宗麗娟 杜占慧 游福蓉 王勤拯 張成 邢泉生

(青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院,山東 青島 266034 1 心臟中心;2 普外科)

隨著我國人民生活水平的提高以及人口老齡化程度的日益加劇,退行性鈣化性主動脈瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)在心臟瓣膜疾病中所占比例逐年上升,已成為臨床主動脈瓣置換的最主要病因［1-2］。CAVD以瓣膜發(fā)生纖維化和鈣化為特征,導(dǎo)致瓣葉增厚及啟閉功能受限,最終造成以心臟左室流出道梗阻為特征的心臟功能損害［3-4］。目前CAVD的治療方法包括藥物治療和經(jīng)外科手術(shù)或經(jīng)皮介入的主動脈瓣膜置換術(shù)［5］。其中藥物治療僅可緩解癥狀,無法控制疾病進展;而瓣膜置換術(shù)治療成本較高,術(shù)后人工瓣膜帶來的抗凝風(fēng)險、瓣膜衰敗等問題仍困擾臨床［6］。因此研究CAVD的發(fā)生機制,確定導(dǎo)致CAVD進展的分子調(diào)控途徑,尋找潛在治療靶點,將為CAVD的治療提供新策略。

近年研究表明,CAVD是一種多細胞、多信號通路參與主動調(diào)控的疾病［7］,其中作為主動脈瓣膜主體細胞的主動脈瓣膜間質(zhì)細胞(AVICs),其炎性反應(yīng)、成骨樣轉(zhuǎn)化、細胞死亡以及鈣鹽沉積等過程在CAVD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8-12］。細胞焦亡是一種由焦亡蛋白Gasdermin家族介導(dǎo)的程序性細胞死亡方式,是機體的一種固有免疫反應(yīng),它既可以引起細胞的程序性死亡,同時又可導(dǎo)致周圍組織的炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)已證實,細胞焦亡參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展［13-16］,并與老年退行性疾病如老年性耳聾、阿爾茨海默病等發(fā)病密切相關(guān)［17］,但與CAVD的發(fā)生是否相關(guān)至今尚未見報道。本研究通過體外培養(yǎng)AVICs并構(gòu)建其鈣化模型,旨在探討細胞焦亡在CAVD中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

杜爾貝克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司,波形蛋白(Vimentin)、α-肌動蛋白(α-SMA)、Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購自英國Abcam公司,血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子(CD31)抗體購自美國ABclonal公司,Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RunX2)、骨橋蛋白(OPN)、含Pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3(NLRP3)、焦亡素D蛋白(GSDMD)、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-18購買于美國Proteintech公司,GSDMD-N和Cleaved-Caspase-1抗體購自美國CST公司,Ⅱ型膠原酶、β-磷酸甘油鈉、地塞米松、抗壞血酸及茜素紅染料購買于北京索萊寶有限公司,Caspase-1抑制劑VX-765購自美國MCE公司,細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 AVICs的培養(yǎng)和鑒定

術(shù)中摘取主動脈瓣重度反流患者的主動脈瓣瓣葉后,立即放置于4 ℃的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中,轉(zhuǎn)運至實驗室。在無菌超凈臺中使用PBS清洗3次,無菌棉簽輕柔擦拭刮除瓣膜表面內(nèi)皮細胞,使用眼科剪將瓣葉剪成約1 mm×1 mm大小的組織塊,置于PBS溶液配制的2 g/L的Ⅱ型膠原酶溶液中于37 ℃下消化6～7 h。將上述溶液1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基［含體積分數(shù)0.12胎牛血清及100 kU/L青霉素/鏈霉素(1∶1)的DMEM培養(yǎng)基］,在37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合度約達90%時進行傳代。用細胞免疫熒光法檢測細胞的間質(zhì)細胞標(biāo)志蛋白Vimentin、α-SMA及內(nèi)皮細胞標(biāo)志蛋白CD31以鑒定AVICs,使用熒光顯微鏡采集圖像。經(jīng)過AVICs鑒定明確的第3～6代細胞可以用于后續(xù)的實驗。

1.3 VX-765溶液有效濃度的篩選

為篩選VX-765有效干預(yù)濃度,利用CCK-8實驗檢測VX-765對AVICs的細胞毒性。將處于對數(shù)生長期的AVICs接種于96孔板中,待細胞生長24 h且完全貼壁后,分別加入含有不同濃度(0、1、2.5、5、10、20、40、60、80 μmol/L)的VX-765標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基,每種濃度設(shè)置6個復(fù)孔。將孔板置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以后每孔加入CCK-8溶液10 μL,將孔板在培養(yǎng)箱中孵育2 h以后,使用酶標(biāo)儀測量各濃度組細胞在450 nm波長處的吸光度(A)值,計算細胞存活率。細胞存活率=［(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)］×100%,選擇干預(yù)藥物的最佳濃度用于后續(xù)實驗。

1.4 分組及處理

將傳代細胞按照每孔約1.2×106個接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后。依據(jù)處理方式不同將細胞分為3組,對照組以標(biāo)準(zhǔn)DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d,鈣化組以鈣化培養(yǎng)基(含10 mmol/L β-磷酸甘油鈉+100 nmol/L地塞米松+50 mg/L抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)14 d,而抑制劑組則使用含10 μmol/L VX-765的DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理24 h后轉(zhuǎn)入鈣化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d。

1.5 AVICs中鈣結(jié)節(jié)表達水平檢測

將各組細胞棄培養(yǎng)基,用40 g/L多聚甲醛溶液固定,經(jīng)去離子水清洗以后加入茜素紅染液,染色5 min后棄去染液,去離子水洗滌終止反應(yīng),普通光學(xué)顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況。

1.6 AVICs中鈣化、焦亡相關(guān)蛋白及炎癥因子表達水平檢測

將培養(yǎng)好的細胞接種于6孔板,待AVICs細胞融合度約達50%時,按1.4步驟處理細胞14 d,收集AVICs細胞并提取細胞中總蛋白,加入5×loading buffer,并置于水中煮沸15 min進行變性,保存于-80 ℃環(huán)境下。按照SDS-PAGE凝膠配置說明書配制分離膠和濃縮膠,加15 μg蛋白樣品至凝膠孔中進行SDS-PAGE蛋白電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜之后以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據(jù)目的蛋白分子量裁剪PVDF膜條帶,并分別加入鈣化相關(guān)蛋白OPN、RunX2,細胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、Cleaved-Caspase-1,炎癥因子IL-1β、IL-18以及內(nèi)參β-actin單克隆抗體,4 ℃孵育過夜。以β-actin作為內(nèi)參照,TBST洗3次,每次10 min,加入二抗并室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并拍照。使用Image J 7.0軟件分析上述蛋白條帶灰度值,目標(biāo)蛋白相對表達量以目標(biāo)蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值計算。實驗設(shè)置6個復(fù)孔,重復(fù)測量3次,結(jié)果取均值。

2 結(jié) 果

2.1 AVICs細胞表型鑒定

免疫熒光染色鑒定AVICs細胞表型,結(jié)果顯示近乎所有細胞均可見間質(zhì)細胞標(biāo)志蛋白Vimentin及α-SMA表達,未見內(nèi)皮細胞標(biāo)志蛋白CD31表達(圖1),說明分離培養(yǎng)的AVICs純度理想,無明顯內(nèi)皮細胞污染,可以用于后續(xù)實驗。

2.2 AVICs體外鈣化模型的建立

茜素紅染色結(jié)果顯示,鈣化組細胞呈現(xiàn)橙色著色,對照組細胞無明顯陽性著色(圖2)。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示,鈣化組與對照組當(dāng)中鈣化相關(guān)蛋白OPN的相對表達量分別為1.28±0.16、0.32±0.03,RunX2的相對表達量則分別為2.27±0.15、0.39±0.02,鈣化組中鈣化相關(guān)蛋白OPN及RunX2的相對表達量均顯著高于對照組(t=6.568、12.204,P<0.01)。見圖3。

箭頭所指區(qū)域為鈣化結(jié)節(jié)

圖3 對照組和鈣化組AVICs中鈣化相關(guān)蛋白表達水平

2.3 對照組和鈣化組中AVICs焦亡相關(guān)蛋白表達水平比較

免疫印跡法檢測結(jié)果顯示,鈣化組焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N以及Cleaved-Caspase-1相對表達量顯著高于對照組(t=4.586～15.842,P<0.01)。見圖4、表1。

表1 對照組和鈣化組AVICs焦亡相關(guān)蛋白的表達水平比較

圖4 對照組和鈣化組AVICs焦亡相關(guān)蛋白表達水平

2.4 VX-765干預(yù)AVICs最佳濃度確定

CCK-8法檢測結(jié)果顯示,在VX-765濃度為0、1、2.5、5、10、20、40、60、80 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中,AVICs的存活率分別為(92.407±3.431)%、(95.725±1.203)%、(99.642±1.877)%、(100.750±6.751)%、(101.975±7.023)%、(87.975±1.141)%、(88.742±1.553)%、(83.650±1.648)%、(72.817±5.514)%,與濃度為10 μmol/L相比,當(dāng)VX-765濃度為20、40、60、80 μmol/L時AVICs的存活率均顯著降低(t=2.200～5.631,P<0.05),因此后續(xù)實驗中抑制劑組均采用含10 μmol/L VX-765的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基預(yù)處理AVICs 24 h后,再進行后續(xù)鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.5 鈣化組與抑制劑組中AVICs鈣化、焦亡相關(guān)蛋白及炎性因子表達水平比較

茜素紅染色結(jié)果顯示,與鈣化組相比,抑制劑組橙紅色顆粒減少,鈣化結(jié)節(jié)消退(圖5)。免疫印跡法結(jié)果顯示,抑制劑組OPN、RunX2、NLRP3、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、Cleaved-Caspase-1以及IL-1β、IL-18的相對表達量均顯著性低于鈣化組(t=5.799～19.236,P<0.01)。見圖6、表2。

表2 鈣化組與抑制劑組AVICs鈣化、焦亡相關(guān)蛋白及炎性因子表達水平比較

箭頭所指區(qū)域為鈣化結(jié)節(jié)

圖6 鈣化組與抑制劑組AVICs鈣化、焦亡相關(guān)蛋白及炎癥因子表達水平

3 討 論

近年來,CAVD的發(fā)病率在老年人群中呈增長趨勢,隨著瓣膜病變程度加重,該病逐漸破壞老年患者血流動力學(xué)穩(wěn)定性,發(fā)展至后期極易危及患者生命。雖然已經(jīng)有大量關(guān)于CAVD的病因?qū)W及病理生理學(xué)方面的研究,但是CAVD的主要發(fā)病機制依然不明確。CAVD涉及到主動脈瓣瓣葉進行性增厚、基質(zhì)重塑以及鈣鹽沉積等過程,上述過程導(dǎo)致瓣葉嚴重鈣化、結(jié)構(gòu)和功能減退,最終發(fā)生主動脈瓣嚴重狹窄和(或)關(guān)閉不全［18］。AVICs是主動脈瓣的主要組成成分之一,且AVICs向成骨樣細胞分化的過程在CAVD疾病發(fā)展中起主要作用,這也是目前探討CAVD發(fā)生機制的主要研究方向。多項研究表明,CAVD中主動脈瓣鈣化早期病變與血管鈣化相似,是一個異位鈣化的過程,其中成骨細胞激活與間質(zhì)細胞死亡同時存在。細胞焦亡屬于細胞程序性壞死的一種,在動脈粥樣硬化、血管鈣化等多種心血管疾病進程中發(fā)揮重要作用［19］,但CAVD中是否存在細胞焦亡及其相關(guān)機制目前尚未有研究報道。

本研究使用鈣化培養(yǎng)基,建立AVICs體外鈣化模型并進行驗證。結(jié)果顯示經(jīng)過鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的AVICs呈聚集樣生長,茜素紅染色呈現(xiàn)橙色著色,證明AVICs中存在鈣鹽沉積。免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn),鈣化相關(guān)蛋白OPN和RunX2表達增多,提示AVICs向成骨樣細胞分化。在此模型上,本研究進行了細胞焦亡的相關(guān)檢測。細胞焦亡是由GSDMD介導(dǎo)的一種新型程序性炎癥性細胞死亡模式,其特征是細胞腫脹變大,膜上孔洞形成及炎癥因子等細胞內(nèi)容物的釋放。根據(jù)活化蛋白不同,細胞焦亡分為依賴Caspase-1的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4/5/11的非經(jīng)典途徑,目前經(jīng)典激活途徑研究較多［20］。在經(jīng)典途徑細胞焦亡中,Caspase-1作為焦亡的效應(yīng)分子,通常以pro-Caspase-1的形式存在于細胞中,在各種損傷因素的刺激下,NLRP3等炎癥小體被激活,并將pro-Caspase-1裂解成Caspase-1,活化的Caspase-1隨后將GSDMD裂解為GSDMD-N,釋放出的GSDMD-N在細胞膜上形成孔洞,進而促進炎性因子的釋放和細胞腫脹,激活細胞焦亡［21］。細胞焦亡在機體內(nèi)是一個動態(tài)過程,往往難以觀測,目前活化的Caspase-1和GSDMD-N已被公認為細胞焦亡發(fā)生的標(biāo)志物,通過檢測這些指標(biāo)的水平可以確定細胞焦亡的發(fā)生情況。本研究中AVICs經(jīng)鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)以后,焦亡相關(guān)蛋白NLPR3、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、Cleaved-Caspase-1等表達升高,表明AVICs向成骨樣細胞改變的過程中存在細胞焦亡發(fā)生。

為進一步明確細胞焦亡在AVICs成骨樣改變中的作用,本研究使用VX-765抑制焦亡效應(yīng)分子Caspase-1的活性。VX-765是一種具有口服生物活性的Caspase-1抑制劑,現(xiàn)已被應(yīng)用于銀屑病和癲癇患者的Ⅱ期臨床試驗。本研究使用VX-765干預(yù)鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的AVICs,通過CCK-8法確定VX-765的干預(yù)時間及濃度。實驗結(jié)果顯示,VX-765干預(yù)減少了細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的形成,且VX-765抑制劑組中的鈣化相關(guān)蛋白OPN、RunX2,焦亡相關(guān)蛋白NLPR3、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、Cleaved-Caspase-1及炎癥因子IL-18、IL-1β的相對表達量均顯著降低,上述結(jié)果提示VX-765能夠減少細胞焦亡的發(fā)生,抑制AVICs向成骨樣細胞分化。

細胞焦亡在本質(zhì)上是一種炎癥過程,而炎癥在CAVD進展過程中發(fā)揮重要作用［22］。多項研究表明,慢性炎癥反應(yīng)貫穿瓣膜鈣化的全過程,炎癥信號通路的激活、炎性因子的表達和釋放在AVICs向成骨樣細胞分化中扮演重要角色［18,23］。在細胞焦亡中,NLPR3/Caspase-1通路的激活是焦亡的關(guān)鍵過程。已有研究表明,炎小體在多種衰老相關(guān)的疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可以作為心血管疾病治療的重要靶點［24］。有研究發(fā)現(xiàn),咖啡酸苯乙酯可以通過抑制Akt/NF-κB通路和NLPR3炎癥小體的激活來減少條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下AVICs鈣化結(jié)節(jié)的形成［25］。根據(jù)本研究結(jié)果,我們推測VX-765可能通過靶向抑制Caspase-1來減少細胞焦亡的發(fā)生,從而減輕炎癥反應(yīng),延緩AVICs的成骨樣分化。

綜上所述,本研究結(jié)果表明在AVICs鈣化及成骨樣分化過程中存在細胞焦亡,應(yīng)用VX-765干預(yù)后可有效緩解鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)下AVICs鈣化結(jié)節(jié)的形成,其機制可能為VX-765干擾細胞焦亡中炎癥小體形成,減少AVICs成骨樣分化。因此,進一步研究細胞焦亡在CAVD中的作用機制將為臨床防治CAVD提供新的作用靶點和治療策略。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號QFELL-YJ-2020-80)。所有試驗過程均遵照《赫爾辛基人體研究倫理準(zhǔn)則宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：宗麗娟、邢泉生、杜占慧、游福蓉、王勤拯參與了研究設(shè)計;宗麗娟、杜占慧、邢泉生、張成參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。