魯欣欣 鄒 明 靳榮線 馬海濤 劉翼成 李 峰

（新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，河南 新鄉(xiāng) 453000）

金針菇Flammulina filiformis，又稱構(gòu)菌、冬菇、毛柄金錢菌，屬蘑菇綱Agaricomycetes、蘑菇目Agaricales、膨瑚菌科Physalacriaceae、冬菇屬Flam?mulina[1-2]。金針菇富含蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、多糖、黃酮等各種營養(yǎng)成分[3-5]，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血脂、抗疲勞等多種藥用保健價(jià)值，是比較受歡迎的一種菇類。

金針菇有白色、黃色2個(gè)品系[6]，野生菌株為黃色，白色為其變異株。黃色金針菇比白色金針菇生長速度快、溫度適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)，是選育優(yōu)良金針菇品種的重要親本；且鮮味濃郁，口感脆爽，優(yōu)于白色金針菇，市場(chǎng)接受度較高。目前我國工廠化栽培金針菇所用的菌種多數(shù)引自國外，不但每年須支付昂貴的菌種使用費(fèi)，且隨著菌種使用年限增長，均會(huì)出現(xiàn)一定程度退化問題[7]。我國野生金針菇資源豐富，但很少有人對(duì)其馴化開發(fā)。因此，筆者以在河南省開展野生食用菌資源普查過程中采集的一株黃色野生金針菇為試驗(yàn)材料，開展其母種培養(yǎng)基優(yōu)化及出菇試驗(yàn)，以期豐富金針菇菌質(zhì)資源，為金針菇優(yōu)良品種選育提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株：野生金針菇菌株于2021 年10 月26 日采自河南省濟(jì)源市承留鎮(zhèn)南山森林公園（東經(jīng)112°50′，北緯35°08′，海拔400 m）。采用組織分離法[8]分離的菌株，編號(hào)為21JYF01，由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。

（2）培養(yǎng)基

加富PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂20 g，加水定容至1 L。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，MgSO41.5 g，KH2PO43 g，瓊脂18 g，加水定容至1 L。

原種培養(yǎng)料：煮熟麥粒98%，石膏2%。

栽培種培養(yǎng)料：玉米芯64%，棉籽殼20%，麩皮15%，石灰1%。料含水量64%～65%。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察野生金針菇生長環(huán)境及子實(shí)體形態(tài)、顏色等特征并拍照，結(jié)合《中國大型菌物資源圖鑒》（李玉2015）進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將21JYF01 菌株接于PDA 平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將培養(yǎng)菌絲送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序（采用ITS 序列分析），對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分子鑒定[9]，拼接序列在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對(duì)，查找同源相似性較高的序列，并利用MEG11.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該野生金針菇菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3 菌絲培養(yǎng)特性研究

將組織分離純化后得到的母種菌株轉(zhuǎn)接至PDA 試管斜面，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲長勢(shì)，測(cè)定菌絲生長量，計(jì)算菌絲平均生長速度。

1.4 菌絲培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

將活化菌株21JYF01 轉(zhuǎn)接至PDA 平板中培養(yǎng)，待菌落長滿培養(yǎng)皿后進(jìn)行菌絲培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)。采用直徑0.5 cm 的打孔器打取菌株21JYF01菌塊，分別接種于各組試驗(yàn)的培養(yǎng)基平板上，除溫度試驗(yàn)外都置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)[10]，每組試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

觀察記錄各處理菌絲的顏色、長勢(shì)、滿板時(shí)間等。以菌落平均半徑除以培養(yǎng)時(shí)間（d）即為菌絲平均生長速度。

1.4.1 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

培養(yǎng)基為PDA。培養(yǎng)溫度設(shè)5 ℃、10 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃5個(gè)處理。

1.4.2 碳源試驗(yàn)

以不添加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，設(shè)5種碳源處理組，分別為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖。

1.4.3 氮源試驗(yàn)

以不添加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，設(shè)5種氮源處理組，分別為蛋白胨、谷氨酸鈉、酵母粉、氯化銨、尿素。

1.4.4 碳氮比試驗(yàn)

在添加最適碳源（20 g∕L）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加不同含量的1.4.3 試驗(yàn)最適氮源，配置碳氮比5 個(gè)處理分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1。

1.5 出菇試驗(yàn)

栽培方法常規(guī)，觀察21JYF01菌株的出菇表現(xiàn)。

培養(yǎng)料配方為玉米芯68%，棉籽殼16%，麩皮15%，石灰1%。料含水量為64%～65%。按照配方拌料后，采用直徑為8 cm 的聚丙烯塑料瓶裝料，共20 瓶，于121 ℃高壓滅菌2 h，在無菌條件下按照5%的接種量接種。

接種后培養(yǎng)20 d 左右菌絲滿瓶，搔菌后控制空氣相對(duì)濕度為85%～90%，培養(yǎng)溫度降至7～10 ℃催蕾，適宜的散射光照，7 d左右可現(xiàn)蕾，菌蓋開始平展時(shí)采收。觀察子實(shí)體形態(tài)，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量，計(jì)算生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 野生菌株生態(tài)環(huán)境調(diào)查及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

供試野生食用菌采集于河南省濟(jì)源市承留鎮(zhèn)南山森林公園（圖1）。子實(shí)體長于闊葉林山中，屬于腐生木生菌，子實(shí)體叢生，菌蓋呈扁平球形，直徑6 cm，邊緣黃色中間黃褐色，表面較黏；菌柄長5 cm，粗1.5 cm，圓柱形，中生，纖維質(zhì)，空心，上淡黃色下紅褐色。根據(jù)宏觀特征初步鑒定該菌為野生金針菇。

圖1 野生金針菇生態(tài)照

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將菌株21JYF01的ITS序列在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，獲取與該序列同源性最高的20 個(gè)菌株序列，發(fā)現(xiàn)其與金針菇的匹配度達(dá)98%以上。由圖2 構(gòu)建的進(jìn)化樹可知，其結(jié)果與登錄號(hào)為MH469685.1 的菌株Flammulina filiformis聚為一類，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，鑒定該野生菌株21JYF01為金針菇。

2.2 菌株菌絲培養(yǎng)特性

野生金針菇菌株母種接種PDA 培養(yǎng)基上2 d 后開始萌發(fā)，培養(yǎng)7 d 菌絲長滿斜面，菌絲潔白、濃密、粗壯整齊；原種菌絲滿袋時(shí)間約為28 d，栽培種菌絲長滿瓶時(shí)間約為20 d。

2.3 菌絲培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果

由表1和圖3可知，不同培養(yǎng)溫度下21JYF01菌株菌絲生長速度均具有顯著差異，溫度為25 ℃時(shí)，菌絲生長速度最快，達(dá)6.3 mm∕d，菌絲潔白濃密；溫度為30 ℃時(shí)，菌絲生長速度較快，但較稀疏且氣生菌絲旺盛；溫度低于20 ℃時(shí)，菌絲生長速度緩慢；溫度為5 ℃時(shí)，菌絲未萌發(fā)。綜合分析，21JYF01 菌株菌絲最適生長溫度為25 ℃。

表1 不同培養(yǎng)溫度下21JYF01菌株菌絲長勢(shì)

圖3 試驗(yàn)溫度下21JYF01菌株菌絲生長狀態(tài)（平板，下同）

2.3.2 碳源試驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉為碳源的培養(yǎng)基中21JYF01 菌株菌絲生長速度最快，但在葡萄糖為碳源培養(yǎng)基中菌絲最為濃密，在乳糖為碳源培養(yǎng)基中菌絲生長最慢且稀疏。綜合菌絲長勢(shì)和生長速度，最適碳源為葡萄糖。

圖4 試驗(yàn)碳源培養(yǎng)基上21JYF01菌株菌絲生長狀態(tài)

2.3.3 氮源試驗(yàn)結(jié)果

由圖5 可知，21JYF01 菌株菌絲在供試氮源培養(yǎng)基中均可生長，但在氮源空白（CK）或以尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度和長勢(shì)最差，在酵母粉、蛋白胨、谷氨酸鈉為氮源培養(yǎng)基中菌絲生長基本一致，其中酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中菌絲長勢(shì)最好，潔白且濃密。綜合菌絲長勢(shì)及生長速度，最適培養(yǎng)基氮源為酵母粉。

圖5 供試氮源培養(yǎng)基中21JYF01菌株菌絲生長狀態(tài)

2.3.4 碳氮比試驗(yàn)結(jié)果

由圖6 可知，21JYF01 菌株菌絲在試驗(yàn)碳氮比培養(yǎng)基中均能生長，生長速度并無較大差異；培養(yǎng)基碳氮比為40∶1的培養(yǎng)基中菌絲生長最差，碳氮比為10∶1 培養(yǎng)基中菌絲長勢(shì)最好且濃白。綜合菌絲長勢(shì)及生長速度，培養(yǎng)基最適碳氮比為10∶1。

圖6 試驗(yàn)碳氮比培養(yǎng)基中21JYF01菌絲生長狀態(tài)

2.4 出菇試驗(yàn)結(jié)果

金針菇菌株21JYF01從接種至菌絲長滿出菇瓶用時(shí)20 d，菌絲滿瓶7 d 后開始出現(xiàn)原基，原基生長7 d 后子實(shí)體成熟采收。頭潮菇生物學(xué)效率為78.5%，可采收1～2 潮。由圖7 可知，21JYF01 菌株子實(shí)體叢生，菇體健壯，出菇整齊，子實(shí)體菌蓋顏色總體呈淡黃色，中間顏色較深且表面光滑（菌蓋直徑達(dá)2.6 cm）；菌柄呈淡黃色（最長為9.7 cm），農(nóng)藝性狀均較好，可作為工廠化栽培菌株。

圖7 金針菇21JYF01菌株出菇狀態(tài)

3 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)形態(tài)觀察結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)鑒定21JYF01菌株為金針菇Flammulina filiformis。

對(duì)該野生金針菇菌株生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明：培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)21JYF01 菌株菌絲生長速度最快，且菌絲潔白濃密；在除乳糖之外的供試碳源培養(yǎng)基中菌絲生長均較好，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基中菌絲長勢(shì)最健壯；在以尿素為氮源培養(yǎng)基中菌絲長勢(shì)最差，以酵母粉為氮源培養(yǎng)基中菌絲長勢(shì)最好，潔白濃密且菌落邊緣整齊，說明該菌株對(duì)有機(jī)氮源利用率較好；培養(yǎng)基碳氮比為10∶1時(shí)菌絲長勢(shì)最優(yōu)。

出菇試驗(yàn)結(jié)果，以玉米芯為主料，21JYF01 菌株菌絲長勢(shì)旺盛，生長周期較短，出菇整齊，菇體健壯，呈淡黃色。該菌株有較好馴化推廣價(jià)值，也可為今后選育優(yōu)良金針菇提供新種質(zhì)。