呂茂琳，王存吉，熱洋尼沙·卡的，高 穎

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 綜合內(nèi)三科，新疆 烏魯木齊 830054

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)由多種危險因素所致,包括年齡、性別、血脂異常、肥胖、高血壓、糖尿病和吸煙等[1-2]。每年約740萬人死于CHD,其中,急性心肌梗死的患者在全世界接近300萬人[3-4]。

促?；鞍?acylation stimulating protein,Asp)是由脂肪細(xì)胞合成的脂肪因子,因其刺激脂質(zhì)儲存,在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[5]。Asp通路代謝失調(diào)可導(dǎo)致肥胖及心血管疾病[6]。Asp可激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,Erk)[7],激活的后者可以保護心臟免受再灌注損傷[8]。本研究用Asp-/-小鼠及野生型小鼠構(gòu)建心肌梗死模型,探討Asp在急性心肌梗死中的作用及其機制。為個體化的診斷和基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物: SPF級雄性C57BL/6小鼠10只、Asp 敲除純合子(Asp-/-)C57BL/6小鼠10只,8周齡,體質(zhì)量20～25 g[來源單位:上海南方模式動物研究中心;合格證號SYXK(滬)2017-0012]。

1.1.2 試劑(盒):10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液(轉(zhuǎn)膜液)及5×電泳緩沖液選自北京索萊寶科技有限公司。總膽固醇(TC)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒、三酰甘油(TG)測定試劑盒、IL-8測定試劑盒及eNOS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。Erk1/2及p-Erk1/2抗體(Cell Signaling Technology試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理:將C57BL/6和Asp-/-小鼠分別分為對照組和MI組(結(jié)扎冠狀動脈前降支),每組5只。結(jié)扎心臟區(qū)域周圍的心肌顏色變深,運動減弱,說明造模成功。24 h后開胸留取心臟及血液。

國內(nèi)農(nóng)業(yè)需求冷清；工業(yè)方面，環(huán)保壓力較大，復(fù)合肥和膠板企業(yè)開工率保持低位，對尿素隨用隨采，需求較少。出口方面，雖印度展開招標(biāo)，但國際供給充足，價格下跌，對國內(nèi)市場難形成利好支撐。供給方面，煤炭、天然氣進入供暖需求旺季，價格有所上漲，成本上對尿素價格支撐較強，開工率預(yù)計將保持低位或進一步下跌。綜上預(yù)計，近期尿素價格或?qū)⒏呶怀址€(wěn)，需關(guān)注環(huán)保形勢和冬儲進展情況。

1.2.4 伊文思藍-TTC染色:2% 伊文思藍染色及TTC染色后,觀察各組MI術(shù)后小鼠白色梗死區(qū)、紅色缺血區(qū)及藍色存活區(qū)面積。

1.2.6 Western blot檢測 Erk1/2和p-Erk1/2的表達:造模后24 h取結(jié)扎線以下左心室心肌,研磨并提取心肌組織,制備蛋白樣品,每孔上樣后,置于電泳緩沖液中電泳90 min,分離目的蛋白,電轉(zhuǎn)2 h,5%奶粉封閉1 h后,Erkl/2及p-Erkl/2和GAPDH一抗置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜,TBST洗膜3次后,山羊抗兔二抗室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜3次,ECL顯色、曝光、掃描、吸光度分析。

1.2.2 空腹體質(zhì)量及血糖的檢測:非麻醉狀態(tài)下鼠尾采血,羅氏血糖儀監(jiān)測小鼠禁食8 h后的血糖值,小鼠處死前稱空腹體質(zhì)量。

Asp-/-+MI術(shù)后組與C57+MI術(shù)后組心肌伊文思藍-TTC染色相比,白色染區(qū)增多,紅色及藍色染區(qū)減少(圖3)。

1.2.3 心臟超聲:術(shù)后24 h后,采用M型超聲檢測小鼠連續(xù)5次的心動周期,取均值。計算左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)、左心室收縮末內(nèi)徑(LVESd)、射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

MI造模后的C57野生型小鼠與Asp-/-小鼠IL-8均高于術(shù)前水平,且Asp-/-MI術(shù)后IL-8水平較C57+MI升高(P<0.05)。兩組術(shù)后的eNOS含量較術(shù)前明顯降低(P<0.05)(圖4A)。與C57野生型小鼠相比,在相同飲食條件下Asp-/-小鼠血清LDL-C、HDL-C及TC與C57野生型小鼠無明顯差異,TG較C57野生型小鼠明顯升高(P<0.05)(圖4B)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量和血糖

Asp-/-組小鼠的體質(zhì)量及空腹血糖較C57組小鼠明顯增加(P<0.05)。Asp-/-+MI術(shù)后的空腹血糖及體質(zhì)量較C57+MI組小鼠也明顯升高(P<0.05)(圖1)。

《母嬰安全行動計劃（2018－2020年）》提出，到2020年全國孕產(chǎn)婦死亡率下降到18/10萬，全國嬰兒死亡率下降到7.5‰。該計劃提出，開展妊娠風(fēng)險防范、危急重癥救治、質(zhì)量安全提升、?？颇芰ㄔO(shè)、便民優(yōu)質(zhì)服務(wù)等5大行動。

*P<0.05 compared with C57.圖1 各組小鼠體質(zhì)量及空腹血糖的變化分析Fig 1 Weight and fasting blood glucose level in different

2.2 超聲對各組小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

與C57+MI手術(shù)組相比,Asp-/-+MI組LVEDd、LVESd、FS及EF均有明顯改變(P<0.05)。Asp-/-+MI組的左室收縮末徑及左室舒張末徑均明顯高于C57+MI手術(shù)組,短軸縮短率及射血分?jǐn)?shù)明顯低于C57+MI手術(shù)組小鼠(圖2)。

*P<0.05 compared with C57.圖2 各組小鼠心臟超聲檢測結(jié)果Fig 2 The results of echocardiography of mice in each group

2.3 伊文思藍-TTC染色檢測小鼠缺血心肌面積

1.2.5 ELISA檢測小鼠血清血脂譜、IL-8及eNOS:取小鼠下腔靜脈血液1 mL,4 ℃ 1 500 r/min離心15 min之后,取出上清液至離心管中備用。采用TC、TG、LDL-C、HDL-C、IL-8和eNOS ELISA試劑盒測定含量或活性。

Myocardium of Asp-/-+MI group and C57+MI group were stained with Evans blue-TTC; white stained areas was larger, indicating that the area of myocardial infarction in Asp-/- mice was larger.The area of viable myocardium and ischemic myocardium was smaller than that of C57+MI.圖3 心梗術(shù)后心肌染色結(jié)果Fig 3 Myocardial staining results after myocardial infarction

2.4 心肌IL-8、eNOS及血脂譜變化

*P<0.05 compared with non-MI or C57; #P<0.05 compared with C57+MI.圖4 各組小鼠心肌IL-8、eNOS及血脂譜的變化Fig 4 Changes of IL-8, eNOS and lipid profile in myocardium of each

2.5 心肌Erk1/2和p-Erk1/2的表達

C57及Asp-/-組心肌Erk1/2及p-Erk1/2的表達無顯著差異。MI后,Asp-/-+MI組Erk1/2及p-Erk1/2表達較C57+MI組明顯減弱(P<0.05)。Asp-/-+MI組Erk1/2及p-Erk1/2表達較Asp-/-基因敲除組明顯減弱(P<0.05)(圖5)。

有意見則認(rèn)為閃族語系是后來分成語支的。這里有兩個疑點：第一，語言分支的產(chǎn)生；第二，巴比倫國與巴別塔建造的先后。

*P<0.05 compared with Asp-/- non-MI; #P<0.05 compared with C57+MI.圖5 心肌組織中Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表達Fig 5 The protein expression of Erk1/2 and p-Erk1/2 in myocardium

3 討論

脂肪組織是一個具有代謝、內(nèi)分泌和免疫功能的器官,可影響多種生理過程[9]。Asp作為強刺激因子可促進脂肪酸酯化和三酰甘油合成。故Asp與肥胖、動脈粥樣硬化密切相關(guān)[10]。本研究提示Asp基因敲除小鼠的體質(zhì)量和空腹血糖均高于野生型小鼠,且體型明顯大于野生型小鼠,說明當(dāng)Asp基因缺失時,小鼠體內(nèi)的糖和脂代謝受到影響。Asp基因敲除小鼠血清的TG明顯高于野生型小鼠,進一步說明Asp可影響脂代謝,從而可能影響心血管功能。

有報道在心肌梗死患者的血液和動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)了包括 C3 在內(nèi)的活化補體副產(chǎn)物水平的改變[11],Asp是C3裂解物。本研究發(fā)現(xiàn),Asp-/-+MI小鼠的左室收縮末徑與左室舒張末徑均明顯高于C57+MI小鼠,短軸縮短率及射血分?jǐn)?shù)明顯低于C57+MI小鼠,說明在MI發(fā)生后,Asp敲除小鼠的心功能較野生型MI小鼠明顯降低;提示Asp對小鼠心肌的保護作用。

考慮到兩電平逆變器存在8個電壓矢量,在價值函數(shù)優(yōu)化過程中,需要對這8個電壓矢量進行優(yōu)化求解,這使得優(yōu)化求解過程的計算量顯著增加.為了降低優(yōu)化求解的計算量,本工作設(shè)計了一種優(yōu)化矢量選擇器,通過定子磁鏈的給定值求得給定的電壓矢量,使得在價值函數(shù)優(yōu)化過程中只需對給定電壓矢量所在扇區(qū)的3個電壓矢量進行優(yōu)化求解即可,有效降低了優(yōu)化求解的計算量.下面對優(yōu)化矢量選擇器的設(shè)計過程進行詳細(xì)描述.

1．2．2 心理健康評定 采用中學(xué)生《心理健康診斷綜合測量》（MHT）［7］，該表是我國心理工作者據(jù)日本鈴木清等編制的《不安傾向診斷測驗》，參考我國學(xué)生實際情況修訂而成，其折半信度為0．83～0．88，重測信度為0．663～0．870，效度＞0．76。含8個內(nèi)容量表和1個效度量表。8個內(nèi)容量表是學(xué)習(xí)焦慮、對人焦慮、孤獨傾向、自責(zé)傾向、過敏傾向、身體癥狀、恐怖傾向、沖動傾向等。分量表分高于8分視為有焦慮傾向；8個內(nèi)容量表原始分之和查表得出總焦慮傾向標(biāo)準(zhǔn)分，在65分以上，為高焦慮水平，視為存在心理問題。

兩組治療總有效率[2] 。療效判定標(biāo)準(zhǔn)：顯效：治療后，咳嗽、咳痰、喘息等臨床癥狀和體征基本消失，經(jīng)實驗室檢查可見炎性病灶基本吸收；有效：各項臨床癥狀和體征得到明顯緩解，炎性病灶控制良好；無效：臨床癥狀和身體體征均未出現(xiàn)明顯變化，炎性病灶未被吸收，或病情出現(xiàn)嚴(yán)重化趨勢。治療總有效率=顯效率+有效率。

在MI手術(shù)后,Asp-/-小鼠心肌梗死的面積更大,而存活心肌和缺血心肌的面積較野生型減少,進一步說明了Asp基因在小鼠MI中發(fā)揮著重要作用。C57+MI組小鼠的Erk1/2及p-Erk1/2的表達較Asp-/-組明顯增強,說明Asp基因可通過Erk1/2信號通路影響小鼠心功能。

本研究發(fā)現(xiàn)Asp通過激活Erk1/2信號通路來減輕小鼠的心肌損傷,此結(jié)果為臨床治療心肌梗死所致的心肌損傷提供了新的思路和新靶點。