鄧林 吳清蘭 宋軍瑩 高笑 肖歡歡 張麗 曹奕 侯琳

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系;2 藥學(xué)院;3 生物醫(yī)學(xué)實驗中心)

乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤,同時也是導(dǎo)致女性死亡的主要原因［1］。手術(shù)、化療和放療均為目前乳腺癌的主要治療方式,但乳腺癌的復(fù)發(fā)率以及轉(zhuǎn)移率依然很高［2］。因此,尋找乳腺癌發(fā)病的潛在機(jī)制和有效的治療靶點,是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵所在。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度超過200個核苷酸并且不能編碼蛋白質(zhì)的一種RNA［3］,其可通過多種途徑參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程的調(diào)控,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)lncRNASNHG1在結(jié)直腸癌組織內(nèi)表達(dá)上調(diào),與腫瘤轉(zhuǎn)移和分期相關(guān),下調(diào)SNHG1的表達(dá)在體外和體內(nèi)均可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長［6］;SNHG1在胃癌中發(fā)揮癌基因功能,可以影響胃癌細(xì)胞的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程［7］。微RNAs(miRNAs)是一種長度大約為22個核苷酸的非編碼RNA,lncRNA可調(diào)控miRNA表達(dá),與腫瘤發(fā)生相關(guān)［8-9］。研究顯示,miR-641可通過抑制乳腺癌細(xì)胞生長和侵襲來調(diào)節(jié)乳腺癌的進(jìn)程［10］。目前,乳腺癌中關(guān)于SNHG1功能和機(jī)制的研究依然很少。本研究通過RNA干擾技術(shù)及雙熒光素酶實驗,探討了SNHG1靶向調(diào)控miR-641的分子機(jī)制及對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SNHG1小干擾RNA(si-SNHG1)、miR-NC、miR-641 mimics、si-NC、anti-miR-641、anti-miR-NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(南京諾維贊生物有限公司),兔抗人上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司),雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞系MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。將MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231以及MDA-MB-468細(xì)胞分別置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清的DMEM/F12和DMEM中,在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

1.3 RT-qPCR檢測lncRNA SNHG1和miR-641表達(dá)

收集青島大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院20例病理確診為乳腺癌患者的癌組織和癌旁正常組織,置于標(biāo)本儲存液中,-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用Trizol試劑提取乳腺癌組織、癌旁正常組織及細(xì)胞(MCF-10A、MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468)中的總RNA。然后用微量核酸定量儀進(jìn)行RNA濃度檢測,并將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA,根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行RT-qPCR。對于miRNA,通過莖環(huán)法合成cDNA,以U6作為miRNA內(nèi)參照。SNHG1的內(nèi)參照為GAPDH。利用2-△△CT方法計算目的基因的相對豐度。繼而選擇SNHG1表達(dá)較正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A細(xì)胞基因差異最顯著(P值最小)的乳腺癌細(xì)胞BT-549進(jìn)行后續(xù)實驗。引物名稱及其序列詳見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.4 BT-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

處于對數(shù)生長期BT-549細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞匯合度約達(dá)60%時,分為A～D組,分別用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將si-NC(A組)、si-SNHG1(B組)、si-SNHG1與anti-miR-641-NC(C組)、si-SNHG1與anti-miR-641(D組)轉(zhuǎn)染BT-549細(xì)胞,6 h后換液。繼續(xù)培養(yǎng)36 h,RT-qPCR方法檢測A、B組細(xì)胞中SNHG1及miR-641表達(dá)水平,收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力

取A～D組培養(yǎng)36 h的BT-549細(xì)胞,以無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,于Transwell小室上室加入100 μL(約1×104個細(xì)胞)細(xì)胞懸液,下室加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)0.20的血清培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,停止實驗。去除小室中培養(yǎng)基,將遷移過膜的細(xì)胞用40 g/L的多聚甲醛固定20 min,PBS沖洗3次,再用1 g/L的結(jié)晶紫染色15 min。隨后用棉簽輕柔擦除未遷移過膜、殘留于上室的細(xì)胞,PBS沖洗3次,晾干,顯微鏡下觀察并計算遷移細(xì)胞數(shù)量。無血清DMEM培養(yǎng)基與基質(zhì)膠按8∶1比例混合,隨后將稀釋的基質(zhì)膠均勻加入到小室上室內(nèi),晾干。取A～D組培養(yǎng)36 h的BT-549細(xì)胞懸液加入到小室上室內(nèi),后續(xù)操作同細(xì)胞遷移步驟,最后顯微鏡下觀察并計算侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.6 Western blot方法檢測細(xì)胞中的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)量

取A～D組培養(yǎng)36 h的BT-549細(xì)胞,RIPA將細(xì)胞充分裂解后,收集裂解液,4 ℃下12 500 r/min離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入1/4體積的5×loading buffer,充分振蕩混勻,煮沸10 min,收集蛋白樣本。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用體積分?jǐn)?shù)0.05的脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h后,一抗4 ℃下孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10 min。再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下與膜孵育1 h,洗膜,暗室中曝光顯影。利用Image J軟件分析蛋白灰度值,并計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測SNHG1以及miR-641的靶向關(guān)系

通過Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),SNHG1與miR-641存在互補(bǔ)序列。然后合成含miR-641結(jié)合位點的SNHG1野生型(SNHG1-WT)序列以及相應(yīng)突變型(SNHG1-MUT)序列,并被克隆到pSI-check2質(zhì)粒中。處于對數(shù)生長期BT-549細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合度約達(dá)60%時,將SNHG1-WT與miR-641 mimics(E組)、SNHG1-WT與miR-NC(F組)以及SNHG1-MUT與miR-641 mimics(G組)、SNHG1-MUT與miR-NC(H組)通過LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染BT-549細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)基,PBS沖洗2次,加入裂解液室溫裂解10 min,4 ℃下離心,取上清液檢測熒光素酶活性,相對熒光素酶活性以螢火蟲與海腎熒光素酶活性比值表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG1、miR-641的表達(dá)情況

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,SNHG1和miR-641在癌旁正常組織中相對表達(dá)量分別為1.01±0.01、0.98±0.125,而在乳腺癌組織中的相對表達(dá)量分別為2.15±1.08、0.49±0.12。與癌旁正常組織相比,乳腺癌組織中的SNHG1表達(dá)明顯升高(t=4.81,P<0.05),而miR-641表達(dá)顯著降低(t=7.96,P<0.05)。

2.2 乳腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG1、miR-641的表達(dá)情況

MCF-10A及4種乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和BT-549)中SNHG1以及miR-641表達(dá)量比較差異均有顯著性(F=36.23、79.32,P<0.05),其中與MCF-10A相比,4種乳腺癌細(xì)胞中SNHG1的表達(dá)均上調(diào)(t=8.11～10.79,P<0.05),miR-641表達(dá)下調(diào)(t=9.16～11.17,P<0.05);SNHG1以及miR-641在4種乳腺癌細(xì)胞之間相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。選擇SNHG1表達(dá)較MCF-10A細(xì)胞基因差異最具有顯著性(P值最小)的乳腺癌細(xì)胞BT-549進(jìn)行后續(xù)實驗。

表2 SNHG1和miR-641在正常乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 下調(diào)lncRNA SNHG1的表達(dá)對于細(xì)胞中SNHG1、miR-641的影響

A組與B組中SNHG1相對表達(dá)水平分別為1.00±0.06和0.34±0.02,B組中SNHG1水平顯著降低(t=22.16,P<0.05)。A組與B組中miR-641相對表達(dá)水平分別為1.00±0.06、2.29±0.10,B組中miR-641的表達(dá)水平顯著升高(t=19.45,P<0.05)。

2.4 下調(diào)lncRNA SNHG1表達(dá)對BT-549細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示,與A組相比較,B組BT-549細(xì)胞遷移、侵襲過膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少(t=9.08、5.80,P<0.05)。Western blot方法檢測結(jié)果顯示,與A組相比較,B組BT-549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白N-cadherin以及Vimentin的表達(dá)均明顯下降(t=3.95、5.27,P<0.05),而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高(t=7.43,P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

2.5 下調(diào)miR-641可逆轉(zhuǎn)沉默SNHG1對BT-549細(xì)胞遷移、侵襲與EMT的影響

與C組相比,D組BT-549細(xì)胞遷移、侵襲過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增加(t=9.19、7.76,P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)明顯升高(t=9.86、13.83,P<0.05),而E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(t=3.59,P<0.05)。見表3。

2.6 雙熒光素酶活性分析

實驗結(jié)果表明,E組與F組的熒光素酶活性分別為0.47±0.06、1.00±0.08,E組熒光素酶活性顯著降低(t=8.37,P<0.05);G組與H組的熒光素酶活性分別為0.97±0.15、1.01±0.08,兩組熒光素酶活性比較無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

乳腺癌作為一種高異質(zhì)性疾病,復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率很高,整體治療效果不理想,所以尋找新的治療靶點以降低乳腺癌患者的病死率,仍是公眾關(guān)注的重點［11-12］。lncRNA的失調(diào)與多種惡性腫瘤(包括乳腺癌)的發(fā)生密切相關(guān)［13］。因此,lncRNA在腫瘤中的功能和調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點,以發(fā)現(xiàn)腫瘤診斷和治療的新靶點。

SNHG1由8個核仁內(nèi)小RNA組成,位于人類11號染色體上,具有11個外顯子。SNHG1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),在多種腫瘤組織中高表達(dá),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［14-15］。大量研究顯示,lncRNA在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲等生物學(xué)過程中起著重要的作用。例如lncRNAAC073352.1可以結(jié)合Y-框結(jié)合蛋白1(YBX1)促進(jìn)乳腺癌遷移、侵襲和血管生成［16］;SNHG1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),并通過激活A(yù)KT通路介導(dǎo)索拉非尼耐藥,并與患者預(yù)后不良有關(guān),對肝癌具有潛在診斷價值［17］。

本研究首先收集了20例乳腺癌組織和其癌旁的正常組織,檢測發(fā)現(xiàn)SNHG1在乳腺癌組織中明顯上調(diào)。隨后,利用RT-qPCR方法進(jìn)行進(jìn)一步驗證SNHG1在乳腺癌細(xì)胞水平的表達(dá)情況,相比較于人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,4種乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和BT-549)中SNHG1表達(dá)均上調(diào)。為了探索SNHG1在乳腺癌中的作用,選擇SNHG1表達(dá)量上調(diào)最為顯著且具有遷移能力的BT-549細(xì)胞作為研究對象。通過BT-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染SNHG1的小干擾RNA下調(diào)其表達(dá)量,隨后Transwell實驗檢測SNHG1表達(dá)對BT-549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示,下調(diào)SNHG1表達(dá)后,細(xì)胞遷移、侵襲過小室膜的數(shù)量顯著減少,提示SNHG1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲。為了探明SNHG1促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的具體分子機(jī)制,通過對Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)SNHG1與miR-641存在互補(bǔ)結(jié)合序列,同時RT-qPCR結(jié)果顯示在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞中SNHG1呈現(xiàn)高表達(dá),miR-641呈現(xiàn)低表達(dá),提示SNHG1可能通過靶向miR-641促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。RT-qPCR檢測結(jié)果也顯示,在BT-549細(xì)胞中下調(diào)SNHG1以后miR-641的表達(dá)升高。隨后,在BT-549細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染SNHG1的小干擾RNA以及anti-miR-641,發(fā)現(xiàn)敲低miR-641后可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)SNHG1對BT-549細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用,證實了SNHG1可通過miR-641促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

EMT是胚胎發(fā)育中極其重要的一個過程,能夠讓細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中在上皮和間質(zhì)狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換。EMT也是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的主要原因之一［18-19］。在EMT發(fā)生過程當(dāng)中,上皮標(biāo)志物例如E-cadherin表達(dá)降低,而間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高［20］。發(fā)現(xiàn)SNHG1在前列腺癌中通過與hnRNPL競爭性結(jié)合阻止E-cadherin翻譯,進(jìn)而促進(jìn)EMT過程［21］。本研究顯示,下調(diào)SNHG1可以提高BT-549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平,降低N-cadherin以及Vimentin蛋白表達(dá),抑制了EMT過程,而敲低miR-641可以逆轉(zhuǎn)由下調(diào)SNHG1表達(dá)對BT-549細(xì)胞EMT過程的抑制作用。多項研究表明,lncRNA可以作為miRNA的“海綿”,從而調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)功能［22］,lncRNAMCM3AP-AS1在肝癌中靶向負(fù)調(diào)控miR-194-5p,促進(jìn)FOXA1的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［23］。研究發(fā)現(xiàn),miR-641在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中低表達(dá),lncRNACOX10-AS1作為miR-641的“海綿”調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、遷移和侵襲過程［24］。還有研究表明miR-641可以調(diào)控乳腺癌進(jìn)程,下調(diào)miR-641可以靶向SRCAP抑制乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲和EMT過程,提示miR-641可能作為治療乳腺癌的潛在靶點［10］。本研究利用雙熒光素酶實驗進(jìn)一步驗證SNHG1能否靶向調(diào)控miR-641,結(jié)果顯示miR-641可以顯著抑制野生型SNHG1的熒光素酶活性,對突變型SNHG1的熒光素酶活性無影響,提示SNHG1可以靶向調(diào)控miR-641。

綜上所述,SNHG1在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),SNHG1可通過靶向調(diào)控miR-641促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移以及EMT過程。SNHG1/miR-641軸的研究為乳腺癌的靶向治療提供了新的可能。然而,本研究尚未探究miR-641下游的分子機(jī)制,且未進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證SNHG1/miR-641軸對乳腺癌的影響,后續(xù)將對此進(jìn)行深入的研究。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號QDU-HEC-2022259)。所有試驗過程均遵照《人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則》的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：鄧林、吳清蘭、宋軍瑩、高笑、肖歡歡、張麗、曹奕、侯琳參與了研究設(shè)計;鄧林、侯琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。