陳延寧，侯亞茹，杜麗霞，艾慶蕊，張大虎，侯少陽

（1.菏澤學(xué)院藥學(xué)院，山東菏澤 274015；2.山東康愛制藥有限公司，山東菏澤 274015；3.山東大樹達(dá)孚特膳食品有限公司，山東菏澤 274015）

益生菌（Probiotics）于1907 年由梅切尼科夫首次提出。益生菌廣泛存在于人體內(nèi)，種類多樣，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、提高機(jī)體免疫力等功能。此外，研究發(fā)現(xiàn)益生菌用于發(fā)酵乳制品能夠有效緩解乳糖不耐受癥狀[1]。此外，益生菌對維持宿主腸道菌群平衡有非常重要的作用[2-3]，同時(shí)，益生菌還可用于治療兒童急性腹瀉[4]。干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬，為革蘭氏陽性菌，作為益生菌的一種，具有降血壓、降膽固醇、抑制腫瘤生長的功能，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，具有增強(qiáng)人體免疫以及預(yù)防癌癥等作用[5]。目前針對腸道細(xì)菌的鑒定技術(shù)主要有生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、16S rRNA 測序比對和細(xì)菌特異性基因檢測、全基因組測序[6]等分子生物學(xué)方法[7]。近些年來發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜技術(shù)，可以通過檢測菌體蛋白質(zhì)指紋圖譜達(dá)到對不同細(xì)菌屬、種的鑒定[8]，同時(shí)基于MALDI-TOF 的分型方法也在快速發(fā)展當(dāng)中[9]。但是上述方法均存在操作復(fù)雜等問題，急需一種簡便、高效的干酪乳桿菌鑒別方法，實(shí)現(xiàn)干酪乳桿菌的痕量檢出。

ERIC 序列，即腸桿菌基因間重復(fù)序列，首先由SHARPLES 等[10]于1990 年發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌，并將其命名為基因間重復(fù)單位[11]。腸桿菌科基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈反應(yīng)（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR，ERIC-PCR）是根據(jù)ERIC的核心序列設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增兩個(gè)ERIC 之間序列，不同細(xì)菌的ERIC 序列在染色體的位置不一樣，因此可以根據(jù)擴(kuò)增條帶位置和數(shù)量來判斷是否為同一基因型多位點(diǎn)序列分型[12]，ERIC 序列具有高度保守性，因此通過普通PCR 方法擴(kuò)增片段可以獲得DNA 指紋圖譜[13]。ERIC-PCR 技術(shù)在DNA 指紋圖譜技術(shù)中的廣泛應(yīng)用使得細(xì)菌在亞種層次上的鑒別分類有了更好的依據(jù)[14-15]。由于此方法較傳統(tǒng)鑒別方法更為便利，目前被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)中的菌株鑒別分類方面。由于細(xì)菌基因組的復(fù)雜性，不同的細(xì)菌會(huì)有不同的反應(yīng)條件，通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系，利用ERIC-PCR 技術(shù)設(shè)計(jì)出特異性引物，可在不同的細(xì)菌DNA 中靶向鑒別出特定的菌株。

本實(shí)驗(yàn)通過利用ERIC-PCR 技術(shù)設(shè)計(jì)出特異性引物，首先將目的菌株進(jìn)行分離純化，再運(yùn)用改良的SDS 堿裂解法提取目的菌株的DNA，通過對比不同反應(yīng)條件下的結(jié)果，對ERIC-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，再將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并將目的片段進(jìn)行回收測序，得到測序結(jié)果后，運(yùn)用DNAMAN V6 軟件進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，最終得到特異性引物并進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的特異性引物可以在菌株混合基因組DNA 中通過PCR 技術(shù)檢測出干酪乳桿菌，提高了菌種的特異性鑒別效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1.2 材料與試劑

瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司；2K plus Ⅱ DNA marker，北京全式金生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；Tris 堿、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS），德國Sigma 公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB），美國Amresco 公司；Taq DNA 聚合酶、T5 單克隆載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因DNA 的提取純化

將干酪乳桿菌HP-B1142 接種至MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，獲得純化的目的菌株。目前有許多提取DNA 的方法，為了提高實(shí)驗(yàn)效率，本實(shí)驗(yàn)使用改良的SDS 堿裂解法，用50 μL 含有RNase A酶（10 mg·L-1）的1×TE 溶液重懸，于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 設(shè)計(jì)特異性引物探針

使用ERIC-PCR 技術(shù)對HP-B1142 基因組DNA進(jìn)行PCR，對長度約為2 700 bp 和500 bp 的兩條DNA 片段進(jìn)行回收，連接至T5 載體，送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

將得到的兩組測序結(jié)果利用BLAST 在線比對工具進(jìn)行比對分析，同時(shí)將序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫，接收序列號(hào)分別為OP700792、OP700793。利用DNAMAN V6 軟件設(shè)計(jì)出對應(yīng)片段的特異性引物，最后進(jìn)行引物的特異性檢驗(yàn)。

1.3.3 引物探針的含量限度檢驗(yàn)

從實(shí)驗(yàn)室自建微生物資源菌庫中選取5 株常用益生菌菌株，分別為植物乳桿菌HP-B1098、鼠李糖乳桿菌HP-B1083、副干酪乳桿菌HP-B1145、嗜酸乳桿菌HP-B1079、瑞士乳桿菌HP-B1126，將其作為陰性對照。取以上5 種細(xì)菌等濃度的混合DNA 溶液，等量混合，使混合基因組DNA 濃度與干酪乳桿菌基因組DNA 濃度相等。將干酪乳桿菌基因組DNA 與5 種細(xì)菌的混合DNA 溶液相混合，配制成干酪乳桿菌基因組DNA 相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%（絕對含量900 ng·mL-1）、30%（絕對含量270 ng·mL-1）、3%（絕對含量27 ng·mL-1）、0%（絕對含量0 ng·mL-1）的混合溶液作為模板，使用設(shè)計(jì)的兩對特異性引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

1.3.4 引物的特異性檢驗(yàn)

美女學(xué)霸從來都文理兼優(yōu)，吳健雄不是天生的理工女，而是她的天分決定了她做什么都可以很優(yōu)秀，歷史可以學(xué)得那么出眾，得到名師們的一致滿分，物理可以學(xué)得那么牛，竟然沖出亞洲，走向了世界。

為了檢測本實(shí)驗(yàn)中的兩組特異性引物是否可以特異性鑒別干酪乳桿菌，特從實(shí)驗(yàn)室中選取了其他不同的5 種細(xì)菌進(jìn)行檢驗(yàn)。5 種細(xì)菌分別為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌。以本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的1142-a-F/1142-a-R為一對引物，1142-2-F/1142-2-R 為一對引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

1.3.5 引物的普適性檢驗(yàn)

為了確定該引物探針是否可以通用地檢測出干酪乳桿菌這一菌種，現(xiàn)選取干酪乳桿菌的近緣菌株進(jìn)行普適性檢驗(yàn)，驗(yàn)證其通用性。將Lactobacillus caseiDSM 20011、Lactobacillus caseJCM 8129、Lactobacillus caseIDCC 3451、Lactobacillus caseJX 20225、Lactobacillus caseATCC 11443 共5 株近緣干酪乳桿菌作為引物探針普適性檢驗(yàn)的對照，分別對上述菌株及本實(shí)驗(yàn)所研究的干酪乳桿菌HP-B1142 進(jìn)行PCR，以所設(shè)計(jì)的1142-a-F/1142-a-R 為一對引物，1142-2-F/1142-2-R 為一對引物，進(jìn)行PCR 檢測。

1.3.6 運(yùn)用兩對特異性引物檢驗(yàn)市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品

通過選取3 種市售產(chǎn)品來進(jìn)行檢驗(yàn)，可以用來確定本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩對特異性引物是否可以精準(zhǔn)檢驗(yàn)出產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，檢測其實(shí)用效果。選取3種市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA 為模板，以所設(shè)計(jì)的1142-a-F/1142-a-R 為一對引物，1142-2-F/1142-2-R 為一對引物，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 測序及特異性引物的設(shè)計(jì)

以干酪乳桿菌DNA 作為模板進(jìn)行ERIC-PCR操作，獲得長度約為2 000 bp 和500 bp 的兩條DNA 條帶，通過測序獲得其DNA 序列，長度分別為1 815 bp 和428 bp。使用DNAMAN V6 軟件分別設(shè)計(jì)出針對兩條DNA 片段的特異性引物探針。引物探針命名及序列分別為1142-a-F：5'-CTAAG GTAGCTGATCGGTGGCACGATC-3'，1142-a-R：5'-CACTCTTGCCAATGGTCATCGCTG-3'；1142-2-F：5'-CAATCCATCAGTCAGAATGTGGAAGC-3'，1142-2-R：5'-CGAATGCACATGAGGATATCATTT CAGC-3'。同時(shí)使用兩對特異性引物以干酪乳桿菌HP-B1142 基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR，可以得到條帶清晰長度約為400 bp 和1 800 bp 的目標(biāo)片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 兩對特異性引物的設(shè)計(jì)結(jié)果檢驗(yàn)?zāi)z電泳圖

2.2 引物的特異性檢驗(yàn)

為了確定本特異性引物是否具有特異性，是否能達(dá)到特異性鑒別干酪乳桿菌的目的，采用PCR 的方式驗(yàn)證兩對引物探針的特異性。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，由圖2 可知，以干酪乳桿菌基因組DNA 為模板的1、2 泳道可成功獲得目標(biāo)條帶，而以其他菌株基因組DNA 為模板的泳道均無法得到目標(biāo)條帶。由此，該特異性引物探針可特異性檢出干酪乳桿菌。

圖2 引物的特異性檢驗(yàn)?zāi)z電泳圖

2.3 引物探針可檢測基因組DNA 的含量限度檢驗(yàn)

為確定本研究所設(shè)計(jì)的兩對特異性引物探針可檢測的基因組DNA 含量限度，以混合DNA 溶液為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。由圖3 中可知，在干酪乳桿菌基因組DNA 濃度為27 ng·mL-1時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的兩對引物探針依然可完成干酪乳桿菌的特異性檢出。

圖3 引物的含量限度檢驗(yàn)?zāi)z電泳圖

2.4 引物探針普適性檢驗(yàn)

由于干酪乳桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)應(yīng)用和研究中，因此，準(zhǔn)確鑒別干酪乳桿菌種及其近緣種也同樣重要。采用本實(shí)驗(yàn)中的兩對引物探針，對與HP-B1142 近緣的5 株干酪乳桿菌進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩對引物探針均可擴(kuò)增出目標(biāo)條帶從而實(shí)現(xiàn)近緣干酪乳桿菌檢出。

圖4 引物普適性檢驗(yàn)?zāi)z電泳圖

2.5 運(yùn)用兩對特異性引物檢驗(yàn)市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品

選取3 種市售產(chǎn)品來進(jìn)行檢驗(yàn)，可以用來確定本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩對特異性引物是否可以達(dá)到精準(zhǔn)檢驗(yàn)產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，檢測其實(shí)用效果。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。圖5 中泳道均可得到目標(biāo)條帶，進(jìn)而判斷市售產(chǎn)品中含有干酪乳桿菌。由此可知，本實(shí)驗(yàn)涉及的兩對特異性引物探針可以用于市售產(chǎn)品中干酪乳桿菌的檢驗(yàn)，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

圖5 引物對于市售產(chǎn)品檢驗(yàn)?zāi)z電泳圖

3 結(jié)論

ERIC-PCR 技術(shù)在DNA 指紋圖譜技術(shù)中的廣泛應(yīng)用，使得細(xì)菌在亞種層次上的鑒別分類有了更好的依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過使用ERIC-PCR 技術(shù)設(shè)計(jì)得到的兩對特異性引物，已將引物序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，接收序列號(hào)為OP700792、OP700793。獲得兩對引物探針1142-a-F/1142-a-R，1142-2-F/1142-2-R，并驗(yàn)證其特異性、普適性、含量限度及是否可鑒別市售產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，大大增強(qiáng)了該引物探針的實(shí)用性及可靠性。上述兩對引物探針可以在微量DNA 溶液（絕對含量27 ng·mL-1）中高效實(shí)現(xiàn)干酪乳桿菌的痕量檢出，并可在復(fù)雜生境中實(shí)現(xiàn)市售產(chǎn)品中干酪乳桿菌的特異性檢出。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩對特異性引物探針較現(xiàn)有干酪乳桿菌的鑒別方法有了較大優(yōu)化，克服了現(xiàn)有方法中操作復(fù)雜、易被污染的缺點(diǎn)，可簡單、快速檢出復(fù)雜生境樣本中干酪乳桿菌；在醫(yī)療保健、科研活動(dòng)等方面有著良好的實(shí)用性和廣闊的市場前景。