陳鑫磊 余永波 李鵬 牛海濤

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科,山東 青島 266003)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,近年其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢［1-2］。隨著近年來醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,腫瘤免疫治療已取得一定成效,為膀胱癌的治療提供了新思路。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是一種多功能生長抑制因子,其在腫瘤早期能夠促進(jìn)正常細(xì)胞的分化并且能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖,而在腫瘤晚期,TGF-β1則通過促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、刺激血管生成、誘導(dǎo)免疫抑制與腫瘤微環(huán)境形成等過程,發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用［3-4］。PD-L1是一種免疫檢查點(diǎn)關(guān)鍵蛋白,與T細(xì)胞上的程序性死亡配體1(PD-1)結(jié)合,導(dǎo)致腫瘤免疫抑制［5］。目前關(guān)于TGF-β1與膀胱癌相關(guān)性的研究并不多,本研究旨在探討TGF-β1對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移能力的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞系購買于中國科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞資源中心;TGF-β1、SB431542、MK2206、U0126購自美國MedChemExpress公司;Ecl顯影試劑購自美國Millipore公司;PD-L1、磷酸化的絲蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)蛋白、α肌動(dòng)蛋白(α-ACTIN)抗體購自美國CST公司;二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下,在RPMI1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、1×108U/L鏈霉素和100 g/L青霉素)中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)80%以上,使用胰蛋白酶進(jìn)行消化,使貼壁的T24細(xì)胞懸浮,加入胎牛血清終止胰蛋白酶消化,以1 000 r/min離心5 min后重懸,細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測TGF-β1對(duì)T24細(xì)胞的增殖能力的影響

取對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞均勻接種于96孔板(5 000個(gè)/孔)內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)8 h待T24細(xì)胞貼壁后;加入終濃度為0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每種濃度分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔;加入20 μL MTT溶液(5 g/L)4 h后,棄上清液;每孔加150 μL二甲基亞砜,搖床上低速振蕩10 min,以酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長490 nm處各孔吸光度值。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β1對(duì)T24細(xì)胞遷移能力的影響

取對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞均勻接種于12孔板(25 000個(gè)/孔)內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞密度大于90%后棄上清液,PBS清洗后,更換為無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),加入0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1培養(yǎng)24 h后,使用倒置顯微鏡4倍視野下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況。

1.5 Western blot方法檢測TGF-β1對(duì)于T24細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)影響

按照1.4方法以終濃度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞24 h,提取細(xì)胞中的總蛋白;將對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞分為A～C組,A組使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),B組培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1培養(yǎng),C組培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1以及SB431542培養(yǎng),均處理24 h后,提取細(xì)胞總蛋白。分別對(duì)以上蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠上電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,然后封閉0.5 h,使用PD-L1蛋白單克隆抗體進(jìn)行孵育過夜后,以α-ACTIN為內(nèi)參照,TBST洗膜3次,二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL顯影液顯影,拍照并保存,使用Image J軟件對(duì)成像進(jìn)行灰度值分析。

1.6 Western blot方法檢測TGF-β1對(duì)T24細(xì)胞中p-ERK、p-AKT、PD-L1蛋白表達(dá)的影響

按1.4方法以質(zhì)量濃度5 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞0、0.5、1、2、6、24 h后,提取細(xì)胞中總蛋白;將對(duì)數(shù)生長期的膀胱癌T24細(xì)胞分為D～G組,D組使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),E組培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1培養(yǎng),F組培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1、AKT抑制劑MK2206培養(yǎng),G組培養(yǎng)基中加入終濃度5 μg/L的TGF-β1、ERK抑制劑U0126處理T24細(xì)胞,均培養(yǎng)24 h以后提取總蛋白;分別對(duì)以上蛋白進(jìn)行Western blot方法檢測,以α-actin作為內(nèi)參照,檢測p-ERK、p-AKT以及PD-L1蛋白的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度TGF-β1對(duì)T24細(xì)胞增殖能力影響

以濃度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞的吸光度值分別為0.92±0.02、1.02±0.02、1.18±0.06、1.23±0.03、1.24±0.06、1.16±0.02。各濃度間T24細(xì)胞的增殖能力比較差異具有顯著性(F=48.30,P<0.05),其他濃度的TGF-β1處理T24細(xì)胞的增殖能力相較于0 μg/L時(shí)均顯著增強(qiáng)(t=3.59～12.18,P<0.05)。

2.2 不同濃度TGF-β1對(duì)T24細(xì)胞遷移能力影響

濃度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞的遷移率分別為0.19±0.01、0.18±0.01、0.20±0.01、0.21±0.01、0.24±0.01、0.19±0.01,各濃度間比較,T24細(xì)胞的遷移率沒有顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度的TGF-β1對(duì)T24細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 各處理組T24細(xì)胞中PD-L1表達(dá)情況比較

以濃度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞24 h后,T24細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)量分別為0.84±0.17、1.21±0.16、1.53±0.18、1.06±0.12、1.09±0.12、1.14±0.11。各濃度間比較,T24細(xì)胞的PD-L1表達(dá)量差異均具有顯著性(F=6.83,P<0.05),在TGF-β1濃度為5 μg/L時(shí)相較于其他濃度,差異具有顯著性(t=3.22～5.64,P<0.05)。濃度為5 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞0、0.5、1、2、6、24 h后,PD-L1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.41±0.04、0.51±0.01、0.57±0.01、0.68±0.02、0.76±0.02、1.09±0.02。不同處理時(shí)間比較,T24細(xì)胞PD-L1表達(dá)量均有顯著差異,且隨時(shí)間延長逐漸升高(F=199.20,P<0.05)。

A～C組T24細(xì)胞中PD-L1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.67±0.02、1.07±0.01、0.85±0.03,三組間比較差異具有顯著性(F=244.60,P<0.05),其中B組與A組比較,T24細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)量顯著升高(t=31.24,P<0.05),C組與B組比較,T24細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)量降低(t=17.04,P<0.05)。

D～G組T24細(xì)胞中PD-L1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.65±0.03、1.01±0.03、0.76±0.02、0.86±0.01,4組間比較差異具有顯著的意義(F=115.20,P<0.05),其中E組與D組比較,T24細(xì)胞PD-L1表達(dá)量顯著升高(t=25.37,P<0.05),F、G組與E組比較,細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)量均顯著降低(t=17.01、6.74,P<0.05)。

2.4 各處理組T24細(xì)胞中p-AKT、p-ERK的表達(dá)情況比較

以濃度為5 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞0、0.5、1、2、6、24 h后,細(xì)胞中p-AKT的相對(duì)表達(dá)量分別為0.34±0.02、1.18±0.02、0.94±0.01、0.84±0.03、0.37±0.02、0.14±0.02,p-ERK的相對(duì)表達(dá)量分別為0.34±0.02、1.11±0.02、0.96±0.02、0.86±0.01、0.66±0.02、0.64±0.06。各處理時(shí)間相比較,p-AKT及p-ERK表達(dá)量均具有顯著性差異(F=1 267.00、252.00,P<0.05),其中加入5 μg/L的TGF-β1 處理T24細(xì)胞0.5 h時(shí),相較于其他處理時(shí)間,p-AKT、p-ERK表達(dá)量均顯著升高(t=6.26～64.24,P<0.05)。

D～G組T24細(xì)胞中p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.02、0.94±0.02、0.99±0.01、0.07±0.01,p-ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.80±0.02、0.93±0.03、0.60±0.01、1.20±0.03,4組間比較,T24細(xì)胞中p-AKT、p-ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異均具有顯著性(F=2 577.00、338.40,P<0.05);E組與D組比較,T24細(xì)胞中p-AKT、p-ERK表達(dá)顯著升高(t=37.29、9.44,P<0.05);G組與E組比較,T24細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)顯著性降低(t=104.40,P<0.05);F組與E組相比較,T24細(xì)胞中p-ERK蛋白表達(dá)顯著降低(t=24.26,P<0.05)。

3 討 論

TGF-β作為一種免疫抑制因子,在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和抵抗治療中發(fā)揮了重要作用［6］。TGF-β是體內(nèi)許多細(xì)胞可以分泌的具有多種功能的多肽,其可以影響細(xì)胞的生長、分化、黏附、遷移和凋亡等［7］。TGF-β在腫瘤的形成與發(fā)展中發(fā)揮兩種不同的調(diào)節(jié)作用,在腫瘤形成階段,TGF-β維持免疫自耐受性,并通過調(diào)節(jié)上皮增殖、凋亡和分化來抑制腫瘤進(jìn)展［8-9］,而隨著腫瘤的不斷發(fā)展,TGF-β的激活和信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生異常,導(dǎo)致其刺激腫瘤微環(huán)境(TME)內(nèi)的血管生成、EMT、腫瘤成纖維細(xì)胞活化以及免疫抑制來促進(jìn)疾病進(jìn)展［10-12］。TME當(dāng)中TGF-β的高表達(dá)與臨床結(jié)局差以及腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性增高相關(guān)［13-14］,并且有研究表明在膀胱癌中,TGF-β1的高表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示,TGF-β可以促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞的增殖,但對(duì)T24細(xì)胞的遷移無顯著影響。

已有研究表明TGF-β1與PD-L1之間存在相關(guān)機(jī)制和功能聯(lián)系［16］。PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑可以特異性抑制PD-1和PD-L1的結(jié)合,激活T細(xì)胞活性發(fā)揮對(duì)腫瘤的殺傷作用［5］。在腫瘤患者中,腫瘤細(xì)胞的PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合以后,T細(xì)胞不能識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞,從而促使腫瘤逃避了機(jī)體的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸［17］,已有研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的TGF-β基因會(huì)引起嚴(yán)重的自身免疫性疾?。?8］。PD-1對(duì)機(jī)體調(diào)節(jié)具有雙重作用,一方面其可以避免無效或者有害的免疫應(yīng)答,并與免疫耐受有關(guān),另一方面,它可以通過阻礙保護(hù)性免疫導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的快速增長［19］。PD-L1是PD-1的配體,通常在炎癥時(shí)由部分免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá),但其在腫瘤中表達(dá)則是腫瘤細(xì)胞的“自適應(yīng)免疫制劑”,發(fā)揮抗腫瘤作用［20］。

本研究通過使用1、5、10、20、40 μg/L濃度的TGF-β1處理膀胱癌T24細(xì)胞,結(jié)果示各個(gè)濃度的TGF-β1均提高了細(xì)胞中PD-L1蛋白的表達(dá)水平。隨后,在5 μg/L濃度的TGF-β1處理0、0.5、1、2、6、24 h時(shí),觀察到PD-L1隨時(shí)間延長表達(dá)水平顯著升高。為進(jìn)一步研究PD-L1的表達(dá)水平與TGF-β1的關(guān)系,同時(shí)又使用了TGF-β1與TGF-β1抑制劑SB4311542進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)比單獨(dú)使用TGF-β1處理,其促進(jìn)PD-L1表達(dá)的效果受到抑制,說明TGF-β1能夠促進(jìn)T24細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)。為了研究TGF-β1促進(jìn)T24細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)是否與p-ERK、p-AKT有關(guān),本研究使用濃度5 μg/L的TGF-β1處理T24細(xì)胞,檢測T24細(xì)胞中p-ERK、p-AKT蛋白的水平,發(fā)現(xiàn)在0.5 h時(shí)p-ERK、p-AKT蛋白表達(dá)已經(jīng)顯著升高;為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)觀點(diǎn),本研究又分別使用AKT抑制劑MK2206和ERK抑制劑U0126對(duì)T24細(xì)胞進(jìn)行處理以后,發(fā)現(xiàn)抑制p-ERK、p-AKT表達(dá)后,TGF-β1促進(jìn)T24細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平的能力受到抑制,可見TGF-β1可能是通過ERK、AKT通路提高T24細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。在對(duì)乳腺癌和肝癌研究中發(fā)現(xiàn),PD-L1與TGF-β1表達(dá)顯著正相關(guān),阻斷TGF-β后,PD-L1表達(dá)水平顯著降低［21-22］。由此可以認(rèn)為TGF-β1是通過促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞中PD-L1表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和發(fā)展,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,TGF-β1可以促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞的增殖,不影響其遷移,TGF-β1可能是通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)PD-L1、p-ERK和p-AKT的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。

作者聲明：陳鑫磊、余永波、李鵬、牛海濤參與了研究設(shè)計(jì);陳鑫磊、牛海濤參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。