朱姣姣 魏林珍 陳凡 丁瑤瑤 張倩倩 秦天生

[摘要]?由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白9（CRISPR?associated?nuclease，Cas9）介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)已被廣泛用于探究癌癥相關(guān)基因的功能、建立癌癥動物模型和探測物藥靶點(diǎn)，是一種高效、快速和位點(diǎn)特異性的工具。近年來，卵巢癌發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅女性健康。目前多采用手術(shù)、放療、化療或聯(lián)合治療等方法延緩疾病的進(jìn)展，但效果不佳，是臨床迫切需要解決的一大問題。因此，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向致病基因、篩選相關(guān)功能基因及尋找新的藥物靶點(diǎn)為卵巢癌的治療帶來了希望。本研究對既往CRISPR/Cas9技術(shù)在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述，希望對該領(lǐng)域未來的研究奠定理論基礎(chǔ)，也為腫瘤特別是卵巢癌的治療提供新的參考。

[關(guān)鍵詞]?CRISPR/Cas9；基因編輯；卵巢癌；轉(zhuǎn)移

[中圖分類號]?R737??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.11.027

CRISPR/Cas（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeat/CRISPR-associated）系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌抵抗外源入侵的防御系統(tǒng)。2012年有研究發(fā)現(xiàn)其能在體外切割雙鏈DNA[1]，從而開啟了基因編輯技術(shù)的新格局，成為當(dāng)前最熱門的基因編輯技術(shù)，并于2020年獲得諾貝爾化學(xué)獎[2]。與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)操作流程簡單，成本低、效率高。近年來被越來越多的用于基因定點(diǎn)編輯、基因組篩選、建立疾病動物模型和篩選藥靶點(diǎn)等，為疾病的診療提供了新的選擇。

卵巢癌是一種具有高度轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者在就診初期已發(fā)現(xiàn)腹腔播散等轉(zhuǎn)移情況，目前與卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因組學(xué)仍不清楚，患者的治療選擇有限，且耐藥機(jī)制在很大程度上導(dǎo)致治療現(xiàn)狀并不樂觀。隨著技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)為腫瘤的治療帶來了新的可能性。因此，本文對既往CRISPR/Cas9技術(shù)在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，便于有關(guān)卵巢癌轉(zhuǎn)移的后續(xù)研究。

1??CRISPR/Cas9概述及作用機(jī)制

原核生物為抵御噬菌體或病毒及外源質(zhì)粒DNA侵襲進(jìn)化出一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，稱為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats，CRISPR）。1987年，日本學(xué)者對一段大腸桿菌染色體進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了一段由重復(fù)片段和非重復(fù)片段間隔連接的保守短序列[3]。Jansen等[4]在2002年介紹了一組基因組的存在，被命名為CRISPR，且該系統(tǒng)由CRISPR和一系列相關(guān)蛋白Cas（CRISPR-associated?proteins，Cas）共同組成。2007年，有學(xué)者證明CRISPR系統(tǒng)是一種具有預(yù)防作用的免疫系統(tǒng)[5]，這是原核生物CRISPR系統(tǒng)具有適應(yīng)性的實驗證據(jù)。2008年，Shen等[6]發(fā)現(xiàn)，在CRISPR序列中，前間隔序列鄰近基序（protospacer?adjacent?motif，PAM）有著重要作用。2013年，有研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)實現(xiàn)了對哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源性基因組位點(diǎn)的精確編輯[7]。2016年，CRISPR/Cas9基因編輯工具首次應(yīng)用于臨床[8]。此后，許多基于CRISPR/Cas9的基因編輯方法出現(xiàn)，極大地提高了基因組編輯的精度，并擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。

目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)可Class1和Class2兩類，根據(jù)效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能又分不同的亞型，Class1包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型，Class2包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)成簡單，主要由內(nèi)切酶（Cas9）、CRISPR?RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）3部分組成，是目前應(yīng)用最廣的基因編輯方法。

作為原核生物的免疫防御系統(tǒng)，CRISPR主要通過3個步驟發(fā)揮作用。①當(dāng)噬菌體或病毒首次感染細(xì)菌時，將自身遺傳物質(zhì)導(dǎo)入菌體，菌體中的CRISPR系統(tǒng)將入侵病毒基因組DNA序列前間隔序列，整合到自身的CRISPR陣列，成為間隔序列鄰近基序（proto-spacer-adjacent?motifs，PAM）。②當(dāng)噬菌體或病毒再次感染細(xì)菌時，該外源片段被轉(zhuǎn)錄加工為成熟的crRNA并與Cas蛋白結(jié)合。③crRNA與外源病毒基因組DNA或RNA通過堿基互補(bǔ)配對引導(dǎo)Cas蛋白對其切割。斷裂的雙鏈啟動自身修復(fù)機(jī)制修復(fù)，如非同源末端連接（non-homologous?end?joining，NHEJ）和同源重組修復(fù)（homology?dependent?repair，HDR）機(jī)制，前者在沒有修復(fù)模板的情況下使用非同源DNA修復(fù)途徑，DNA末端被重新連接，通常導(dǎo)致引入小的插入或刪除而導(dǎo)致突變；HDR可機(jī)制利用同源模板與斷裂的雙鏈末端形成互補(bǔ)，使末端被連接，以實現(xiàn)基因敲除或精確基因的插入。

2??CRISPR/Cas9在癌癥中的應(yīng)用

近年來，隨著對基因編輯技術(shù)的深入研究，CRISPR/Cas9不斷地被用于敲除腫瘤致病基因、建立腫瘤基因編輯模型、打破機(jī)體免疫耐受、基因治療、聯(lián)合文庫篩選功能基因及耐藥靶點(diǎn)、表觀遺傳學(xué)等方面的研究。

2.1??敲除腫瘤致病基因

編輯癌基因、抑制特定蛋白表達(dá)，是研究腫瘤形成、發(fā)展和治療過程的關(guān)鍵策略。Olaizola等[9]研究擬泛素化修飾在膽管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的NAE1基因敲除，在體外和體內(nèi)模擬膽管癌中的NAE1抑制劑的效應(yīng)。Chou等[10]研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal?transducer?and?activator?of?transcription?1，STAT1）在結(jié)直腸癌腫瘤生長中的作用，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別在結(jié)直腸癌細(xì)胞系及異種移植小鼠模型中敲除STAT1，發(fā)現(xiàn)STAT1敲除可降低細(xì)胞的生長，證實STAT1在結(jié)直腸癌中的致癌作用。轉(zhuǎn)錄因子MondoA與癌細(xì)胞代謝應(yīng)激有關(guān)，利用CRISPR/Cas9和RNA干擾等技術(shù)，Sipol等[11]研究結(jié)果顯示，MondoA耗盡可在體外降低急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力，并在體內(nèi)小鼠模型中顯著抑制了惡性潛能。細(xì)胞甲酸結(jié)合蛋白Ⅱ（cellular?retinoic?acid?binding?protein?2，CRABP-Ⅱ），在所有胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic?ductal?adenocarcinoma，PDAC）中都過表達(dá)，采用CRISPR/Cas9基因編輯方法建立CRABP-Ⅱ基因敲除細(xì)胞系，并評估吉西他濱的體外敏感性，發(fā)現(xiàn)CRABP-Ⅱ缺失使PDAC細(xì)胞對吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，為克服PDAC耐藥提供了一個新的選擇[12]。Chen等[13]將放療技術(shù)與CRISPR/Cas9基因敲除相結(jié)合阻斷巨噬細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)通路CD47-SIRPα，提高荷瘤小鼠的生存率，降低腫瘤干細(xì)胞，改善預(yù)后，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療提供了新的思路。

2.2??表觀遺傳

癌癥是由遺傳和表觀遺傳共同引起的。CRISPR/Cas9被用于識別可能在腫瘤發(fā)生及治療耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用的異常遺傳和表觀遺傳，例如近期在前列腺癌中的研究[14]。將CRISPR/Cas9技術(shù)與下一代測序（next-generation?sequencing，NGS）相結(jié)合，可能加快目標(biāo)位點(diǎn)的識別、驗證和定位。NGS診斷結(jié)果可作為CRISPR/Cas9工具編輯突變基因的基礎(chǔ)[15]。采用CRISPR/Cas9誘導(dǎo)染色體整體重排可以重塑人類細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組，為表觀遺傳和細(xì)胞基因表達(dá)的研究提供參考[16]。Wang等[17]通過CRISPR/Cas9文庫進(jìn)行篩選，結(jié)合細(xì)胞水平及臨床樣本的驗證，確定了低表達(dá)的肝癌源性生長因子2與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑類藥物的低敏感度密切相關(guān)。這為CRISPR/Cas9技術(shù)在表觀遺傳學(xué)中的研究提供了理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。

2.3??基因治療

CRISPR/Cas9技術(shù)因其高效的編輯效率及靶向不同的靶點(diǎn)等優(yōu)勢，已被用于腫瘤、造血系統(tǒng)疾病，以及聯(lián)合免疫療法用于腫瘤免疫等疾病的基因治療。Kwon等[18]開發(fā)了一種名為CINDELA（cancer-specific?indel?attacker）的腫瘤療法，利用CRISPR/Cas9靶向癌癥特異性插入或缺失（insertions?and?deletions，InDel）突變，導(dǎo)致多處發(fā)生DNA雙鏈斷裂，從而實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。在基于T細(xì)胞的免疫療法中，CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用正在探索中，以改善T細(xì)胞效應(yīng)的功能和持久性，減少治療相關(guān)毒性。Stadtmauer等[19]在Ⅰ期臨床試驗中研究了多重CRISPR/Cas9編輯的安全性和可行性，以提高3名患有多發(fā)性骨髓瘤和轉(zhuǎn)移性肉瘤患者的人類T細(xì)胞的天然抗癌能力，證明CRISPR基因編輯用于癌癥免疫治療的可行性。嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric?antigen?receptor?T-Cell?immunotherapy，CAR-T）的臨床療效已經(jīng)在人類癌癥中得到證實，基于CRISPR/Cas9的基因組編輯的CAR-T細(xì)胞技術(shù)，為腫瘤免疫相關(guān)研究提供了參考，如利用CRISPR/?Cas9篩選將NOXA鑒定為B細(xì)胞惡性腫瘤對嵌合抗原受體CAR-T細(xì)胞療法耐藥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[20]。

2.4??全基因組篩選

目前，基于CRISPR/Cas9的全基因組篩選方式利用基因組規(guī)模的sgRNA文庫在人或小鼠細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除篩選，已經(jīng)篩選到了一系列潛在的治療靶點(diǎn)、功能基因以及與藥物協(xié)同作用產(chǎn)生耐藥性的基因為創(chuàng)新癌癥療法開辟了新的前景。

為識別伯基特淋巴瘤（Burkitt?lymphoma，BL）中的缺陷和腫瘤抑制因子，對3個BL細(xì)胞系進(jìn)行全基因組CRISPR/Cas9功能缺失篩選，確定SHMT2為治療靶點(diǎn)[21]。通過全基因組CRISPR/Cas9篩選發(fā)現(xiàn)蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（protein?arginine?methyltransferase?1，PRMT1）是前列腺癌中雄激素受體表達(dá)及信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[22]。CRISPR/Cas9的全基因組篩已被廣泛用于急性髓性白血?。╝cute?myelogenous?leukemia，AML）篩選治療靶點(diǎn)[23]，但既往大多在體外細(xì)胞系中開展相關(guān)研究，往往忽略了體內(nèi)微環(huán)境對靶點(diǎn)篩選的影響。在代表不同分子亞型的多個小細(xì)胞肺癌（small?cell?lung?carcinoma，SCLC）細(xì)胞系中，利用1個針對已知藥物靶標(biāo)基因的sgRNA文庫進(jìn)行CRISPR/Cas9篩選，確定核輸出蛋白1作為SCLC的一個新治療靶點(diǎn)，抑制它可以顯著提高腫瘤對一線和二線化療的敏感性[24]。結(jié)合生物信息學(xué)，利用CRISPR/Cas9敲除文庫篩選功能基因，最終富集了一批可能影響三陰乳腺癌（triple?negative?breast?cancer，TNBC）轉(zhuǎn)移的候選基因，并表明DGKZ基因是TNBC潛在的促轉(zhuǎn)移基因[25]。

未識別亞型的肝細(xì)胞癌患者適于二甲雙胍治療，F(xiàn)eng等[26]采用CRISPR/Cas9文庫篩選發(fā)現(xiàn)DOCK1的缺失可增強(qiáng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞對二甲雙胍的敏感性，并利用細(xì)胞、類器官、小鼠原位肝細(xì)胞癌等多種模型等方法驗證了DOCK1水平，決定二甲雙胍的抗腫瘤作用。DOCK1是二甲雙胍在HCC中的合成致死靶點(diǎn)，為二甲雙胍在肝細(xì)胞癌中的精準(zhǔn)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。基于CRISPR/Cas9的篩選系統(tǒng)可用于識別與抗癌藥物療效相關(guān)的基因，Chen等[27]通過一系列CRISPR/Cas9庫篩選、RNA轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，硒半胱氨酸生物合成的關(guān)鍵中間物是肝細(xì)胞癌細(xì)胞對化療耐藥的關(guān)鍵介質(zhì)。

2.5??構(gòu)建癌癥動物模型

當(dāng)前CRISPR/Cas9技術(shù)已被運(yùn)用于建立各種小鼠癌癥模型，如胰腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌等。小鼠模型在評估腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)方面有獨(dú)特優(yōu)勢。腫瘤細(xì)胞異位移植是評估靶細(xì)胞系體內(nèi)致瘤潛能最簡單的方法，將細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠皮膚下，評估腫瘤增殖、治療等反應(yīng)。Loesch等[28]通過使用Cre-Lox或腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9方法生成肝細(xì)胞特異性和可誘導(dǎo)小鼠模型，但異位移植模型不能很好地反應(yīng)腫瘤微環(huán)境以及復(fù)雜的免疫細(xì)胞調(diào)控等。Qin等[29]使用全基因CRISPR/Cas9基因敲除，篩選在小鼠原位模型中調(diào)節(jié)卵巢癌腹膜擴(kuò)散的候選基因。Guo等[30]為研究SF3B1R625H突變在泌乳素瘤進(jìn)展中的生物學(xué)作用，使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)獲得了一個雜合的Sf3b1R625H突變大鼠細(xì)胞系。建立癌癥小鼠在了解癌癥的發(fā)生和進(jìn)展方面是必要的，這些模型可以在體內(nèi)研究基因功能并闡明參與腫瘤發(fā)生的途徑。

3??CRISPR/Cas9在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用

對于已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者，化療、靶向治療等的臨床效果有限，晚期患者的5年生存率較低。目前對于卵巢癌轉(zhuǎn)移和化療耐藥的分子機(jī)制尚不清楚，因此利用CRISPR/Cas9技術(shù)尋找新的靶點(diǎn)、耐藥基因或建立卵巢癌轉(zhuǎn)移模型，對早期診斷和開發(fā)新藥改善卵巢癌治療具有重要意義。Xu等[31]利用CRISPR/Cas9全基因組敲除文庫成功構(gòu)建小鼠卵巢癌轉(zhuǎn)移模型，通過篩選提示細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞相關(guān)基因ITK預(yù)測卵巢癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后。同樣，Li等[32]為系統(tǒng)識別卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移調(diào)控的關(guān)鍵基因，利用CRISPR/Cas9基因敲除文庫對原位卵巢癌鼠模型進(jìn)行全基因組基因敲除篩選，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素20受體亞基α在卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移過程中顯著下降，是卵巢癌經(jīng)體腔轉(zhuǎn)移的有效抑制劑。

在研究轉(zhuǎn)移機(jī)制方面，Zhang等[33]使用全基因組CRISPR/Cas9技術(shù)對可能參與卵巢癌轉(zhuǎn)移和失巢凋亡抗性的基因進(jìn)行全面篩選，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-L-異天冬氨酸（D-天冬氨酸）O-甲基轉(zhuǎn)移酶與卵巢癌的失巢凋亡抗性的相關(guān)性最高，是卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因子。

在腫瘤進(jìn)展過程中，有多種因素參與了上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal?transition，EMT）過程。EMT有助于腫瘤轉(zhuǎn)移和促進(jìn)化療耐藥性，但卵巢癌中調(diào)節(jié)EMT過程的機(jī)制尚不清楚。Yin等[34]使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除過表達(dá)TNNC1的SKOV-3-13卵巢癌細(xì)胞中的TNNC1基因，可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時TNNC1缺陷細(xì)胞通過Akt/GSK-3β/Snail信號通路抑制EMT，并通過抑制F-肌動蛋白聚合抑制細(xì)胞運(yùn)動。EIF5A2在幾種癌癥中具有致癌活性并有助于腫瘤轉(zhuǎn)移，為研究其在腫瘤中的作用，使用基于慢病毒載體介導(dǎo)的的?CRISPR/Cas9技術(shù)及過表達(dá)方法，證明EIF5A2通過TGFβ通路促進(jìn)EMT，從而控制卵巢腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[35]。Liu等[36]使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除AMIGO2表達(dá)，對體外和體內(nèi)功能進(jìn)行分析。AMIGO2的敲除改變了卵巢癌細(xì)胞的微球形成潛力，減少了體外黏附和侵襲，并顯著減弱了腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移，強(qiáng)調(diào)AMIGO2是抗轉(zhuǎn)移治療方法的新靶點(diǎn)，旨在阻斷轉(zhuǎn)移性腫瘤球的凝聚力、存活和黏附。網(wǎng)膜是卵巢癌細(xì)胞的首選轉(zhuǎn)移部位，大多數(shù)被診斷患有高級別漿液性卵巢癌的女性存在網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移。為證明網(wǎng)膜巨噬細(xì)胞通過分泌與趨化因子受體1（CC?chemokine?receptor?1，CCR1）相互作用的趨化因子配體可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞向網(wǎng)膜的遷移和定植，Krishnan等[37]利用CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)現(xiàn)抑制CCR可減少卵巢癌的定植。以上研究結(jié)果均有助于更好地理解導(dǎo)致卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

4??小結(jié)

綜上所述，卵巢癌轉(zhuǎn)移是多步驟并具有高度選擇性的過程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶分離、非錨定生長、凋亡逃逸、細(xì)胞遷移、周圍組織浸潤等。CRISPR/Cas9技術(shù)作為精準(zhǔn)的基因治療方法，靶向癌細(xì)胞的多個位點(diǎn)或特異性突變序列，使腫瘤特異性治療成為可能，對卵巢癌轉(zhuǎn)移的后續(xù)研究臨床意義重大，為未來的相關(guān)研究提供了新的思考與幫助。

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