柳子朝，杜文靜，2，李 莉*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；2.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030606

結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,據(jù)2020年的全球癌統(tǒng)計(jì),結(jié)腸癌的發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)在36種癌中均位列第5位,且其發(fā)病率和死亡率均較過去有明顯上升[1]。p53是常見的抑癌基因,其通過靶基因控制包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)以及細(xì)胞代謝等多種生物過程[2-3]。目前,p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因的尋找仍然是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Nutlin是一種特異性靶向MDM2/p53相互作用的小分子抑制劑,通過穩(wěn)定p53從而激活癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡通路,在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常常作為p53的激活劑使用[4]。本研究通過對(duì)Nutlin處理HCT116細(xì)胞得到的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GGT6是p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因。

GGT6是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma glutamyl transferase,GGT)基因家族中的一員,目前針對(duì)其的研究還很少,主要是通過一些組學(xué)、生物信息學(xué)等研究篩選出了GGT6可能在腫瘤等疾病中有作用[5-7]。GGT6相關(guān)的調(diào)控基因鮮有報(bào)道,也沒有其與結(jié)腸癌相關(guān)的研究報(bào)道,因此本研究就GGT6在結(jié)腸癌中的影響進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人胚腎細(xì)胞系HEK-293T、人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HCT8(ATCC細(xì)胞庫)。

1.1.2 主要試劑:Nutlin-3a(Nutlin)(蘭博利德公司),Lipofectamine?2000、Lipofectamine?RNAiMAX(Invitrogen公司),DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(北京細(xì)工生物科技有限公司),BCA蛋白定量試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司),雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒(Promega公司),anti-β-actin (Proteintech公司),anti-p53 (DO-1) (Santa Cruz Biotechnology公司),總RNA提取試劑盒、FastKing RT 第一鏈合成試劑盒(Tiangen公司),SYBR Green PCR Master Mix(ABM公司),siRNA:sip53#1,5′-GCUGUGGGUUGAUUCCACATT-3′; sip53#2, 5′-GCAUCUUAUCCGAGUGGAATT-3′; sip53#3,5′-GCAUCUUAUCCGAGUGGAATT-3′(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理:將細(xì)胞用含10%血清和抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代2～3 d/次,復(fù)蘇細(xì)胞至少傳2代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。藥物處理:10 μmol/L Nutlin處理24 h后收樣,對(duì)照組加入等體積的DMSO;siRNA轉(zhuǎn)染:6孔板每孔使用Lipofectamine?RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑3 μL,對(duì)應(yīng)20 μmol/L siRNA 3 μL,轉(zhuǎn)染48 h后收樣。

1.2.2 RNA-seq的測(cè)序及生物信息學(xué)分析:10 μmol/L Nutlin處理HCT116細(xì)胞24 h后收樣(對(duì)照組加入等體積的DMSO,各兩組平行樣本)。提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)質(zhì)檢合格后,由諾禾致源公司完成HiSeq測(cè)序并返回測(cè)序結(jié)果。對(duì)測(cè)序結(jié)果利用R語言DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析,clusterProfiler包進(jìn)行GO、KEGG與GESA富集分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA的水平:用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,取1 μg逆轉(zhuǎn)為cDNA,使用qPCR Mix配制反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以ACTB作為內(nèi)參,以CDKN1A作為p53轉(zhuǎn)錄靶基因的陽性對(duì)照。引物序列為,ACTB:5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′和5′-CTCCTTA ATGTCACGCACGAT-3′; CDKN1A:5′-AGGTGGAC CTGGAGACTCTCAG-3′和5′-TCCTCTTGGAGAAGAT CAGCCG-3;GGT6:5′-ACATCAGAGGCGCTGGTTC-3′和5′-CAGAGCCCAAGCTTCCTGTC-3′。

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá):收樣細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min,離心取上清,BCA進(jìn)行蛋白定量,加入2×蛋白上樣緩沖液后煮沸。蛋白樣品用SDS-PAGE膠電泳,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在5% BSA中封閉,并用對(duì)應(yīng)抗體孵育后進(jìn)行曝光檢測(cè)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系:利用在線網(wǎng)站JASPAR(https://jaspar.genereg.net)預(yù)測(cè)p53在GGT6啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合調(diào)控位點(diǎn)(RE) 并選出評(píng)分較高的。以HEK-293T細(xì)胞的基因組為模板,分別設(shè)計(jì)引物克隆含RE的約200 bp的DNA片段構(gòu)建在pGL3-Basic-vector質(zhì)粒上。HEK-293T細(xì)胞在24孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每孔添加Lipofectamine?2000 0.5 μL,轉(zhuǎn)染Renilla vector (pRL-CMV)質(zhì)粒10 ng,pGL3相關(guān)質(zhì)粒200 ng,pRK5-flag-vector或pRK5-flag-p53質(zhì)粒300 ng。24 h后收樣,按雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 人結(jié)腸癌數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析:在UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫中選擇含453例結(jié)腸癌組織和41例癌旁組織的基因表達(dá)和患者臨床信息的TCGA-COAD數(shù)據(jù)集,其中GGT6的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)用以分析GGT6在結(jié)腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異,利用R語言survival包進(jìn)行生存分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Nutlin處理激活p53信號(hào)通路

從Nutlin (實(shí)驗(yàn)組)和DMSO(對(duì)照組)處理HCT116細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)篩選出了758個(gè)差異基因(|log2FoldChange|>1, padj<0.05),其中214個(gè)基因上調(diào),544個(gè)基因下調(diào)(圖1A,B)。這些差異表達(dá)基因經(jīng)生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)3方面的GO富集分析后,結(jié)果表明經(jīng)Nutlin處理的HCT116細(xì)胞中,細(xì)胞周期、DNA復(fù)制及染色體分離等過程的相關(guān)基因表達(dá)存在差異(圖 1C)。KEGG(圖 1D)和GSEA(圖1E)分析也提示這些差異基因會(huì)富集在上述相關(guān)過程,同時(shí)KEGG分析也表明Nutlin處理后p53信號(hào)通路發(fā)生明顯變化。

A,B.volcano plot(A) and heatmap(B) by differential gene analysis of RNA-seq data in HCT116 cells treated with DMSO or Nutlin; C.GO enrichment analysis; D.KEGG enrichment analysis; E.GSEA analysis.圖1 Nutlin處理HCT116細(xì)胞的差異基因及富集分析Fig 1 Differential gene and enrichment analysis in HCT116 cells treated with Nutlin

2.2 p53正調(diào)控GGT6基因的表達(dá)

在Nutlin處理HCT116細(xì)胞的RNA-seq差異表達(dá)基因的分析數(shù)據(jù)中,GGT6基因表達(dá)明顯上調(diào)(Nutlin vs DMSO,log2FoldChange=4.750618,padj=7.70E-05)。接著選用HCT116和HCT8兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Nutlin處理促進(jìn)p53蛋白表達(dá),同時(shí)GGT6的mRNA表達(dá)升高(其中CDKN1A為已報(bào)道的p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因)(圖 2A～D)。用3對(duì)p53的siRNA敲降p53后,GGT6的mRNA表達(dá)被抑制(圖 3A～D)。

A,B.protein levels of p53(A) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (B)after treatment with 0 or 10 μmol/L Nutlin in HCT116 cells; C,D.protein levels of p53(C) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (D)after treatment with 0 or 10 μmol/L Nutlin in HCT8 cells; *P<0.001 compared with 0 μmol/L Nutlin.圖2 Nutlin處理后p53和GGT6的表達(dá)情況Fig 2 Expression of p53 and GGT6 after Nutlin treatment

A,B.protein levels of p53(A) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (B)after transfection with siRNA of NC or p53 in HCT116 cells; C,D.protein levels of p53(C) and relative mRNA expression levels of GGT6 and CDKN1A (D)after transfection with siRNA of NC or p53 in HCT8 cells; *P<0.01, **P<0.001 compared with NC.圖3 siRNA轉(zhuǎn)染后p53和GGT6的表達(dá)情況Fig 3 Expression of p53 and GGT6 after siRNA transfection

2.3 GGT6是p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因

在JASPAR網(wǎng)站預(yù)測(cè)篩選出了評(píng)分較高的3個(gè)p53蛋白在GGT6啟動(dòng)子區(qū)可能的結(jié)合調(diào)控位點(diǎn)的序列(分別命名為RE1、RE2、RE3,圖 4A)。在雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中僅序列RE1的熒光素水平在p53過表達(dá)后明顯升高(圖 4B)。

A.schematic representation of human GGT6 gene with three potential p53 response elements (RE1, RE2 and RE3); B.dual luciferase reporter experiment for RE1, RE2, RE3 and CDKN1A-RE(positive control); *P<0.001 compared with pRK5-flag-vector.圖4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p53對(duì)GGT6啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合Fig 4 The binding of p53 to the GGT6 promoter region detected by dual luciferase assay

2.4 GGT6在結(jié)腸癌中的表達(dá)與患者的預(yù)后分析

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中453例結(jié)腸癌組織與41例癌旁組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)分析顯示,GGT6在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著低于癌旁(圖 5A)。在41對(duì)配對(duì)的結(jié)腸癌與癌旁組織中,GGT6在結(jié)腸癌組織中表達(dá)也較低(圖 5B)。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中有總體生存數(shù)據(jù)的430例結(jié)腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行總生存期(OS)分析,表明GGT6高表達(dá)患者的總體生存時(shí)間較GGT6低表達(dá)患者更長(zhǎng)。

A.expression of GGT6 in 453 COAD tissues and 41 normal tissues from TCGA database; B.expression of GGT6 in 41 pairs of COAD and adjacent normal tissues from TCGA database; C.Kaplan-Meier survival curve comparing the overall survival(OS) for different GGT6 expression subtypes in COAD patients from TCGA database; *P<0.001 compared with normal tissues; N.normal; T.tumor.圖5 GGT6在結(jié)腸癌中的表達(dá)與患者的預(yù)后分析Fig 5 The expression of GGT6 and the prognosis of patients in COAD

3 討論

p53作為眾所周知的腫瘤抑制基因以多種方式抑制腫瘤的生長(zhǎng),其主要作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生命活動(dòng)以及代謝過程相關(guān)的基因[3,8]。盡管在基于p53的腫瘤治療方面不斷取得進(jìn)展,但仍存在許多挑戰(zhàn),尋找最終能夠進(jìn)入臨床的高效和選擇性藥物的工作仍在進(jìn)行中[9]。不管是其轉(zhuǎn)錄靶基因還是涉及癌的相關(guān)研究,都一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。本研究揭示了p53在轉(zhuǎn)錄調(diào)控GGT6中的作用,為p53的靶向調(diào)控提供了一個(gè)潛在的研究方向。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)在谷胱甘肽合成中占有重要地位,其在氧化應(yīng)激中的作用已得到充分研究,證據(jù)表明GGT失調(diào)產(chǎn)生的活性氧促進(jìn)腫瘤進(jìn)程,在不同濃度下,其在腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和生存中發(fā)揮著重要作用[10]。雖然GGT6屬于GGT基因家族,但據(jù)報(bào)道此家族中僅GGT1和GGT5被證明能表達(dá)具有酶活性的蛋白,以GGT6作為主要研究對(duì)象的文獻(xiàn)還少有發(fā)表[11]。本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌相關(guān)組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,與正常結(jié)腸組織相比,GGT6在結(jié)腸癌中的表達(dá)降低且GGT6高表達(dá)患者的總體生存時(shí)間較GGT6低表達(dá)患者更長(zhǎng),據(jù)此推斷GGT6可能是結(jié)腸癌的一個(gè)抑癌基因,為今后結(jié)腸癌治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。