劉春輝 朱晨 陜文生 王志強(qiáng) 王海 周于娜 李少君 金莉婭

肥胖是導(dǎo)致男性生育力降低的高危因素之一[1-5]?，F(xiàn)有研究表明,夫妻當(dāng)中僅男方為肥胖者,參與試管受孕(IVF)輔助妊娠,最終活產(chǎn)率比非肥胖男性參與的IVF更低[6,7]。肥胖可使男性精子數(shù)量、活力、頂體酶功能受損的發(fā)生率升高,并有更大概率引發(fā)男性因素造成的女性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)出現(xiàn)[8,9]。攝食過(guò)度、運(yùn)動(dòng)過(guò)少、選擇高能量食品、遺傳因素、內(nèi)分泌因素、代謝因素是肥胖的誘因,同時(shí)也是男性生育力降低的誘因。一些生活中的混雜因素也間接影響了男性生育力。肥胖導(dǎo)致男性生育力降低的高危因素在不斷的被發(fā)現(xiàn),但肥胖導(dǎo)致的代謝性內(nèi)毒素血癥尚未被探討過(guò),本研究旨在探討與肥胖相關(guān)的代謝性內(nèi)毒素血癥是否對(duì)精子畸形率產(chǎn)生影響,并尋找相關(guān)的危險(xiǎn)因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1～12月在我院就診的男性患者684例,參照第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》,經(jīng)精子形態(tài)學(xué)評(píng)估判斷為畸形精子癥者(正常形態(tài)精子占比<4%)453例作為觀察組,精子無(wú)異常者231例作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn):存在睪丸損傷、隱睪癥或Klinefelter綜合征;3個(gè)月內(nèi)服用過(guò)皮質(zhì)類固醇、魚油、非甾體類抗炎藥、益生菌、抗生素、人絨毛膜促性腺激素、芳香化酶抑制劑、枸櫞酸他莫昔芬、克羅米芬或睪酮[10]。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與基線數(shù)據(jù):受試者血液、精液標(biāo)本均在早晨空腹采集,禁欲時(shí)間需在2～7 d。精液收集后需在1 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)量身高和體重后計(jì)算體重指數(shù)(BMI),BMI>25.00 kg/m2判定為異常。

1.2.2 精漿炎癥活性標(biāo)志物:使用彈性蛋白酶(Elastase)ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司),根據(jù)供應(yīng)商提供的試劑盒使用說(shuō)明書操作,測(cè)定精液中性粒細(xì)胞活性標(biāo)志物彈性蛋白酶,該試驗(yàn)的變異系數(shù)為2%,參考值為1.0～400 ng/ml,>290 ng/ml表明生殖泌尿系感染或炎癥[11]。

1.2.3 腸道通透性標(biāo)志物:使用人連蛋白(Zonulin)ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司 中國(guó)安徽)測(cè)量血清中Zonulin的水平,>8.5 ng/ml判定為異常,本試驗(yàn)的批間變異系數(shù)為3%[12]。

1.2.4 內(nèi)毒素:ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司)測(cè)定血清使用脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)水平。采用雙抗體一步夾心法ELISA進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)LBP分析間接量化代謝性內(nèi)毒素血癥,>15.3 ng/ml判定為異常[13,14]。

1.2.5 精液氧化應(yīng)激:使用8-羥基脫氧鳥苷(8OHdG)ELISA試劑盒(萊爾生物科技公司),采集后的精液經(jīng)3 500 r/min離心10 min后取上清液,使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)80HdG,參考值為2.0～800 ng/ml,>120 ng/ml判定為異常[15]。

1.2.6 精子形態(tài)學(xué)檢測(cè):經(jīng)37℃恒溫箱孵育液化后的精液涂片,自然干燥后使用WHO推薦的DIFF-QUICK快速染色試劑盒(博銳德生物有限公司 中國(guó)深圳)進(jìn)行染色,采用全自動(dòng)精子形態(tài)分析軟件(穗加軟件公司 中國(guó)北京)在光學(xué)顯微鏡1 000倍鏡下計(jì)數(shù)>200條的精子,并計(jì)算精子的正常形態(tài)率,正常形態(tài)精子占比<4%判定為異常。所有操作由同一名人員進(jìn)行檢測(cè),以確保數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。

1.2.7 激素測(cè)定:采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定血清睪酮(TT)、促卵泡生產(chǎn)素(FSH)、促黃體生成素(LH)和雌二醇(E2),上述激素參考范圍分別為1.93～8.36 ng/dl、0～70 pg/ml、1.5～12.4 mU/ml、1.7～8.6 mU/ml。

2 結(jié)果

2.1 2組年齡、體重指數(shù)比較 對(duì)全部684例觀察對(duì)象進(jìn)行分析,年齡23～52歲,觀察組≥40歲人群占比15.2%(69/453),對(duì)照組≥40歲人群占比10.8%(25/231),2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.065P=0.818);684例患者BMI為21.3～33.6 kg/m2,觀察組BMI≥25 kg/m2人群占比72.4%(328/453),對(duì)照組BMI≥25 kg/m2人群占比25.1%(58/231),2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.231,P=0.009)。見(jiàn)表1。

表1 2組年齡、BMI比較

2.2 2組血清Zonulin、LBP和8OHdG水平比較

2.2.1 684例患者腸通透性標(biāo)志物血清Zonulin水平為2.3～21.42 ng/ml,觀察組異常(Zonulin≥8.5 ng/ml)率為79.7%(406/453),對(duì)照組異常率為8.2%(19/231),2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.635P=0.002)。見(jiàn)表2。

表2 2組血清BMI與LBP、Zonulin、8OHdG水平比較

2.2.2 684例患者代謝性內(nèi)毒素血癥標(biāo)志物L(fēng)BP水平為6.1～63.2 ng/ml,觀察組異常(≥15.3 ng/ml)率為69.3%(314/453),對(duì)照組異常率為29.4%(68/231),2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.524P=0.013)。見(jiàn)表2。

2.2.3 精漿氧化應(yīng)激活性標(biāo)志物:8OHdG為13.4～694ng/ml,觀察組異常(≥120 ng/ml)率為73.5%(333/453),對(duì)照組異常率為19.9%(46/231),2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.964P=0.018)。見(jiàn)表2。

2.3 2組性激素水平、感染性標(biāo)志物比較 TT結(jié)果為1.08～7.3 ng/dl,觀察組異常(<1.93 ng/dl或>8.36 ng/dl)率為4.6%(21/453),對(duì)照組異常率為2.2%(5/231),組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.065,P=0.657);FSH結(jié)果為0.8～18.4 mU/ml,觀察組異常(<1.5 mU/ml或>12.4 mU/ml)率為4.9%(22/453),對(duì)照組異常率為1.3%(3/231),組間對(duì)比(χ2=0.034,P=0.601),異常率無(wú)差異性;LH結(jié)果為1.3～11.4 mU/ml,觀察組異常(<1.7 mU/ml或>8.6 mU/ml)率為5.3%(24/453),對(duì)照組異常率為5.2%(12/231),組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.021,P=0.592); E2結(jié)果為12.4～103 pg/ml,觀察組異常(≥70 pg/ml)率為43.5%(197/453),對(duì)照組異常率為10%(23.0/231),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.954,P=0.019);彈性蛋白酶Elastase結(jié)果為14～423.3 ng/ml,觀察組異常(≥290 ng/ml)率為14.8%(67/453),對(duì)照組異常率為16.9%(39/231),組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.026,P=0.648)。見(jiàn)表3。

表3 2組性激素水平比較

2.4 BMI與LBP、Zonulin、8OHdG的相關(guān)性 Zonulin和BMI呈正相關(guān)(r=0.647,P=0.000);LBP和BMI呈正相關(guān)(r=0.514,P=0.000);8OHdG與BMI呈正相關(guān)(r=0.562,P=0.000)。見(jiàn)表4。

表4 BMI與各變量間的相關(guān)性分析結(jié)果

2.5 TT與BMI無(wú)相關(guān)性(r=0.195,P=0.395);FSH與BMI無(wú)相關(guān)性(r=0.032,P=0.475);LH與BMI無(wú)相關(guān)性(r=0.066,P=0.441);E2與BMI存在正性相關(guān)(r=0.727,P=0.028);Elastase與BMI無(wú)相關(guān)性(r=0.046,P=0.717)。提示在觀察組,僅有E2的異常率較高,且E2 與BMI存在正性相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)表4。

2.6 多因素Logistic回歸分析結(jié)果 BMI(OR=5.984,P=0.004)、8OhdG(OR=3.521,P=0.001)、Zonulin(OR=3.241,P=0.017)、LBP(OR=5.511,P=0.001)、E2(OR=4.671,P=0.026)是影響精子畸形率的高危因素。年齡、Elastase、TT、FSH、LH均不是影響精子畸形率的高危因素。見(jiàn)表5。

表5 影響精子畸形率的多因素Logistic回歸分析表

3 討論

肥胖是導(dǎo)致糖代謝紊亂、高脂血癥、激素水平異常及血栓性疾病等多種與代謝異常相關(guān)疾病的高危因素[16]。除此之外,肥胖還會(huì)造成腸上皮細(xì)胞通透性增加,而腸管通透性增加與代謝性內(nèi)毒素血癥、全身炎癥反應(yīng)有關(guān)[17]。攝入過(guò)多含有脂肪的食品則會(huì)導(dǎo)致這種改變發(fā)生[11,18]。人連蛋白Zonulin是一種分子質(zhì)量為47 kD的蛋白,產(chǎn)自于腸上皮和肝臟,它的作用是調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞間的連接緊密程度,從而調(diào)節(jié)大分子、白細(xì)胞和液體在腸腔與血液之間的遷移,是公認(rèn)的腸通透性標(biāo)志物[19]。肥胖者體內(nèi)過(guò)多的脂肪組織會(huì)產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子(如TNFα和IL-6),觸發(fā)Zonulin釋放增多,腸上皮通透性增高,腸道內(nèi)細(xì)菌隨之遷移進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),激活炎性反應(yīng)[14,20,21]。細(xì)菌跨膜通常由以下兩條途徑實(shí)現(xiàn),其一是Zonulin降低腸上皮細(xì)胞間的緊密連接,產(chǎn)生細(xì)胞間通道;其二是由膽汁酸微膠粒穿過(guò)腸上皮細(xì)胞膜脂多糖片段而形成的跨細(xì)胞通道[22,23]。腸腔內(nèi)多見(jiàn)革蘭氏陰性菌,在其細(xì)胞壁上含有大量強(qiáng)效免疫刺激物內(nèi)毒素粘多糖(LPS),進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后,這些腸道來(lái)源的細(xì)菌會(huì)被免疫細(xì)胞所標(biāo)識(shí),并激活炎性反應(yīng)[11,20,24,25]。此時(shí),肝臟內(nèi)另一種糖蛋白被激活,并大量產(chǎn)生,那就是血清脂多糖結(jié)合蛋白LBP,其分子量大小為55～60 kD,在正常狀態(tài)下LBP濃度極低,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)細(xì)菌感染所導(dǎo)致的炎性反應(yīng)時(shí),血清LBP迅速升高,并與LPS結(jié)合形成LPS-LBP復(fù)合物,反映內(nèi)毒素血癥的嚴(yán)重程度[26]。

內(nèi)毒素血癥引起炎癥反應(yīng),炎性反應(yīng)誘發(fā)氧化應(yīng)激,促使白細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)。8OHdG是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度的標(biāo)記物,它是由鳥嘌呤堿基受到ROS攻擊而生成的一種氧化加合物。精漿8OHdG的增高反映了睪丸組織受到了氧自由基攻擊[27]。ROS是強(qiáng)氧化劑,會(huì)對(duì)侵入循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)菌和正常人體組織發(fā)起無(wú)差別化攻擊,其中就包括曲細(xì)精管、生精上皮、精子細(xì)胞和Leydig細(xì)胞,導(dǎo)致一定程度的激素分泌異常、生精功能障礙以及精子畸形率增加[28,29]。有學(xué)者將健康小鼠精子暴露于含有內(nèi)毒素標(biāo)志物L(fēng)BP的培養(yǎng)液中進(jìn)行觀察,并指出即使是低劑量的內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)性暴露,也會(huì)導(dǎo)致健康精子發(fā)生功能性損害[30]。

我們此次進(jìn)行的研究,首先提示肥胖程度與腸上皮通透性呈現(xiàn)正性相關(guān),肥胖越嚴(yán)重,腸道通透性越強(qiáng)。這將導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位,遷移進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。其次,因?yàn)檫w移進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腸道細(xì)菌攜帶大量?jī)?nèi)毒素粘多糖,機(jī)體反應(yīng)性的產(chǎn)生了大量的脂多糖結(jié)合蛋白,與內(nèi)毒素粘多糖結(jié)合形成LPS-LBP復(fù)合物,刺激機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生。肥胖程度與LBP也呈現(xiàn)正性相關(guān),提示肥胖越嚴(yán)重,代謝性內(nèi)毒素血癥越嚴(yán)重。另外,因炎癥激活ROS釋放,肥胖程度與精液中的氧化應(yīng)激標(biāo)志物8OHdG同樣呈現(xiàn)出了正性相關(guān)關(guān)系,提示精液內(nèi)出現(xiàn)ROS攻擊精子細(xì)胞核后的產(chǎn)物,且肥胖越嚴(yán)重,精子受到的氧化攻擊越嚴(yán)重。但此次研究并未發(fā)現(xiàn)睪酮水平與肥胖呈現(xiàn)出相關(guān)性,這與部分學(xué)者提出的肥胖可引起睪丸激素分泌異常的結(jié)論不相符。探索原因,這可能與本研究的被觀察樣本量相對(duì)較小有關(guān),也可能是因?yàn)楸挥^察對(duì)象氧化應(yīng)激并未達(dá)到損傷睪丸內(nèi)分泌功能的嚴(yán)重程度,但我們?nèi)匀徽J(rèn)同他們的觀點(diǎn)。另外,我們發(fā)現(xiàn)肥胖嚴(yán)重程度與雌二醇表達(dá)呈正性相關(guān),肥胖程度越嚴(yán)重,雌二醇水平越高?？紤]這可能與肥胖人群脂肪肝多發(fā),雌激素滅活不足有關(guān)。而過(guò)多的雌激素可對(duì)抗睪酮生物活性,間接的影響睪丸功能與精子質(zhì)量。

在進(jìn)行了多因素Logistic回歸分析后,我們發(fā)現(xiàn)肥胖、代謝性內(nèi)毒素血癥、氧化應(yīng)激、腸道通透性、雌二醇是影響精子畸形率的高危因素,年齡、精漿感染性炎癥、睪酮、促卵泡生成素、促黃體生成素不是影響精子畸形率的高危因素。即使在校正了相關(guān)混雜因素(例如吸煙,飲酒,禁欲時(shí)間)后,這種結(jié)論也未發(fā)生明顯變化。

益生菌是改善腸上皮屏障功能,減少腸道細(xì)菌異位的有效藥物[27]。有報(bào)道稱,益生菌可以改善精子質(zhì)量和提高睪丸激素水平[28]。我們推測(cè)這種改善可能與腸道細(xì)菌異位減少以及氧化應(yīng)激減弱有關(guān)。在改善肥胖人群精子畸形率時(shí)推薦使用益生菌,聯(lián)合抗氧自由基的食品、藥品攝入(如:富含超氧化物歧化酶SOD的香蕉、山楂、刺梨、獼猴桃、大蒜以及維生素C、天然型維生素E、左卡尼汀等),可能成為有別于傳統(tǒng)抗氧化劑治療的潛在替代療法。但效果如何,尚需后續(xù)研究進(jìn)一步觀察。

綜上所述,肥胖可誘發(fā)代謝性內(nèi)毒素血癥,腸道通透性的增加以及內(nèi)毒素水平的升高可造成全身炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。由氧化應(yīng)激造成白細(xì)胞釋放的活性氧ROS將會(huì)造成精子畸形率升高。增強(qiáng)腸道屏障功能的新療法可能會(huì)減少肥胖相關(guān)的炎癥氧化應(yīng)激,從而改善精子畸形率,改善妊娠結(jié)局。