董豆,朱琳,王堅,沈偉生,殷華芳,顧一航,殷泉忠,沈衛(wèi)東

(1.南通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,江蘇 南通 226000; 2.南通大學(xué) 附屬江陰醫(yī)院,江蘇 江陰 214400)

放射治療是盆腔惡性腫瘤不可或缺的治療手段,射線對腫瘤起殺傷作用的同時也可能會引起腫瘤周圍危及器官的放射性損傷,其中以放射性腸炎(radiation enteritis,RE)較為常見[1]?；颊叱３霈F(xiàn)腹痛、大便次數(shù)增多、便血、惡心嘔吐等不適,遷延不愈者可能進(jìn)一步引起消化道大出血、穿孔、梗阻、腸瘺等嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。目前針對RE的臨床治療主要以保守對癥、腸道營養(yǎng)治療為主,必要時行手術(shù)、內(nèi)鏡治療?？傮w療效并不十分理想,無有效預(yù)防和治愈的措施。由于中藥療法本身有著藥物副作用較小、并發(fā)癥較少等優(yōu)點,可長期改善病人RE癥狀,減少了病人痛苦[3]。

江蘇省名中醫(yī)沈偉生致力于研究中醫(yī)藥治療放射性肺炎、放化療所致心臟損傷等方面的問題[4-5],在中醫(yī)藥防治放化療毒副反應(yīng)領(lǐng)域取得了豐富成果。沈偉生名中醫(yī)認(rèn)為,盆腔放療引起放射性損傷,其主要病機(jī)為邪熱(火毒)下注、濕熱蘊結(jié)、血熱灼絡(luò)而表現(xiàn)為大便頻數(shù)、腹痛、里急后重、血便、直腸瘺等消化系統(tǒng)癥狀。針對RE基本病機(jī),其自擬清化涼血護(hù)絡(luò)湯應(yīng)用于預(yù)防和治療盆腔惡性腫瘤放療引起的RE,具體方藥如下:黃柏10 g,蒼術(shù)10 g,黃芩10 g,白芍30 g,老鸛草15 g,仙鶴草30 g,紫草30 g,紅景天30 g,地榆10 g,敗醬草15 g,大血藤30 g,馬齒莧15 g。清化涼血護(hù)絡(luò)湯前期在臨床探索中已取得滿意的療效,盆腔放療患者聯(lián)合該藥方治療后RE的發(fā)生率降低,消化道癥狀減輕,患者的生活質(zhì)量有所提高。基于此本實驗通過建立急性RE模型,進(jìn)一步探討清化涼血護(hù)絡(luò)湯對大鼠急性RE的預(yù)防作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年SPF級Wistar大鼠36 只,體重(200±20)g,由常州卡文斯公司提供。

1.1.2 藥物 清化涼血護(hù)絡(luò)湯組方:黃柏、蒼術(shù)、黃芩、白芍、老鸛草、仙鶴草、紫草、地榆、敗醬草、大血藤、馬齒莧。以上中藥均為顆粒劑,由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3 主要試劑及儀器試劑 試劑:蘇木素(Sigma),伊紅(水溶性)、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、中性樹膠(中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)。儀器:Synergy直線加速器(瑞典醫(yī)科達(dá)醫(yī)療器械有限公司),倒置顯微鏡(OLYMPUS)。環(huán)氧合酶-2(COX-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和熱休克蛋白90α(Hsp90α)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物分組及給藥

所有大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、低劑量組及高劑量組,每組9只,隨機(jī)編號稱重。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。根據(jù)人與動物體表面積換算法[6],將自擬清熱涼血組方煎制成湯劑,高劑量組按照0.08 g·ml-1·kg-1的劑量,于建模前7 d開始按照2 次·d-1、1 ml·次-1灌胃給藥,照射后12 h繼續(xù)給予清化涼血護(hù)絡(luò)湯灌胃10 d,低劑量組按高劑量組劑量稀釋4倍進(jìn)行灌胃給藥(方法同上);對照組與模型組大鼠給予相同體積生理鹽水灌胃。建模給藥后第4、7、10 天每組分別隨機(jī)處死3 只大鼠,腹主動脈取血保存血清,取腸組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RE大鼠模型制備

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,禁食禁水12 h后稱重。采用10%水合氯醛麻醉,麻醉后以仰臥體位將其四肢固定于特制照射板上,采用6 MV直線加速器對大鼠進(jìn)行腹部X線照射,照射自恥骨聯(lián)合至肛門,照射野面積2 cm×5 cm,其余部位用5 cm厚鉛板遮擋,100 cm源皮距,行單次照射600 cGy·min-1,總體照射劑量17.5 Gy,建立大鼠急性RE模型。照射后大鼠出現(xiàn)攝食、飲水量減少,體重下降,精神萎靡,蜷縮少動、稀便及血便,表明造模成功[7]。

1.4 一般情況觀察

觀察并記錄各組大鼠每日的攝食攝水及體重。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]擬定對建模后第4、7、10 天大鼠一般情況的評分標(biāo)準(zhǔn),見表1。

表1 大鼠一般情況評分

1.5 HE染色觀察回腸及直腸黏膜病理變化

(1) 回腸:取照射部位回腸2 cm左右,用甲醛固定,固定后用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血液,包埋、切片、染色。顯微鏡下觀察組織學(xué)變化,計數(shù)各組小腸絨毛隱窩細(xì)胞數(shù)、隱窩深度、絨毛長度及單位面積的腸腺,并計算建模后腸腺存活率,腸腺存活率=照射腸片上腸腺絨毛比/正常腸片上腸腺絨毛比×100%[10]。(2) 直腸:將10%甲醛固定好的2 cm直腸上段乙醇脫水,浸蠟包埋,HE染色,參照Hovdenak評分標(biāo)準(zhǔn)[11],光鏡下觀察黏膜上皮表面、腺體、固有層結(jié)構(gòu),根據(jù)其特征進(jìn)行評估,最低分為0分, 最高分為12分, 分值越高代表黏膜病理改變越嚴(yán)重。

1.6 ELISA檢測大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α含量

于建模給藥后第4、7、10 天對照組、模型組、高劑量組分別隨機(jī)處死3 只大鼠,腹主動脈取血保存血清,采用COX-2、TNF-α、IL-6和Hsp90αELISA檢測試劑盒,嚴(yán)格按照說明書操作,在酶標(biāo)儀上檢測并分析其含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠攝食、攝水和體重觀察結(jié)果

高劑量組、低劑量組及模型組建模后5 d攝食和攝水均小幅度下降,第6 天開始逐漸恢復(fù);且各組大鼠各時間段體重?zé)o明顯變化。見圖1。

圖1 建模后各組大鼠攝食攝水及體重變化

2.2 建模后第4、7、10天各組大鼠一般征象評分結(jié)果

低劑量組及高劑量組各時間段評分均顯著低于模型組,且高劑量組評分更低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2。提示清化涼血護(hù)絡(luò)湯可控制炎癥滲出,有效改善大鼠腹瀉及黏液等癥狀,且高劑量改善效果更為顯著。

表2 建模后第4、7、10 天各組一般征象評分 分

2.3 回腸HE染色結(jié)果

2.3.1 回腸腸腺存活率 建模后高劑量組、低劑量組及模型組回腸腸腺存活率較對照組顯著下降(P<0.01);低劑量組顯著高于模型組,高劑量組較低劑量組更能有效提高腸腺存活率,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 建模后第4、7、10天各組回腸腸腺存活率的變化 %

2.3.2 回腸絨毛高度及隱窩深度 對照組小腸絨毛上皮細(xì)胞形態(tài)正常,排列有序,腺體豐富;模型組絨毛變短、稀疏,上皮不完整,上皮細(xì)胞脫落,腺體裸露,隱窩深度降低,炎癥細(xì)胞浸潤;低劑量組可見絨毛及隱窩深度有較輕程度的病理損害,高劑量組僅有輕微黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落,見圖2。建模給藥第10天低劑量組及高劑量組絨毛高度、隱窩深度均高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見表4。說明清化涼血護(hù)絡(luò)湯能提高腸組織絨毛高度及隱窩深度,對大鼠腸道黏膜損傷具有顯著防治作用,且作用強度與藥物濃度有相關(guān)性。

黑色箭頭為絨毛高度,白色箭頭為隱窩深度圖2 各組大鼠回腸絨毛高度及隱窩深度(HE染色 主圖×200,右上角小圖×40)

表4 照射后第4、7、10 天各組絨毛高度和隱窩深度的變化 μm

2.4 直腸病理變化及Hovdenak評分

光鏡下觀察直腸黏膜上皮表面、腺體、固有層結(jié)構(gòu)特征,可以看到大量炎癥性浸潤,隱窩細(xì)胞及杯狀細(xì)胞消失,見圖3。采用Hovdenak評分系統(tǒng)量化評分,結(jié)果提示模型組得分較對照組顯著升高;高劑量組、低劑量組相對于模型組而言能顯著降低直腸Hovdenak評分,且高劑量組降低更明顯,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表5。

圓形為炎性浸潤,三角形為隱窩消失,橢圓形為杯狀細(xì)胞消失圖3 各組大鼠直腸變化(HE染色 主圖×200,右上角小圖×40)

表5 照射后第4、7、10天各組直腸Hovdenak評分變化 分

2.5 各組大鼠血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α水平的比較

對照組大鼠腹主動脈血清COX-2、TNF-α、IL-6、Hsp90α水平均低于模型組及高劑量組,而高劑量組低于模型組,組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖4。

3 討 論

腹盆腔腫瘤在放射性治療時,常會對腸道等鄰近非腫瘤組織造成損傷,且這些損傷往往是不可避免的,從而導(dǎo)致RE等嚴(yán)重并發(fā)癥[12]。RE的發(fā)生與照射劑量、照射方式、是否聯(lián)合化療、是否有合并癥等密切相關(guān),如患者合并高血壓、糖尿病、慢性炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病時,往往會增加放療腸道毒性[1]。臨床主要表現(xiàn)為惡心嘔吐、腹痛腹瀉、便血等,長期甚至可出現(xiàn)梗阻、膿腫、穿孔、瘺管等并發(fā)癥[13]。目前主要結(jié)合臨床表現(xiàn)、病史,通過CT腸造影術(shù)或磁共振的橫斷面成像及內(nèi)鏡等輔助檢查來確診;治療策略主要是緩解癥狀和處理新出現(xiàn)的并發(fā)癥。臨床缺乏系統(tǒng)、標(biāo)準(zhǔn)化的診治方案[14]。

中醫(yī)上將RE歸屬于“泄瀉”“便血”等范疇,類似腸風(fēng)、臟毒等病。其病因為原發(fā)惡性腫瘤疾病的致病根本,即正氣虛虧、臟腑失調(diào),加之放射線照射,外感熱毒,引動內(nèi)生癌毒、邪熱入血,虛實夾雜,痰濕淤毒阻塞腸腑,導(dǎo)致本病[3,15]。針對RE基本病機(jī),沈偉生名中醫(yī)自擬清化涼血護(hù)絡(luò)湯應(yīng)用于臨床,方中白芍養(yǎng)血緩急柔腸、增加應(yīng)激能力為君藥;黃柏、蒼術(shù)化濁、清下焦?jié)駸釣槌妓?紫草、紅景天、地榆、仙鶴草具涼血通絡(luò)、護(hù)絡(luò)收斂、防血溢之效,且紅景天經(jīng)現(xiàn)代藥理研究具有提高放射閾的作用,共為佐藥;敗醬草、老鸛草、大血藤、馬齒莧善清下焦熱毒、防瀉痢共為使藥。

RE的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確,大多學(xué)者認(rèn)為快速分裂的腸上皮,特別是對輻射高度敏感的隱窩干細(xì)胞,直接暴露于輻射產(chǎn)生了的細(xì)胞毒性效應(yīng),導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡、腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生損害;過程中產(chǎn)生的活性氧、激活促炎細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子,如COX-2、TNF-α、IL-6等,招募免疫細(xì)胞,造成炎癥風(fēng)暴[16-18],從而導(dǎo)致了RE的發(fā)生。NO作為重要的炎癥介質(zhì)及氧自由基,在RE的發(fā)生發(fā)展中也擔(dān)任了不可或缺的角色。電離輻射后,NO合酶活性增強,從而誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO,通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抑制cAMP生成、過氧化等作用導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝受損,DNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)合成障礙[19-20]。Hsp90α在非應(yīng)激狀態(tài)下占細(xì)胞蛋白質(zhì)的1%～2%,在應(yīng)激狀態(tài)下高達(dá)4%～6%[21],同時正向調(diào)節(jié)NO的合成[22],可參與炎癥、細(xì)胞凋亡等過程,造成腸組織損傷。最近研究表明供應(yīng)腸道的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、腸道菌群改變也可能是RE產(chǎn)生的原因[23]。

本實驗采用電離輻射大鼠腹部模擬急性RE,模型組大鼠出現(xiàn)攝食、飲水量減少及體重下降等癥狀,鏡下可見腸絨毛厚度及隱窩深度變淺,伴水腫和炎癥細(xì)胞浸潤,少量絨毛上皮細(xì)胞脫落及凋亡,血清中COX-2、TNF-α、IL-6等含量增加,提示急性RE大鼠模型構(gòu)建成功。通過記錄大鼠每日糞便形態(tài)、肛周皮毛及精神狀態(tài),電鏡下觀察腸黏膜改變包括腸腺存活率、絨毛高度、隱窩深度,測定大鼠腹主動脈血清中炎癥因子含量來探討清化涼血護(hù)絡(luò)湯預(yù)防大鼠RE的療效及其可能機(jī)制。結(jié)果顯示,清化涼血護(hù)絡(luò)湯能有效預(yù)防大鼠急性RE,顯著改善大鼠腹瀉、精神萎靡等癥狀,較好地維持大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)及功能完整性,且其效果與給藥濃度有關(guān),藥物濃度高對腸黏膜保護(hù)作用更強。清化涼血護(hù)絡(luò)湯可以降低COX-2、TNF-α、IL-6、NO、Hsp90α等炎癥因子及介質(zhì),進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng),減少上皮細(xì)胞凋亡,維持細(xì)胞間緊密完整性,穩(wěn)定腸黏膜機(jī)械屏障,這些可能是其預(yù)防RE的機(jī)制所在。本研究結(jié)果可為清化涼血護(hù)絡(luò)湯應(yīng)用于RE的臨床預(yù)防及治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。