賈祎佳 陸廷盛 姚書眈 楊建文 姬林松 楊再松 羅春山

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是最嚴(yán)重的損傷之一。全世界每年25～50萬人受SCI的影響[1]。SCI可引發(fā)一系列的并發(fā)癥如呼吸問題、自主神經(jīng)反射異常、痙攣等,嚴(yán)重妨礙患者健康及生活質(zhì)量,亟需新方法解決該問題[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)具有較強(qiáng)的更新能力及干細(xì)胞特性,可用于治療各種疾病[3]。研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞來源的外泌體包含miRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等活性物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)、抑制瘢痕形成、促神經(jīng)再生等作用,為SCI治療提供廣闊的治療前景[4]。miRNA是一類小的非編碼RNA,通過直接結(jié)合基因的3’非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)其下游靶基因,在疾病中發(fā)揮重要作用,已證實(shí)其在脊髓損傷中的表達(dá)及功能[5]。但miR-133a作為家族成員之一,研究發(fā)現(xiàn)外泌體來源miR-133a可以對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)影響,參與去神經(jīng)支配等病理學(xué)變化[6]。但BMSCs外泌體來源miR-133a是否可以介導(dǎo)SCI的發(fā)展尚不清楚。本研究探討B(tài)MSCs外泌體來源miR-133a對(duì)SCI大鼠修復(fù)的影響研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞來源:①蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供55只SD清潔級(jí)雄性大鼠,體重210～240 g,7周齡,許可證號(hào):SCXK(甘)2018-0002。所有大鼠均喂養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中,房間溫度(23±2)℃、濕度(50±10)%,12 h光照-12 h黑暗循環(huán),大鼠均自由攝食和飲水。所有程序經(jīng)機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。②無錫欣潤(rùn)生物科技有限公司提供大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2),細(xì)胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中,并加入100 U/ml鏈霉素及青霉素、10%胎牛血清,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器:①?gòu)V州銳博生物科技有限公司提供miR-133a抑制劑及抑制劑對(duì)照(NC);Roche公司提供TUNEL凋亡試劑盒;賽默飛公司提供雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒;Umibio公司提供外泌體提取試劑盒;CST公司提供CD90、CD45抗體;Abcam公司提供Alix、CD63及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)、炎性小體3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-1一抗。②賽默飛公司提供qRT-PCR儀;南京上多川進(jìn)出口貿(mào)易有限公司提供HD-2700透射電鏡;Olympus公司提供CX21顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離及鑒定:隨機(jī)選取5只SD大鼠,脫頸處死,將其浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液中,取出脛骨、股骨,剔除軟組織,暴露骨髓腔,并反復(fù)沖洗骨髓腔,沖洗其中的骨髓置于離心管中,離心10 min后制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度并接種到25 cm2塑料瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)液,同時(shí)洗掉未貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),取生長(zhǎng)至第7代的BMSCs,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物[CD90、CD45]抗體,鑒定BMSCs細(xì)胞。

1.2.2 外泌體提取及鑒定:當(dāng)BMSCs細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí),以外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,參照外泌體提取試劑盒說明書獲得外泌體沉淀,無菌PBS重懸,透射電鏡及Western blot分別觀察外泌體的形態(tài)特征并對(duì)其表面蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.3 BMSCs轉(zhuǎn)染:采用Invitrogen Lipofectamine 2000分別將miR-133a抑制劑(85 nmol/L)、NC(60 nmol/L)轉(zhuǎn)染BMSCs,轉(zhuǎn)染24 h后,離心取上清液,按照1.2.2方法提取含miR-133a抑制劑、NC的外泌體,并通過qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染NC的BMSCs外泌體中miR-133a表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染miR-133a抑制劑的BMSCs外泌體,然后用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)注射。

1.2.4 SCI大鼠的制備及干預(yù):將剩余50只大鼠隨機(jī)分為造模組(40只)、假手術(shù)組(10只),參照文獻(xiàn)[7]制備SCI大鼠:麻醉所有大鼠,俯臥位固定大鼠,背部剃毛并消毒,找到脊背T10棘突,行縱向約2 cm切口,分離肌肉,去除T10椎板,以暴露脊髓。利用沖擊器快速挫傷損傷,當(dāng)大鼠出現(xiàn)尾巴翹起并迅速倒下、雙下肢迅速回縮、劇烈抽搐時(shí)認(rèn)為SCI模型制備成功,假手術(shù)組僅去除T10椎板。造模組大鼠均符合SCI模型標(biāo)準(zhǔn),并將其隨機(jī)為SCI組、外泌體組、外泌體-NC組、外泌體-miR-133a抑制劑組。其中假手術(shù)組、SCI組給予0.9%氯化鈉溶液干預(yù);外泌體組給予鞘內(nèi)注射100 μg/ml外泌體干預(yù)[8],外泌體-NC組、外泌體-miR-133a抑制劑組給予鞘內(nèi)注射0.2 ml含NC或miR-133a抑制劑的外泌體[9],每周1次,注射4周。

1.2.5 BBB評(píng)估大鼠脊髓損傷程度:干預(yù)結(jié)束后,采用BBB評(píng)分對(duì)大鼠脊髓損傷程度進(jìn)行評(píng)估[10],將各組大鼠置于清潔平臺(tái)上,自由活動(dòng)5 min,同時(shí)由2名未參加該實(shí)驗(yàn)研究的觀察者記錄大鼠軀干及前、后肢運(yùn)動(dòng)情況,BBB評(píng)分越低,大鼠脊髓損傷越嚴(yán)重。

1.2.6 HE染色檢測(cè)大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)變化:麻醉大鼠,分離脊髓組織,常規(guī)脫蠟、包埋、切片后蘇木精-伊紅染色,于顯微鏡下觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 TUNEL染色檢測(cè)大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡變化:提取適量脊髓組織,包埋、切片。脫蠟切片與稀釋蛋白酶K在37℃下孵育30 min,然后用4%多聚甲醛固定。清洗后,將切片固于0.3% H2O2-甲醛溶液中,加入Triton X-100在冰上孵育。按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書制備TUNEL反應(yīng)混合物。將切片與TUNEL反應(yīng)混合物一起孵育,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡變化。

1.2.8 RT-PCR檢測(cè)脊髓組織中miR-133a表達(dá)水平:用TRIzol試劑提取組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,SYBR Premix試劑盒進(jìn)行定量PCR,miR-133a引物序列正向:5’-ATAAGAATGCGGCCGCATTCCAAA CTAGCAGCACTA-3’,反向:5’-AGCTTTGTTTAAACTT AACCATTCTAGCTTTTCC-3’,U6引物序列正向,5’-CTTCGGGCAGCACATATACT-3’,反向:5’-AAAATATG GAACGCTTCACG-3’。采用2-△△Ct確定miR-133a的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.9 Western blot檢測(cè)脊髓組織中相關(guān)通路蛋白表達(dá):取適量組織,加入RIPA裂解緩沖液裂解總蛋白裂解,離心收集上清液,并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過10% SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)膜,并用各種一抗(Alix、CD63、GFAP、NeuN、NLRP3、caspase-1)進(jìn)行探測(cè)。然后將膜與二抗一起孵育,以-actin為內(nèi)參,Image J軟件評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.2.10 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)miR-133a、NLRP3關(guān)系:采用Lipofectamine 3000將含有NLRP3的3’UTR片段的野生(WT)或突變(MUT)載體與模擬物陰性對(duì)照(mimics NC)或miR-133a模擬物(miR-133a mimics)共轉(zhuǎn)染到BV-2細(xì)胞中。48 h后收獲細(xì)胞,測(cè)量熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用單因素方差分析多組間比較,進(jìn)一步行SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定:流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示細(xì)胞中CD90,CD45表達(dá)率分別為98.07%、0.09%。見圖1。

圖1 BMSCs的鑒定

2.2 BMSCs外泌體鑒定 透射電鏡觀察到外泌體為近似球形的囊泡,外部包繞雙層膜,且外泌體中Alix、CD63呈陽性表達(dá)。見圖2、3。

圖2 透射電鏡觀察BMSCs外泌體(比例尺=0.1 μm)

圖3 Western blot檢測(cè)BMSCs外泌體Alix、CD63表達(dá)

2.3 5組大鼠BBB評(píng)分 SCI組較假手術(shù)組BBB評(píng)分顯著降低(P<0.05);外泌體組較SCI組BBB評(píng)分顯著增加(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組BBB評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠BBB評(píng)分比較 n=10,分,

2.4 5組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡變化 SCI組較假手術(shù)組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);外泌體組較SCI組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見表2,圖4。

表2 5組大鼠脊髓組織中細(xì)胞凋亡率比較 n=10,%,

圖4 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡變化(TUNEL染色×400)

2.5 5組大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠脊髓組織無明顯變化;SCI組脊髓組織表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,有大量膠質(zhì)瘢痕、空洞形成;外泌體組、外泌體-NC組脊髓結(jié)構(gòu)緊密,損傷部位趨于正常;外泌體-miR-133a抑制劑組膠質(zhì)瘢痕、空洞依然清晰可見。見圖5。

圖5 觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色×100)

2.6 5組大鼠脊髓組織中miR-133a表達(dá) SCI組較假手術(shù)組miR-133a表達(dá)顯著降低(P<0.05);外泌體組較SCI組miR-133a表達(dá)顯著增加(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組miR-133a表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠脊髓組織中miR-133a表達(dá)比較 n=10,

2.7 5組大鼠脊髓組織中相關(guān)蛋白表達(dá) SCI組較假手術(shù)組GFAP、NLRP3、caspase-1表達(dá)顯著增加,NeuN表達(dá)顯著降低(P<0.05);外泌體組較SCI組GFAP、NLRP3、caspase-1表達(dá)顯著降低,NeuN表達(dá)顯著增加(P<0.05);外泌體-miR-133a抑制劑組較外泌體-NC組GFAP、NLRP3、caspase-1表達(dá)顯著增加,NeuN表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6,表4。

表4 5組大鼠脊髓組織中GFAP、NeuN、NLRP3、caspase-1表達(dá)比較 n=10,

圖6 Western blot檢測(cè)脊髓組織GFAP、NeuN、NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá);A 假手術(shù)組;B SCI組;C 外泌體組;D 外泌體-NC組;E 外泌體-miR-133a抑制劑組

2.8 miR-133a、NLRP3關(guān)系驗(yàn)證 Online數(shù)據(jù)庫(kù)顯示miR-133a、NLRP3存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-133a mimics+NLRP3 WT組熒光素酶相對(duì)活性較mimics NC+NLRP3 WT組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7,表5。

表5 4組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性比較 n=6,

圖7 Online數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-133a、NLRP3的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

SCI是破壞性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,伴有運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)功能障礙[11]。SCI的治療是基礎(chǔ)科學(xué)及臨床研究的難點(diǎn),需研究更有效的治療方案[12]。

BMSCs外泌體可以替代細(xì)胞治療,發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)功能,具有無成瘤性、免疫原性更低等優(yōu)勢(shì)[13]。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs外泌體顯著增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成,抑制炎癥、A1神經(jīng)毒性星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,是治療創(chuàng)傷性SCI的有效策略。靜脈輸注BMSCs外泌體可以特異性靶向SCI損傷部位的M2型巨噬細(xì)胞,改善非免疫抑制大鼠挫傷性SCI后的功能恢復(fù)[15]。本研究通過分離大鼠脛骨、股骨獲得BMSCs細(xì)胞,經(jīng)鑒定后從中得到BMSCs外泌體,并通過電鏡觀察及外泌體標(biāo)記分子(Alix、CD63)的檢測(cè)確定為BMSCs外泌體,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)治療。本研究中,與假手術(shù)組大鼠比較,SCI大鼠BBB評(píng)分、NeuN表達(dá)顯著降低,細(xì)胞凋亡率、GFAP、caspase-1表達(dá)顯著增加,但SCI大鼠經(jīng)BMSCs外泌體干預(yù)后,均可逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo),表明BMSCs外泌體減少SCI大鼠中空洞、膠質(zhì)瘢痕的形成,促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)。

BMSCs外泌體通過遞送特定的miRNAs對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能。在創(chuàng)傷性SCI研究中[16],低氧預(yù)處理的BMSCs外泌體來源miR-216a-5p通過改變小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化進(jìn)而進(jìn)行損傷修復(fù)。miR-133a屬于BMSCs外泌體中的一種miRNA,研究表明BMSC-Exo分泌的miR-133a可以改善病毒性心肌炎大鼠上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、心肌纖維化[17]。Online數(shù)據(jù)庫(kù)顯示miR-133a、NLRP3存在結(jié)合位點(diǎn)。Dai等[18]研究證明抑制NLRP3炎癥小體的激活,改善了脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能、保護(hù)神經(jīng)元,為SCI發(fā)生后的炎癥反應(yīng)提供臨床治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)NLRP3為miR-133a的下游靶標(biāo),且SCI大鼠脊髓組織中miR-133a表達(dá)降低,NLRP3表達(dá)增加,表明miR-133a低表達(dá)可能參與SCI的發(fā)生。但研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)BMSCs外泌體干預(yù)后,miR-133a表達(dá)增加,NLRP3表達(dá)下降,進(jìn)一步促進(jìn)脊髓損傷修復(fù),表明BMSCs外泌體來源miR-133a,可改善SCI大鼠損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論,實(shí)驗(yàn)以si miR-133a進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn),但抑制miR-133a表達(dá)逆轉(zhuǎn)了BMSCs外泌體對(duì)SCI大鼠的修復(fù)作用。

綜上所述,BMSCs外泌體來源miR-133a,可能通過靶向抑制NLRP3表達(dá),促進(jìn)SCI大鼠的損傷修復(fù),為臨床治療提供新方案。