技術(shù)、TALEN核酸酶技術(shù)和ZFN鋅指核酸酶技術(shù)之后發(fā)展最為迅速的一個可對基因組進行精準定向敲除和編輯的新技術(shù), 其具有設(shè)計構(gòu)建簡單、編輯效率高且易獲得純合突變體等優(yōu)點, 已成功應用于植物、動物和微生物基因改造等生物工程以及人類疾病診斷和治療等生物醫(yī)學領(lǐng)域[28-33]。前人研究表明, 水稻香味主要由8號染色體上編碼甜菜堿脫氫酶基因控制, 通過基因編輯等生物技術(shù)方法對基因進行定點突變, 可實現(xiàn)水稻香味性狀的改良, 從而創(chuàng)制香型水稻新種質(zhì)。但是, 無論是前期通過RNAi技術(shù)或TALEN技術(shù)還是目前利用CRISPR-Cas9等基因組編輯技術(shù)對香味進行改良從而獲得的轉(zhuǎn)基因香型水稻材料, 主要還是以粳型模式品種日本晴和中花11以及粳型常規(guī)稻品種嘉58、秀水134和龍粳11等為轉(zhuǎn)化受體, 其中日本晴和中花11本身農(nóng)藝性狀與目前大量推廣且在雜交水稻育種過程中廣泛應用的優(yōu)良品種相比存在一定的差距; 嘉58、秀水134和龍粳11雖具有優(yōu)良性狀或優(yōu)良品質(zhì), 但不含有恢復基因, 在進一步直接應用于三系雜交水稻新品種的選育和創(chuàng)制等方面受到一定程度的限制[16-18,21-22,34]。同時, 迄今為止很少有見報道利用基因編輯技術(shù)對秈稻品種香味性狀進行改良、創(chuàng)制秈型香稻新種質(zhì)的研究, 尤其是秈型優(yōu)質(zhì)三系不育系香稻材料的創(chuàng)制。

明太B是三明市農(nóng)業(yè)科學研究院自主選育的優(yōu)質(zhì)秈型三系雜交稻保持系親本材料, 其對應的三系不育系明太A具有株型好、米質(zhì)優(yōu)、配合力強和異交結(jié)實率高等優(yōu)點, 并于2020年6月通過福建省農(nóng)作物品種審定。前期研究已委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心對其米質(zhì)指標進行了檢測, 結(jié)果顯示: 其堊白度、透明度、膠稠度、直鏈淀粉含量及堿消值等指標均達部頒一級米品質(zhì)標準。其所配制的雜交稻組合在2020—2022年期間共有8個通過省級以上審定, 其中明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009和明太優(yōu)633已通過農(nóng)業(yè)部國家農(nóng)作物品種審定, 其米質(zhì)均達部頒3級以上優(yōu)質(zhì)米品質(zhì)標準。本研究以雜交稻保持系明太B為轉(zhuǎn)化受體, 利用CRISPR- Cas9基因編輯技術(shù), 在水稻基因第1外顯子和第2外顯子分別設(shè)計特異性靶點并對其進行編輯。通過對基因編輯材料T0代進行轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定以及靶點突變類型檢測和測序分析, 共獲得8個在PAM位點附近發(fā)生編輯的單株, 且不同靶點發(fā)生的突變類型各不相同。在第1外顯子共有3個單株發(fā)生突變, 突變類型主要表現(xiàn)為單堿基插入以及不同數(shù)量的堿基缺失, 且均為雜合突變。在第2外顯子共有5個單株發(fā)生突變, 突變類型同樣表現(xiàn)為單堿基插入和不同數(shù)量的堿基缺失, 其中3個單株為雜合突變, 2個單株為純合突變。因此, 基因編輯在靶點的突變類型仍具有不可預測性。但不管是由于堿基缺失導致的缺失突變, 還是由于堿基插入導致的移碼突變, 均可在后代株系中穩(wěn)定遺傳并影響其目標性狀。本研究篩選2個在位點發(fā)生純合突變的T0代轉(zhuǎn)基因植株, 并對其衍生的48個T1代單株進行靶點測序分析以及轉(zhuǎn)基因成分檢測, 成功獲得了1個不含轉(zhuǎn)基因載體骨架且具有香味的純合突變體株系明太B-。該株系在基因第2外顯子發(fā)生一個堿基T的插入, 導致該基因發(fā)生移碼突變, 進而使基因在RNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達量顯著下調(diào), 最終導致其籽粒中香味物質(zhì)2-AP的含量顯著增加, 從而產(chǎn)生濃郁的香味。此外, 通過采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準 (NY/T 1433-2014) 推薦的48對水稻SSR核心引物進行指紋圖譜和遺傳差異分析時發(fā)現(xiàn), 僅1對引物Rm571在明太B和明太B-間鑒定到等位變異, 說明2組材料具有較高的遺傳相似度。前人研究報道CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)由于存在脫靶或在轉(zhuǎn)基因過程中受組織培養(yǎng)的影響, 從而容易導致基因編輯后的材料在產(chǎn)量和品質(zhì)性狀上的改變[35]。因此, 基因編輯株系在目標性狀得到改良的前提下, 其潛在的突變?nèi)孕枳鲞M一步的分析。本研究通過對野生型和突變體T2代植株11個表型性狀以及4項稻米蒸煮食味品質(zhì)和6項稻米外觀品質(zhì)指標進行考察和測定分析。結(jié)果表明, 所有指標在2組材料間均無顯著差異(>0.05)。Nawaz等[36]和孫慧宇等[37]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)分別對水稻抗稻瘟病基因和水稻香味基因進行敲除, 獲得多個不含轉(zhuǎn)基因成分的抗稻瘟病或香型純合突變體株系。在株高、穗長、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率、分蘗數(shù)和千粒重等主要農(nóng)藝性狀方面同樣與野生型無明顯差異。此外, 進一步利用明太B-與野生型不育系明太A進行測交和回交轉(zhuǎn)育并結(jié)合位點測序分析, 成功選育獲得了其對應的純合香型三系不育系明太A-。為了鑒定香味基因編輯后的明太A-的配合力以及在組合產(chǎn)量上的優(yōu)勢, 利用已通過國家審定的雜交稻品種明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009的恢復系明恢703、明恢3009與明太A-進行試制測配。結(jié)果表明, 明太A-依然具有較高的配合力, 所配制的雜交稻組合在產(chǎn)量上與明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009相近, 且同樣表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)量超標優(yōu)勢。此外, 由于水稻香味基因為隱性基因, 只有在純合狀態(tài)下才能表現(xiàn)出香味性狀。因此, 為了進一步鑒定明太A-在香型雜交稻組合配制過程中的實際利用價值以及在組合香味性狀上的表現(xiàn), 本研究利用該不育系與自主選育的優(yōu)質(zhì)香型恢復系明恢1831進行少量試制測配, 獲得香型雜交稻組合明太A-/明恢1831, 與對照組合明太A/明恢1831以及香味對照品種泰國小香占, 共同種植于三明市農(nóng)業(yè)科學研究院沙縣瑯口轉(zhuǎn)基因試驗基地, 常規(guī)田間管理。待植株完全成熟后分別收獲其F1代種子, 并利用GC-MS檢測其籽粒中香味物質(zhì)2-AP的含量。結(jié)果表明, 明太A-/明恢1831組合籽粒中2-AP含量極顯著高于對照組合明太A/明恢1831, 且與香味對照品種泰國小香占相近。因此本研究通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)并結(jié)合常規(guī)育種和分子育種技術(shù)選育獲得的純合香型三系不育系明太A-, 不僅實現(xiàn)了在香味性狀上的明顯改良, 同時還保留了野生型明太A的強配合力特性。這為今后雜交稻三系不育系的選育提供了新的育種思路, 同時為后期高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)香型雜交稻新品種的選育提供了新的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

利用CRISPR-Cas9技術(shù)對優(yōu)質(zhì)秈型強配合力三系雜交稻保持系親本材料明太B香味基因進行編輯和敲除, 獲得1個不含轉(zhuǎn)基因載體骨架, 且在第2外顯子插入單個堿基T的純合突變體株系明太B-。該株系基因RNA表達水平相對野生型顯著下調(diào), 稻米中香味物質(zhì)2-AP的含量顯著增加, 指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn), 該株系與野生型具有較高的遺傳相似度。此外, 其表型性狀、稻米蒸煮食味品質(zhì)和外觀品質(zhì)與野生型無顯著差異。進一步與明太A進行測交和回交轉(zhuǎn)育并結(jié)合位點測序分析, 獲得純合香型三系不育系明太A-。通過與恢復系明恢703、明恢3009測配, 其組合產(chǎn)量與國家審定品種明太優(yōu)703、明太優(yōu)3009相近, 且顯著高于區(qū)試對照品種, 表明香味基因編輯后的明太A-依然保持較高的配合力和雜種優(yōu)勢。此外, 通過與優(yōu)質(zhì)香型恢復系明恢1831測配, 其雜交組合籽粒中香味物質(zhì)2-AP的含量極顯著高于對照組合明太A/明恢1831, 且與香味對照品種泰國小香占相近。因此, 利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可實現(xiàn)對秈型水稻三系不育系香味性狀的定向改良。

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Development of high-quality fragrantCMS line by editinggene using CRISPR-Cas9 technology in rice (L.)

WEI Xin-Yu1,3,**, ZENG Yue-Hui1,3,**, YANG Wang-Xing2,3, XIAO Chang-Chun1,3, HOU Xin-Po2,3, HUANG Jian-Hong1,3, ZOU Wen-Guang2,3, and XU Xu-Ming2,3,*

1Biotechnology Research Institute, Sanming Academy of Agricultural Sciences, Sanming 365500, Fujian, China;2Rice Research Institute, Sanming Academy of Agricultural Sciences, Sanming 365500, Fujian, China;3Fujian Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Innovative Utilization for Mountain Area, Sanming 365500, Fujian, China

Fragrance is one of the important traits for quality improvement in rice, which is mainly controlled by thegene encoding a betaine aldehyde dehydrogenase on chromosome 8. The mutation ofgene can increase the content of 2-acetyl-1-pyrroline (2-AP) and promote the fragrance production in rice. In this study, thegene in Mingtai B (MTB), an elite maintainer line ofhybrid rice showing high eating quality bred by Sanming Academy of Agricultural Sciences, was edited and knocked out by using CRISPR-Cas9 technology. Two T0transgenic lines carrying homozygous mutation on the loci ofwere generated, and 48 T1individuals derived from these two plants were genotyped by PCR amplification and sequencing analysis. A mutant line named MTB-, which had a single T nucleotide insertion in the second exon ofwithout the vector skeleton, was finally obtained. In our study, the expression ofand the content of 2-AP were determined by semi-quantitative RT-PCR, qRT-PCR, and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), respectively. Simultaneously, the 48 pairs of SSR markers recommended by “Sector Standard of Agriculture (NY/T 1433-2014)” were used to further analyze the DNA fingerprint and genetic diversity of the MTB and the MTB-. The results showed that theRNA level was significantly decreased in the MTB-compared with the wild-type MTB. In addition, the 2-AP content was dramatically increased in MTB-. DNA fingerprint analysis revealed that only the Rm571 primer pair was specific for identifying allelic variation between wild type and MTB-, suggesting that the genetic diversity between wild type and MTB-was very low. Furthermore, agronomic phenotype, cooking and eating quality, appearance quality of wild type, and MTB-were investigated and analyzed. There was no significant difference between MTB and MTB-. The corresponding stable fragrant CMS line Mingtai A-(MTA-) carrying homozygous mutant on the locus ofwas successfully generated by the conventional test-crossing and back-crossing techniques combined withsequencing analysis. Derived from this CMS line, MTA-/Minghui 1831, MTA-/Minghui 703, and MTA-/Minghui 3009 hybrid combinations had been bred. Among them, the grain yield of MTA-/Minghui 703 and MTA-/Minghui 3009 were significantly increased compared with that of Mingtai you 703 and Mingtai you 3009, which were registered and released by the National Crop variety Appraisal Committee. Moreover, MTA-/Minghui 1831 dramatically increased 2-AP content in the grains compared with MTA/Minghui 1831. Therefore, the CRISPR-Cas9-mediated technology could be used to edit theand improve the fragrance in rice, and it provides the theoretical guidance for development of fragrantCMS line, leading to an accelerated breeding process of fragrant hybrid rice.

rice; CRISPR-Cas9; gene editing; fragrance;; 2-acetyl-1-pyrroline (2-AP)

2023-02-21;

2023-03-03.

10.3724/SP.J.1006.2023.22043

通信作者(Corresponding author):許旭明, E-mail: fj63xxm@sina.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

韋新宇, E-mail: wxy1209@163.com; 曾躍輝, E-mail: 1_zengyuehui_1@163.com

2022-07-11;

本研究由財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-01), 福建省自然科學基金項目(2021J01535, 2021J01536)和三明市科技計劃項目(2019-N-4)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-01), the Fujian Provincial Natural Science Foundation (2021J01535, 2021J01536), and the Sanming Municipal Science and Technology Project (2019-N-4).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230302.1455.003.html

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