關(guān)英，隆玉萍，翟志英

西寧市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西寧 810003

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。多數(shù)NSCLC 患者確診時已為局部晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，其總體預(yù)后較差。NSCLC 患者采取手術(shù)切除或根治性放療后具有相對良好的長期預(yù)后[1]。早診早治是提高NSCLC 患者生存率和改善預(yù)后的關(guān)鍵。研究表明，CT 篩查周期差異大、假陽性率高且效益成本比低，血清腫瘤標(biāo)志物被認(rèn)為是早期診斷NSCLC 的有效手段[2]。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是廣譜血清腫瘤標(biāo)志物，參與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過程，其表達(dá)水平可反映病變程度，可作為有前景的腫瘤標(biāo)志物用于NSCLC 的診斷及病情評估，具有較好的特異度，但其診斷準(zhǔn)確度及靈敏度均較低，漏診率和誤診率均較高[3-4]。新興的生物標(biāo)志物檢測在NSCLC 的篩查中具有一定的潛力。微小RNA（microRNA，miRNA）可作為信使在細(xì)胞間傳遞信息并參與腫瘤發(fā)展，可能是多種疾病非侵入性、敏感的潛在診斷標(biāo)志物，特別是在惡性腫瘤領(lǐng)域[5-6]。miRNA-150是一種重要的造血細(xì)胞特異性miRNA，主要在B細(xì)胞、T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中表達(dá)，在某些造血細(xì)胞系的分化過程中起著重要作用，特別是在淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程中。研究表明，miRNA-150 在不同實體瘤中可作為致癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[7-8]。本研究探討NSCLC 患者的血漿miRNA-150水平與臨床特征和血清CEA 水平的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年5月至2022年5月西寧市第一人民醫(yī)院收治的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為NSCLC；②接受手術(shù)切除治療；③年齡≥18歲；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、腎、肺等重要臟器功能不全；②合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入96 例NSCLC 患者作為NSCLC 組，其中，男57 例，女39 例；年齡27～76 歲，平均（65.23±11.32）歲。另選取同期西寧市第一人民醫(yī)院收治的肺部良性疾病患者80 例作為對照組，其中男42 例，女38 例；年齡31～75 歲，平均（64.86±10.38）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集 分別收集兩組患者的肘靜脈血5 ml，分為兩份，分別置于枸櫞酸鈉抗凝管和未加抗凝劑的試管中。枸櫞酸鈉抗凝管中的樣本3000 r/min 離心10 min，留取血漿，于-80 ℃冰箱中保存。未加抗凝劑的試管，室溫靜置1 h，3500 r/min離心10 min，留取血清。

1.2.2 血漿miRNA-150 水平檢測 檢測時解凍血漿，按照德國Qiagen 公司的miRNeasy 試劑盒說明書提取血漿總RNA，使用UV-2800 紫外分光光度儀測定其濃度及純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），再進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。PCR 反應(yīng)體系：SYBR 熒光染料混合液12.5 μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μl，上游引物和下游引物各1.5 μl，ROX 校正染料Ⅱ0.05 μl，無RNA 酶水6.95 μl。PCR 條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算miRNA-150 的相對表達(dá)量。miRNA-150 正向引物5'-GGGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6正向引物5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。重復(fù)測量3 次，取平均值。

1.2.3 血清CEA 水平檢測 取血清，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清CEA 水平，試劑盒購自北京華科泰生物技術(shù)有限公司，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。CEA 正常參考值：﹤5 μg/L。

1.3 觀察指標(biāo)

比較NSCLC組和對照組患者的血漿miRNA-150和血清CEA 水平。比較不同臨床特征NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平。分析NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平與血清CEA 水平的相關(guān)性。分析miRNA-150、CEA 單獨及聯(lián)合檢測對NSCLC 的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平與血清CEA 水平的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miRNA-150、CEA 單獨及聯(lián)合檢測對NSCLC 的診斷效能，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿miRNA-150 和血清CEA 水平的比較

NSCLC 組患者的血漿miRNA-150 和血清CEA水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 兩組患者血漿miRNA-150 和血清CEA 水平的比較

表1 兩組患者血漿miRNA-150 和血清CEA 水平的比較

?

2.2 不同臨床特征NSCLC 患者血漿miRNA-150水平的比較

不同性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平的比較

2.3 血漿miRNA-150水平與血清CEA水平的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平與血清CEA 水平呈正相關(guān)（r=0.726，P=0.016）。

2.4 miRNA-150、CEA單獨及聯(lián)合檢測對NSCLC的診斷效能

miRNA-150、CEA聯(lián)合檢測診斷NSCLC 的AUC、靈敏度及特異度分別為0.986、93.1%、100%，均高于miRNA-150、CEA 單獨檢測。（表3）

表3 miRNA-150、CEA 單獨及聯(lián)合檢測對NSCLC 的診斷效能

3 討論

NSCLC 是一種實體瘤，由于早期缺乏特異性癥狀，常在晚期確診，導(dǎo)致手術(shù)治療機會較少。探索早期診斷及治療NSCLC 的有效方式，是延長患者生存期、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物檢測具有經(jīng)濟、有效、簡便及可重復(fù)性高等特點，但存在靈敏度低或特異度不足等問題，不能有效用于NSCLC 的早期診斷。

miRNA 是一種長度約22 個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶標(biāo)mRNA 的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）序列特異性結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA 參與調(diào)控多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。每一個miRNA都能靶向調(diào)控數(shù)百個mRNA，其表達(dá)水平的任何變化都可能對生物過程產(chǎn)生重大影響，導(dǎo)致病理生理改變。通過對各種人類惡性腫瘤和217 種哺乳動物的miRNA 進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)miRNA 譜具有驚人的信息量，反映了腫瘤的發(fā)展譜系和分化狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境通過細(xì)胞外泌體高度參與腫瘤細(xì)胞的代謝重組，促進營養(yǎng)物質(zhì)的完全利用，有利于脂質(zhì)和谷氨酰胺的氧化磷酸化，損害了糖酵解，從而使微環(huán)境從正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤有利狀態(tài)，為腫瘤生長、侵襲和耐藥提供了條件。越來越多的證據(jù)表明，外泌體miRNA 對改變肺癌微環(huán)境具有至關(guān)重要的作用，可能在NSCLC 細(xì)胞的免疫逃逸、化療藥物耐藥和生物學(xué)功能等方面發(fā)揮作用[9]。因此，miRNA 有可能作為一種有前景的非侵入性生物標(biāo)志物和潛在靶標(biāo)應(yīng)用于NSCLC 的診斷和治療。研究表明，miRNA-148a 通過靶向WNT1 抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，并且miRNA-148a 低表達(dá)與NSCLC 的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和腫瘤相關(guān)死亡風(fēng)險密切相關(guān)[10]。miRNA-4286 能夠通過靶向核輸出蛋白1 調(diào)節(jié)凋亡通路，從而降低NSCLC 細(xì)胞對順鉑的敏感性[11]。miRNA-300 可通過下調(diào)E26轉(zhuǎn)錄因子1（E26 transformation specific 1，ETS1）的表達(dá)抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而抑制NSCLC 的進展[12]。

miRNA-150 位于人類染色體19q13 上，其異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究表明，miRNA-150 在多種惡性腫瘤中具有促癌作用，miRNA-150 可通過與叉頭框蛋白O4（forkhead box O4，F(xiàn)OXO4）mRNA 的3'-UTR 結(jié)合，誘導(dǎo)FOXO4轉(zhuǎn)錄阻滯，促進宮頸癌細(xì)胞生存和細(xì)胞周期進展[6]。miRNA-150 以腫瘤融合抑制因子（suppressor of fused homolog，SUFU）為靶點，通過Hedgehog 和WNT 信號的雙重激活，促進胃癌細(xì)胞增殖、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。另有研究表明，miRNA-150 可能作為抑癌基因，通過下調(diào)黏蛋白4（mucin 4，MUC4）的表達(dá)阻斷人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）及其下游黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinas，ERK）信號通路，從而抑制胰腺癌細(xì)胞生長及惡性行為特性[13]。因此，miRNA-150 作為癌基因還是抑癌基因取決于腫瘤類型。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組患者的血漿miRNA-150 水平明顯高于對照組，說明miRNA-150 在NSCLC 患者的血漿中呈高表達(dá)，可能在NSCLC 中發(fā)揮致癌基因的作用。本研究分析血漿miRNA-150 水平與NSCLC 患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05），與既往研究報道的結(jié)果一致[14]。說明NSCLC 患者血漿miRNA-150 水平不受臨床特征影響。本研究的Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平與血清CEA水平呈正相關(guān)（P﹤0.05）。ROC 曲線顯示，miRNA-150 診斷NSCLC 的靈敏度、特異度分別為92.3%、90.9%。miRNA 即使在惡劣條件下，如煮沸、非常低或很高的pH 值和長時間儲存時，仍保持高度穩(wěn)定，可以作為穩(wěn)定的檢測指標(biāo)。Salem 等[15]研究顯示，miRNA-150-5p 診斷子宮內(nèi)膜癌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為88.9%、100%、100%、78.9%。本研究中，CEA 診斷NSCLC 的靈敏度和特異度分別為84.6%、71.7%，與miRNA-150 聯(lián)合后靈敏度和特異度均提升，分別達(dá)到93.1%和100%。說明miRNA-150 與CEA 聯(lián)合檢測對NSCLC 的診斷效能較高。但鑒于本研究樣本量有限，且樣本來自同一醫(yī)院，結(jié)果可能存在偏倚，未來需加大樣本量進行多中心研究進一步驗證。

綜上所述，NSCLC 患者的血漿miRNA-150 水平較高，其與患者的臨床特征無關(guān)，但與血清CEA水平呈正相關(guān)，與CEA 聯(lián)合檢測可有效診斷NSCLC。